外源一氧化氮對鉻脅迫下煙草生理及鉻積累特性的影響

摘要：為研究外源一氧化氮對鉻脅迫下煙草生理及鉻積累特性的影響，以紅花大金元為材料，采用盆栽試驗，鉻（Cr，90 mg/kg）脅迫下葉面噴施0、15、75、150 mg/L外源一氧化氮供體硝普鈉（SNP），以無脅迫下噴蒸餾水作對照。結果表明，鉻脅迫使煙株生物量顯著降低，煙葉內過氧化氫含量、過氧化物酶活性、抗壞血酸含量、谷胱甘肽含量、植物非蛋白巰基含量、植物螯合肽含量和內源一氧化氮含量顯著下降，煙株根、葉及全株的鉻積累量顯著增加。噴施SNP后，煙株全株生物量和耐受系數在SNP濃度達75 mg/L及以上時較單一鉻處理顯著增加；煙葉超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽還原酶活性、氧化型谷胱甘肽含量及全株鉻積累量和積累系數隨硝普鈉濃度增加呈先降后升趨勢，在 75 mg/L SNP時降低最多；煙葉游離脯氨酸含量、過氧化物酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性和谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值則隨SNP濃度增加而先升后降；煙葉硝酸還原酶、亞硝酸還原酶活性隨SNP濃度增加而逐漸上升，SNP濃度為75 mg/L時內源一氧化氮含量基本回調至對照水平。綜上所述，適當的外源一氧化氮能有效緩解鉻脅迫對煙草的氧化損傷，促進內源一氧化氮產生，抑制煙株內鉻積累，促進煙草生長，其中75 mg/L SNP處理效果較佳。

關鍵詞：鉻脅迫；一氧化氮；煙草；生理；鉻積累

中圖分類號：S572.06""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0105-07

土壤重金屬污染是抑制植物生長、導致作物減產的重要非生物脅迫因子之一^［1］。當土壤中重金屬含量超標時，就會對植物形成重金屬脅迫。重金屬脅迫導致植物遭受滲透脅迫、氧化脅迫、離子毒害和營養虧缺等，影響植物正常生長^［2］。20世紀50年代以來，全球鉻礦業大幅增長，我國作為世界鉻鹽生產和消費大國，產業排放的鉻渣及遺棄場地是造成鉻污染的重要原因。由于Cr（Ⅵ）具有較好的水溶性和遷移性^［3］，導致土壤和地下環境污染區域易擴大。2018年《中國生態環境狀況公報》報道，我國10 000多個國家級地下水監測站點中已有站點Cr（Ⅵ）超標。Cr（Ⅵ） 容易被植物吸收并通過食物鏈轉移到動物和人體，被國際癌癥組織列為第1類人類致癌物，給農作物正常生長發育造成脅迫的同時影響人類健康。添加外源物質提高作物耐性是一個有效便捷的手段^［4］。近年來，科學家發現一氧化氮（nitric oxide，NO）作為一種脂溶性氣體雙原子分子廣泛存在于植物體中^［5］，不僅參與植物多種生理代謝和生長發育過程，而且參與植物逆境脅迫調控，如增強植物抗鹽性^［6］、抗旱性^［7］、抗極端溫度^［8-9］、抗紫外線輻射^［10］和抗病性^［11］等。且NO作為一種氣體信號，相較于其他外源添加物具有“微量高效”的優勢。煙草（Nicotiana tabacum L.）作為世界上廣泛種植的重要經濟作物^［12］，屬于茄科煙草屬，具有生長快、根深、生物質產量高、重金屬積累量大、環境適應能力強等優點，是研究重金屬污染修復的理想備選植物和研究非生物脅迫的模式植物^［13-14］。我國作為世界煙草種植大國，煙草種植量約占世界的32%^［15］。

因此，研究煙草重金屬鉻脅迫及緩解措施對保障煙草產質量安全和人類健康具有重要意義。鑒于此，本研究以硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）作為NO外源供體，采用盆栽土培試驗，研究鉻脅迫下煙草葉面噴施不同濃度硝普鈉對煙草生長、生理及鉻積累的影響，旨在為進一步探究NO緩解煙草鉻脅迫的生理機制及NO緩解植物逆境脅迫的應用提供參考。

