煙草磺基轉移酶NtSOT17基因的克隆及表達分析

摘要：磺基轉移酶（SOT）是一類在動植物和微生物中高度保守的蛋白，能催化磺化反應，在調節植物生長發育和適應逆境等方面起著重要作用。為探究煙草中SOT的功能，采用同源克隆方法從煙草K326中克隆到一個SOT基因，命名為NtSOT17，并對NtSOT17基因進行生物信息學及表達模式分析。結果表明，NtSOT17全長CDS序列為1 076 bp，編碼342個氨基酸，分子量為39.58 ku。亞細胞定位預測結果顯示，NtSOT17定位于細胞質，利用ProtParam、SignalP 5.0、Protscale等網站進行分析，NtSOT17屬于酸性蛋白，具有親水性，無跨膜結構和信號肽。NtSOT17的啟動子區域存在多種光響應元件以及干旱、低溫等參與逆境響應的順式作用元件，RT-qPCR結果顯示，其在脅迫處理后的煙草根、莖、葉中均有表達，其中在根部的表達較高，且在處理24 h時達到最高。以上結果表明NtSOT17是一個具有穩定性的酸性親水蛋白，符合胞質磺基轉移酶特征，能響應干旱、高溫、低溫及高鹽等逆境脅迫。

關鍵詞：煙草；磺基轉移酶；生物信息學分析；基因克??；表達分析

中圖分類號：S572.01""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0031-07

磺基轉移酶（sulfotransferase，SOT或SULT）能催化通用供體PAPS的磺酸基團（—SO3H）轉移至帶羥基或氨基的底物上，同時生成腺苷-3′，5′-二磷酸，這一過程通常被稱為磺化^［1］?；腔磻獛缀醮嬖谟谒械纳矬w中，并且與各種生物過程有關，如細胞間交流、生長發育和逆境脅迫響應。根據在植物細胞中的不同存在形式，可將SOT分為胞質類磺基轉移酶和膜偶聯磺基轉移酶，迄今為止，大多數被鑒定的植物SOT是沒有跨膜區域的細胞質蛋白，胞質類SOT主要通過催化小分子內源物質和外源化合物的磺化，如類固醇、黃酮、硫代葡萄糖苷、激素、生物胺等參與植物生長發育及脅迫響應^［2］。

Rivoal等的研究結果表明，苜?？浦参锿ㄟ^膽堿硫轉移酶催化產生滲透保護劑膽堿-O-硫酸鹽來耐受鹽脅迫^［3］。Cao等在水稻中鑒定了一個新的脅迫響應基因OsSOT9，在經過低溫處理后的孕穗期和花期葉片中表達量上調，且啟動子區域存在12種與脅迫反應相關的順式作用元件，進一步證明了OsSOT9與水稻響應脅迫相關^［4］。在擬南芥已鑒定的SOT家族成員中，AtSOT12對黃酮、油菜素內酯和水楊酸具有活性^［5］，且參與植物對鹽脅迫、滲透脅迫和激素處理的響應^［6］。AtSOT10和AtSOT12能通過磺化油菜素內酯影響植物的生長發育。油菜素內酯在細胞伸長與分裂、維管束分化及葉片形態發生過程中發揮重要的調節作用^［7］，且可以通過促進原形成層細胞的分裂，調節幼芽中維管束的數量^［8］。另外，小分子化合物的磺化可參與調節生長素運輸從而參與植物生長發育^［9］。

迄今為止，在擬南芥、水稻、馬鈴薯等作物中的功能研究顯示，SOT主要通過磺化反應參與植物生長發育和對外界脅迫的響應^［10-11］，而在煙草上的研究未見報道。煙草是我國重要的經濟作物，以收獲葉片為主。在煙葉生長發育過程中，外界逆境脅迫會對其產生不同影響，如高溫導致葉片受損、枯萎，低溫抑制光合作用和葉片生長，干旱導致葉片失水萎縮，產量品質明顯降低。前期，筆者所在課題組在研究煙葉含梗率基因定位時，在定位區間內發現了磺基轉移酶基因，推測可能與葉脈發育相關。為此，本研究擬從煙草品種K326中克隆NtSOT17基因，采用生物信息學方法分析其理化性質，對親/疏水性、保守結構域及蛋白質二級、三級結構進行預測，并進行系統發育分析和啟動子順式作用元件分析，采用RT-qPCR技術對NtSOT17在干旱、高鹽及高溫、低溫脅迫下的表達進行了分析，以期為深入研究和利用該基因改良煙草抗逆性提供依據。

1"材料與方法

1.1"材料與試劑

試驗于2023年在貴州省煙草品質研究重點實驗室進行，供試植物為筆者所在實驗室保存的煙草品種K326。RNAprep純植物試劑盒（TIANGEN，DP432）、FastKing gDNA分離RT SuperMix試劑盒（TIANGEN，KR118）購于天根生化科技（北京）有限公司，DNA凝膠回收試劑盒、pClone007 Versatile Simple Vector Kit克隆試劑盒、感受態細胞 DH5ɑ購于北京擎科生物科技股份有限公司，2×Sq qPCR Mix購于重慶葆光生物技術有限公司，高保真酶購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2"NtSOT17全長CDS序列的克隆

1.2.1"總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成

利用RNAprep純植物試劑盒（TIANGEN，DP432）提取K326葉片RNA，FastKing gDNA分離RT SuperMix試劑盒（TIANGEN，KR118）反轉錄獲得cDNA，用于擴增基因全長CDS序列；同樣的方法分別提取脅迫后K326的根、莖、葉總RNA并反轉錄，用于qPCR分析。

1.2.2"全長CDS序列的克隆

在NCBI網站下載獲取NtSOT17的參考序列（NCBI登錄號107778316），利用在線網站Primer 3（https：//www.primer3plus.com/）設計全長引物（引物信息見表1），引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。以K326 cDNA為模板，利用高保真酶進行PCR擴增，獲得NtSOT17全長序列。PCR反應體系：模板DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，mix 25 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，68 ℃ 12 s，35個循環，68 ℃延伸5 min，最后4 ℃保溫。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后進行膠回收，將得到的純化產物連接到中間載體并采用熱激法將連接產物轉入大腸桿菌感受態細胞DH5ɑ。經 37 ℃ 培養過夜，于37 ℃條件下培養12 h后進行菌斑PCR鑒定，挑選位置、大小正確的陽性菌株送北京擎科生物科技股份有限公司測序。

1.3"生物信息學分析

利用在線網站Expasy-ProtParam計算蛋白長度、分子量和等電點，Expasy-Protscale預測其親、疏水性，NetPhos-3.1網站進行磷酸化位點預測，Psort網站進行蛋白亞細胞定位，SignalP 5.0預測信號肽，DTU/DeepTMHMM 預測跨膜結構，GOR網站預測蛋白質二級結構，Phyre2網站獲取蛋白質三維模型結構，SMART網站預測保守結構域（表2）。在NCBI獲取NtSOT17基因的CDS上游2 000 bp，提交到PlantCare網站進行啟動子的順式作用元件預測。將NtSOT17的氨基酸序列在NCBI中進行BlastP比對，選擇相似度較高的物種并下載其氨基酸序列，運用MEGA 11軟件構建系統進化樹，bootstrap值設置為1 000。

1.4"NtSOT17的表達模式分析

以貴州省煙草品質研究重點實驗室提供的煙草K326品種為試驗材料，播種于煙草育苗專用基質上，采用漂浮育苗方式進行育苗，生長條件為相對濕度75%， 白天（16 h）溫度28 ℃， 晚上（8 h）溫度20 ℃。待幼苗第6葉出現時對其進行脅迫處理，具體措施為鹽脅迫（5%氯化鈉）、干旱脅迫（15% PEG6000）、高溫脅迫（38 ℃）及低溫脅迫（4 ℃），每個脅迫均重復3次，分別在處理0、2、12、24 h采集根、莖、葉，并立即放入-80 ℃的超低溫冰箱中保存。