1"材料與方法

1.1"試驗材料

煙草品種為紅花大金元，云南宜良煙草公司烤煙漂浮育苗基地提供。聚乙烯塑料花盆規格 34 cm×19 cm×23 cm（上口徑×下底徑×高）。土壤為云南紅壤，參照《土壤農化分析（第3版）》（鮑士旦）測定其農化性質如下：pH值6.51，有機質含量10.40 g/kg、堿解氮含量40.83 mg/kg、速效磷含量50.84 mg/kg、速效鉀含量23.14 mg/kg。土壤總鉻含量45.74 mg/kg，低于GB 15618—2016《土壤環境質量 農用地土壤污染風險管控標準》規定的土壤鉻污染風險篩選值（Cr 200 mg/kg，6.5＜pH值≤7.5）。以重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）作鉻源，硝普鈉（SNP，98.8%）購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2"試驗設計

試驗于2022年4—8月在云南農業大學煙草學院大棚開展。根據筆者所在課題組前期研究，確定K2Cr2O7添加量為90 mg/kg。試驗共設置5個處理：CK（正常生長）、Cr（鉻脅迫）、P1（Cr+15 mg/L SNP）、P2（Cr+75 mg/L SNP）、P3（Cr+150 mg/L SNP），每個處理設9個重復。移栽前1個月將土壤風干過篩裝進花盆（10 kg/盆），澆施重鉻酸鉀水溶液（1 L/盆），充分拌勻。重金屬沉積1個月后，選取苗齡60 d左右生長整齊一致的漂浮壯苗移栽（1 株/盆），移栽時一次性環施煙草專用復合肥（N ∶P2O5 ∶K2O=15 ∶15 ∶18，質量比）45 g/盆，拌施500 g常規花卉營養土。其間的澆水、除草等管理措施保持一致。于移栽后第58天第1次噴施SNP水溶液，間隔3 d后第2次噴施，噴至葉片正反2面均勻飽滿不墜滴，CK和Cr則噴施等量蒸餾水。間隔3 d后取樣進行相關指標的測定。噴施及取樣均在每天10：00前完成。

1.3"測定指標與方法

1.3.1"生理指標

各處理隨機選5株，用打孔器避開主脈取6～8葉位（從下往上數）一定量鮮煙葉置于錫箔紙上液氮速凍，混勻后分裝保存至-80 ℃待測。參照《植物生理生化實驗原理與技術（第3版）》（王學奎，黃見良）方法測定丙二醛、過氧化氫、抗壞血酸、游離脯氨酸含量及超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性。采用蘇州格銳思生物科技有限公司的試劑盒（分光光度法）測定硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷胱甘肽還原酶活性及谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、植物非蛋白巰基、內源一氧化氮含量。植物螯合肽（PCs）含量=植物非蛋白巰基含量-（谷胱甘肽含量+氧化型谷胱甘肽含量）。

1.3.2"煙株生物量和鉻含量

各處理取3株，按根、莖、葉分部位收獲，依次用自來水、0.01 mol/L 的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液和蒸餾水洗凈，吸水紙吸干表面水分，置于烘箱中105 ℃烘干至恒重，測定煙株生物量。隨后磨成粉，過孔徑0.425 mm篩，采用YC/T 380—2010《煙草及煙草制品 鉻、鎳、砷、硒、鎘、鉛的測定 電感耦合等離子體質譜法》測定煙株各部位鉻含量。耐受系數=各處理煙株生物量/對照煙株生物量；Cr積累量=煙株生物量×煙株Cr含量；Cr生物累積系數=某一器官Cr含量（mg/kg）/土壤中Cr含量（mg/kg）。

1.4"數據處理

采用Excel 2016和Origin 2021統計數據并作圖。用SPSS 25.0進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan^，s多重比較，Pearson法進行相關性分析。

2"結果與分析

2.1"外源一氧化氮對鉻脅迫下煙草生物量的影響

由表1可知，鉻脅迫使煙草生物量顯著降低，即煙草根、莖、葉及全株生物量與CK相比分別顯著下降31.87%、12.50%、34.42%和27.26%。噴施硝普鈉后，75、150 mg/L硝普鈉處理下煙莖、葉及全株生物量與耐受系數較Cr處理顯著升高，煙根生物量與Cr處理差異不顯著。

2.2"外源一氧化氮對鉻脅迫下煙葉膜脂過氧化物的影響

由圖1可知，Cr處理下，煙葉丙二醛和游離脯氨酸含量比CK分別顯著升高55.02%和2.89倍，過氧化氫含量比CK顯著降低43.92%。噴施3種濃度硝普鈉后，丙二醛含量比Cr處理依次降低7.41%、6.17%（P1、P2處理）和升高32.17%（P3處理），過氧化氫含量比Cr處理依次升高7.23%、

2.3"外源NO對鉻脅迫下煙葉抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，Cr處理下，煙葉超氧化物歧化酶活性比CK顯著升高1.09倍，過氧化物酶活性比CK顯著降低21.03%。噴施硝普鈉后，超氧化物歧化酶活性隨硝普鈉濃度增加呈先降低后升高趨勢，在75 mg/L硝普鈉處理下比Cr處理顯著降低39.66%；煙葉過氧化物酶活性變化規律與之相反。

2.4"外源一氧化氮對鉻脅迫下煙葉抗壞血酸-谷胱甘肽循環的影響

由圖3可知，相比CK，Cr處理下煙葉抗壞血酸含量、谷胱甘肽含量、谷胱甘肽還原酶活性、谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽、非蛋白巰基含量和植物螯合肽含量分別顯著降低25.88%、28.84%、49.81%、56.7%、29.97%和32.35%，谷胱甘肽過氧化物酶活性和氧化型谷胱甘肽含量分別顯著升高4.53%和64.19%。噴施硝普鈉15～75 mg/L時，煙葉內抗壞血酸含量較Cr處理顯著降低，谷胱甘肽含量則顯著增高。煙葉谷胱甘肽還原酶活性與氧化型谷胱甘肽含量隨硝普鈉濃度增加呈先降后升趨勢。谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值在噴施75 mg/L硝普鈉處理時較單一Cr處理和另外2個硝普鈉處理濃度均略升高。煙葉非蛋白巰基和植物螯合肽含量隨硝普鈉濃度增加呈逐漸降低趨勢。

2.5"外源一氧化氮對鉻脅迫下煙葉內源一氧化氮產生的影響

由圖4可知，Cr處理下煙葉內源一氧化氮含量和硝酸還原酶活性比CK分別顯著降低42.03%和32.53%，亞硝酸還原酶活性與CK差異不顯著。噴施硝普鈉后煙葉內源一氧化氮含量和硝酸還原酶、亞硝酸還原酶活性均隨硝普鈉濃度增加而增加。當硝普鈉濃度為75 mg/L時煙葉內源一氧化氮含量基本回調至CK水平。

2.6"外源一氧化氮對鉻脅迫下煙草鉻積累的影響

由表2可知，煙株各部位鉻積累量和生物積累系數整體表現為根＞葉＞莖。單一鉻處理下， 煙株根、葉及全株的鉻積累量較CK分別顯著增加63.01%、9.09%和33.60%，而莖部鉻積累量較CK顯著降低27.78%；同時，根部和葉部的鉻生物積累系數亦比CK顯著增加，而莖部的鉻生物積累系數比CK顯著降低20.27%，煙株鉻積累量和生物積累系數變化規律具有一致性。噴施硝普鈉后，根部、葉部及全株的鉻積累量與根和葉的鉻積累系數均隨硝普鈉濃度增加呈先下降后升高規律，均在 75 mg/L 硝普鈉處理時下降最多。

2.7"硝普鈉濃度與各指標間的相關性分析

由表3可知，硝普鈉濃度與煙葉丙二醛、過氧化氫、內源一氧化氮含量和硝酸還原酶活性及全株生物量呈極顯著正相關關系，與亞硝酸還原酶活性呈顯著正相關關系。硝普鈉濃度與煙葉中植物螯合肽含量呈極顯著負相關關系，與谷胱甘肽過氧化物酶活性和非蛋白巰基含量呈顯著負相關關系。

2.8"所有指標間的相關性分析

由圖5可知，全株生物量與過氧化物酶活性、過氧化氫含量、抗壞血酸含量、谷胱甘肽含量和植物螯合肽含量呈極顯著正相關關系，而植物螯合肽含量與抗壞血酸含量、過氧化物酶活性和谷胱甘肽含量呈極顯著正相關關系，與丙二醛含量呈極顯著負相關關系。全株鉻積累量與根部和葉部鉻積累量呈極顯著正相關關系，葉部鉻積累量與根部鉻積累量呈極顯著正相關關系。煙葉內源一氧化氮含量與硝酸還原酶活性呈極顯著正相關關系，而硝酸還原酶活性與亞硝酸還原酶活性呈顯著正相關關系。此外，煙葉氧化型谷胱甘肽含量與抗壞血酸含量和過氧化物酶活性呈極顯著負相關關系，全株生物量與超氧化物歧化酶活性、氧化型谷胱甘肽和游離脯氨酸含量呈極顯著負相關關系。