利用Primer 3.0網站設計NtSOT17及內參基因L25的引物并合成，以干旱、高鹽、高溫和低溫及對照的根、莖、葉組織RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用2×Sq qPCR Mix進行qRT-PCR分析，每個反應進行3個生物重復和技術重復。qPCR體系：cDNA 1 μL，前后引物各0.5 μL，Mix 5 μL，ddH2O 3 μL，反應條件為：94 ℃預變性20 s；94 ℃ 10 s，53.4 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環；最后65～95 ℃制備熔解曲線。反應結束后采用2^-ΔΔCT法計算基因的相對表達量，并利用DPS軟件進行顯著性分析。

2"結果與分析

2.1"NtSOT17基因的克隆

以煙草K326的cDNA為模板擴增NtSOT17的全長CDS序列，獲得1條符合預期大小的目的條帶（圖1）。對北京擎科生物科技股份有限公司反饋的測序結果進行比對，擴增的目的條帶與NCBI獲得的參考序列一致，NtSOT17的CDS序列全長為1 026 bp，編碼342個氨基酸。

2.2"NtSOT17的生物信息學分析

2.2.1"NtSOT17蛋白的理化性質分析

Protparam分析結果顯示（表3），NtSOT17蛋白質的相對分子質量為39.58 ku，理論等電點為5.54，不穩定系數為37.63（Ⅱ），屬于穩定性蛋白。氨基酸共342個，其中絲氨酸占比最多，占比9.1%，負電荷及正電荷殘基分別為47個和40個，總平均親水性系數為 -0.370。采用ProtScale在線工具進一步分析NtSOT17蛋白質的親/疏水性，結果表明，NtSOT17蛋白質的親水性上下限為1.644和-2.178，親水區域多于疏水區域（圖2），表明NtSOT17是一種親水性蛋白質。因此，NtSOT17是一個具有親水性的酸性穩定蛋白質。

2.2.2"NtSOT17蛋白質結構分析

磷酸化位點預測結果表明（圖3-A），NtSOT17蛋白質共有43個磷酸位點，其中絲氨酸28個，蘇氨酸9個，酪氨酸6個，主要被絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸蛋白激酶磷酸化從而參與各種生理生化過程。二級結構預測結果顯示（圖3-B），NtSOT17蛋白有α螺旋、延伸鏈、無規則卷曲3種二級結構，主要的二級結構是無規則卷曲，參與的氨基酸殘基占52.34%，參與α螺旋的氨基酸殘基占33.92%，參與延伸鏈的氨基酸殘基占13.74%，通過Phyre2網站對NtSOT17蛋白質進行三維結構預測，與其他磺基轉移酶蛋白質結構相似（圖3-C）。

2.2.3"NtSOT17蛋白的亞細胞定位、跨膜結構和信號肽預測

蛋白質保守結構域預測結果（圖4）表明， NtSOT17蛋白有1個Sulfotransfer_1結構域位于74～333位氨基酸之間，屬于磺基轉移酶家族蛋白。通過線上工具Psort對NtSOT17蛋白進行亞細胞定位，結果（表4）表明，該蛋白定位在細胞質和細胞核的可能性最大，均為34.8%，其次是線粒體，可能性為26.1%。信號肽和跨膜結構預測結果（圖5）顯示，NtSOT17蛋白質存在信號肽的可能性僅為 0.002 2，不存在跨膜區域，說明NtSOT17蛋白不存在信號肽和跨膜結構，不產生轉運蛋白和膜蛋白，符合胞質磺基轉移酶的特點。

2.2.4"NtSOT17的啟動子順式作用元件分析

對NtSOT17基因的上游2 000 bp進行啟動子順式作用元件鑒定，結果（表5）表明，在煙草NtSOT17基因的啟動子中，除常見的CAAT框和TATA框外，還存在6種參與光響應的元件（BOX-4、G-box、 Gap-box、I-box、TCT-motif、Sp1），以及參與脫落酸響應的元件（ABRE）、茉莉酸甲酯（MeJA）響應元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、低溫響應元件（LTR）、玉米醇溶蛋白代謝調控的元件（02-site）和干旱誘導的MYB結合位點（MBS）。由此可知，煙草NtSOT17基因在植物生長發育中參與了光響應、脫落酸和茉莉酸甲酯響應以及低溫、干旱等外界脅迫響應。

2.2.5"NtSOT17的系統進化分析

將煙草NtSOT17的氨基酸序列在NCBI中進行Blastp比對，選擇辣椒（Capsicum annuum）、番茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza "sativa）并下載其氨基酸序列，利用MEGA 11進行同源性分析并構建系統進化樹，發現NtSOT17與辣椒磺基轉移酶蛋白聚為同一分支（圖6）。

2.3"NtSOT17的表達模式分析

本研究通過qPCR技術檢測了NtSOT17在干旱、鹽脅迫和高溫、低溫下不同組織中的表達量，以了解NtSOT17的響應情況。結果（圖7）表明，在4種脅迫處理下，NtSOT17基因在根、莖、葉中均有不同程度的響應，在莖和葉中的表達量均低于根中的表達量，且干旱、鹽和低溫處理下，NtSOT17在根中表達量隨處理時間延長而上升，于24 h達到最高值，不同處理時間的表達量差異均達到顯著水平。

干旱脅迫下，NtSOT17在根部的表達量于0～2 h 與2～12 h內漲幅不大，而在12～24 h 內漲幅較大。在莖中，NtSOT17的表達量在4個處理時間內差異顯著，處理2 h后表達量顯著上升達到最高，隨后下降，12 h時最低，最高表達量約為最低表達量的6倍。在葉中的表達量隨處理時間延長先下降后上升再下降，12 h時高于對照，且達到最高值，2 h和24 h時最低且低于對照。

高溫處理下，NtSOT17在根中表達量先上升后下降再上升，24 h達到最高，且表達量上升及下降幅度均較大，2 h和24 h時表達量分別為12 h時的3倍左右。在莖中，NtSOT17于處理2 h和12 h時的表達量顯著低于對照，12h時最低，24 h時上升，與對照差異不顯著。在葉片中的表達量同樣于處理 2 h 和12 h時顯著低于對照，24 h時上升但仍低于對照。

低溫下，NtSOT17在根部表達量于處理12～24 h 內大幅上升，且24 h時表達量為4種脅迫處理下最高，說明NtSOT17對低溫響應較高溫、干旱和鹽脅迫更為強烈。在莖中NtSOT17表達量于處理2、12 h顯著低于對照，12 h有上升，24 h最高，與對照差異不顯著。在葉中表達量于2 h和24 h顯著低于對照，24 h達到最低，12 h時高于對照，且不同處理時間內差異顯著。

鹽脅迫下，NtSOT17在根部的表達量于2～12 h顯著上升，在莖中表達量均低于對照，于2 h和24 h達到最低，12 h時有上升但仍低于對照，在葉中表達量也是如此。

由此可知，煙草中NtSOT17可響應干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫，其中在根部表達量隨處理的時間不同有大幅度升高的現象，而在莖和葉中的表達較低。