3"討論

煙草通過根系吸收金屬元素并轉移到地上部，鉻積累整體表現為根部＞葉部＞莖部，說明鉻的移動性較低，主要在根部積累，與魯黎明等的研究結果^［16］一致。植物生物量通常用于植物耐性評價。本試驗中，鉻脅迫下煙草生物量降低而噴施硝普鈉濃度達75 mg/L及以上時煙草生物量和煙株耐受系數增加，且硝普鈉濃度與煙株鉻積累量呈負相關，說明一定濃度的外源一氧化氮可降低鉻脅迫對煙草生長的抑制并增強煙草耐鉻性。

植物遭受重金屬脅迫會積累大量活性氧，加快細胞膜脂過氧化過程進而增加細胞中的丙二醛含量，丙二醛會誘導超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗氧化酶活性增強繼而積累大量過氧化氫，同時生成滲透調節物質，使細胞膜結構遭到破壞^［17-19］。本研究鉻脅迫下煙葉中過氧化氫含量和過氧化物酶活性顯著下降，與上述規律有所不同，可能是在幾個月的長時間鉻脅迫下，煙草為維持細胞內氧化還原平衡，適應環境，自身形成了一定的耐性調節機制^［20-21］；噴施硝普鈉150 mg/L時丙二醛和過氧化氫含量比單一鉻處理顯著增加，可能是較高濃度硝普鈉加劇煙葉細胞膜脂過氧化程度的表現，對煙草造成一定的不利影響，這也是選擇硝普鈉適宜應用濃度范圍需考慮的因素。抗壞血酸-谷胱甘肽循環是一個重要的清除活性氧的非酶促途徑^［22］。研究表明，谷胱甘肽在清除活性氧過程中可以通過谷胱甘肽還原酶還原氧化型谷胱甘肽實現循環再生，且在細胞質、葉綠體、線粒體等細胞器中廣泛存在的谷胱甘肽是植物螯合肽合成的直接底物^［23］。本研究中，噴施硝普鈉后煙葉谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量顯著增加，而相關性分析表明，全株及根部的鉻積累與谷胱甘肽含量呈顯著負相關關系，谷胱甘肽含量與植物螯合肽含量呈極顯著正相關關系，植物螯合肽含量又與過氧化物酶活性、抗壞血酸含量呈極顯著正相關關系，由此說明谷胱甘肽及其循環途徑與降低煙草鉻吸收有著密切聯系，可能循環作用越強抑制效果越明顯。另一方面，前人研究表明，煙株鉻積累降低也可能與谷胱甘肽促進鈍化游離金屬離子相關^［24］。硝普鈉濃度與抗壞血酸、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽含量呈正相關關系，說明外源一氧化氮能促進抗壞血酸-谷胱甘肽循環轉化，這與外源褪黑素^［25］、烯效唑^［26］、大麻二酚^［27］可快速激活抗壞血酸-谷胱甘肽循環的作用效果類似。

植物中一氧化氮產生機制至今仍然沒有被徹底闡述清楚，酶促反應途徑中的硝酸還原酶途徑是普遍認可的一條途徑，主要由NADPH/NADP作為電子供體催化硝酸鹽和亞硝酸鹽的單電子還原反應生成一氧化氮。硝普鈉可以與組織內的巰基結合生成亞硝基團，在細胞內代謝產生一氧化氮^［28］。本研究中，鉻脅迫下煙葉內一氧化氮含量顯著降低，與柯學等研究鹽脅迫能誘發煙草內源一氧化氮生成^［29］相反，可能與該試驗是盆栽試驗，設置鉻脅迫濃度較高有關；噴施硝普鈉后煙葉內源一氧化氮隨硝普鈉濃度增加而增加，與王逸筠等研究外源一氧化氮緩解番茄鎘脅迫的結果^［30］類似。煙葉內源一氧化氮的產生及代謝需要多種酶及非酶物質的參與，可以確定的是外源一氧化氮的添加促進了內源一氧化氮的改變，而內源一氧化氮含量與抗壞血酸含量和過氧化物酶活性顯著正相關，這二者物質又受其他多種物質調控。因此，一氧化氮的調節功能是復雜的，一氧化氮究竟是如何影響氧化還原平衡及各種物質間的調節轉化，其內在關系及關鍵機制在之后的研究中有待進一步探究。

4"結論

綜上，適當外源一氧化氮能有效緩解鉻脅迫對煙草的氧化損傷，促進內源一氧化氮產生，抑制煙株內鉻積累，促進煙草生長。該試驗條件下，75 mg/L 硝普鈉處理對緩解煙草鉻脅迫和降低煙株鉻積累效果較為明顯。

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