3"討論與結論

目前，在哺乳動物和植物中都發現了不同數量的SOT。在動物中，細胞SOT可磺化外源物質，增加其水溶性或降低生物活性，從而利于代謝、解毒。植物中SOT已知的功能包括參與蛋白質及輔助因子的合成、抵御生物和非生物脅迫、調節氧化還原平衡、參與種子的發育等^［12］。本研究從普通煙草K326中克隆到一個磺基轉移酶基因，命名為NtSOT17。通過生物信息學分析，NtSOT17蛋白具有Sulfotransfer_1結構域，屬于磺基轉移酶家族成員，且為胞質類磺基轉移酶，進化樹分析結果顯示NtSOT17與辣椒磺基轉移酶親緣關系最近。蛋白質磷酸化可以介導多種生物過程，如植物的發育和對外界脅迫的響應，NtSOT17蛋白中含有多種絲氨酸以及一些蘇氨酸和酪氨酸殘基位點的磷酸化，表明該蛋白通過磷酸化在煙草生長和逆境響應中發揮重要作用。根據蛋白質結構預測結果，NtSOT17蛋白結構主要為無規則卷曲，無規則卷曲可提高對不利情況的耐受性^［13］。植物通過轉錄調節來控制對各種外界脅迫或刺激的響應，而轉錄調節可以通過基因啟動子區域中存在的順式作用元件來調節^［14］。本研究在NtSOT17上游啟動子中發現了不同種類的植物激素和環境脅迫響應的順式作用元件，表明該基因可在煙草的生長和脅迫響應中發揮作用，還發現了多種光響應元件，其中G-Box元件的存在表明光信號可以調節NtSOT17的轉錄，并最終參與煙草防御調節，如類黃酮生物合成途徑^［15］。

正常情況下，SOT在植物體內的表達水平很低或幾乎不表達，逆境脅迫會誘導SOT的表達。歐洲油菜、野甘藍 、白花甘藍SOT的表達水平在水楊酸、乙醇或茉莉酸的誘導下均顯著增強^［16-18］，表明了SOT在逆境響應中的潛在功能。本研究中NtSOT17經過不同脅迫處理，在根中表達量大幅升高，表明SOT在煙草適應逆境中發揮功能。目前，34個水稻SOT家族成員中已鑒定功能的有4個，主要參與調節水稻響應非生物脅迫、抗病防御等過程，有17個在根中高表達^［19-20］。 Chen等通過MPSS數據庫查找分析水稻SOT的表達特性發現，OsSOT1在根、莖及花粉等組織中有高表達，基因表達微陣列數據分析表明，OsSOT1在子房中表達最高，其次為柱頭和根，而在干旱、低溫及鹽脅迫下表達量顯著下降^［21］。分析其原因，根中一般含有較多的油菜素類固醇中間體和較少的活性油菜素內酯^［22］，推測OsSOT1在根中高表達可能與催化24-表油菜素甾酮，調控活性油菜素內酯的合成有關。雷雨婷等將油菜素內酯合成的關鍵基因DET2轉入煙草中，結果顯示轉PtDET2基因植株在模擬干旱及鹽脅迫條件下具有更強的活性氧清除能力，通過保護性酶活性的提高減少了細胞的破壞，提高了抗逆能力^［23］，該研究表明油菜素內酯在植物響應逆境中具有重要作用。因此在不同脅迫下OsSOT1的表達下降可能導致油菜素內酯合成前體物的硫酸化減少，增加了活性油菜素內酯含量，進而提高了植物抗逆性。

NtSOT17基因在干旱、高溫、低溫和鹽脅迫處理下均有響應，且根部表達量明顯高于莖和葉，表明磺基轉移酶參與了煙草對外界脅迫的響應，且主要在根部表達。擬南芥SOT家族成員中，AtSOT8主要在根中表達，且類黃酮參與根中生長素的極性轉運，表明AtSOT8可能通過類黃酮苷的硫酸化作用調控根的生長發育^［24-25］，另一個酪氨酸蛋白質硫酸轉移酶（TPST）基因在整株植物中均有表達，但在根尖分生組織、側根原基和維管組織中特別強^［26］，表明磺基轉移酶可參與植物生長發育。煙草NtSOT17對煙草生長發育的作用還需進一步通過基因編輯等試驗技術深入探究。

本研究克隆了煙草NtSOT17基因，全長 1 026 bp，編碼342個氨基酸。生物信息學預測結果顯示，該蛋白具有Sulfotransfer-1結構域，相對分子質量為39.58 ku，等電點為5.54，與辣椒SOT親緣關系最近，屬于胞質磺基轉移酶，NtSOT17可參與煙草對鹽、干旱及溫度脅迫的響應，但其對生長發育的功能及作用機制需要進一步研究。本研究將為進一步采用基因工程技術深入研究煙草磺基轉移酶的生物學功能及選育高品質煙草品種提供理論支撐。

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