揚輻粳系列水稻新品系稻瘟病抗性基因與穗頸瘟抗性分析

摘要：為加快揚輻粳系列水稻品種的稻瘟病抗性改良，對275份水稻新品系進行穗頸瘟抗性鑒定，利用分子標記檢測了稻瘟病抗性基因Pi2、Pi5、Pia、Pik、Pigm和Pita在試驗材料中的分布，并分析了抗性基因分布與穗頸瘟抗性的關系。結果顯示，揚輻粳系列水稻新品系中這6個基因出現的頻率分別為27.3%、10.5%、33.5%、4.7%、36.7%、23.3%，其中Pigm出現頻率最高，在揚輻粳系列新品系中被重點選擇利用。大部分品系攜帶的稻瘟病抗性基因數量為1個或2個，沒有攜帶5個及以上數量抗性基因的品系，利用線性回歸分析發現水稻穗頸瘟抗性強弱與攜帶的抗病基因數量之間不存在線性相關關系。僅攜帶Pi2或Pigm單個基因的品系穗頸瘟病級顯著低于不攜帶任何檢測基因的品系。邏輯回歸分析結果表明，Pi2、Pik和Pigm可以通過與其他抗性基因的相互作用提高水稻的稻瘟病抗性。本研究結果可為揚輻粳系列水稻新品種的選育提供理論指導，也可為江蘇省抗稻瘟病粳稻新品種的選育提供參考。

關鍵詞：揚輻粳；穗頸瘟；抗性基因；抗病育種

中圖分類號：S435.111.4⁺1""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0128-05

稻瘟病是一種由稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）引起的世界性真菌病害，一般發生時造成水稻減產10%～20%，嚴重發生時造成減產40%～50%，甚至顆粒無收。從2008年開始，我國的水稻新品種審定對稻瘟病抗性實行“一票否決”制，但是近幾年我國稻瘟病發生面積仍在375萬hm²左右^［1］。在農業生產上，一般通過種植抗性品種結合噴施殺菌劑來控制稻瘟病發生，但是農藥防治不僅增加水稻種植成本，而且會造成環境污染、危害人類身體健康。因此，培育抗病品種是防治稻瘟病最經濟、有效的措施。

迄今為止，已報道的稻瘟病抗性基因有140多個。除第3染色體外，其他水稻染色體上都有這些基因成簇分布，其中第6、11、12染色體上分布的抗性基因數量最多^［2］。目前已克隆的稻瘟病抗性基因有30多個，其中部分基因位于同一基因座上，如Pi2、Pi9、Pi50、Pigm、Piz、Piz-t同為Piz位點上的復等位基因^［3］；Pi1、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p同為Pik位點上的復等位基因^［4］；Pid3與Pi25等位；Pia與PiCO39等位^［5-6］。這些基因的抗病特異性存在差異，一些在特定生態區具有廣譜持久抗性的抗稻瘟病基因已被廣泛用于抗稻瘟病水稻品種的選育^［7］。王軍等發現對江蘇稻瘟病病菌表現廣譜抗性的基因有Pita、Pib、Pi54和Pikm^［8］。閆影等研究表明，長三角地區攜帶Pita、Pi5、Pi2和Pikm基因的粳稻種質稻瘟病抗性較好^［9］。王小秋等研究了江蘇育成粳稻品種穗頸瘟抗性與稻瘟病抗性基因之間的關系，發現Pia、Pi5和Pita能夠顯著提高水稻對穗頸瘟的抗性，Pigm及基因組合Pia+Pita育種利用價值較高^［10］。目前，創造綜合性狀優良的水稻抗稻瘟病核心種質，篩選和利用廣譜持久的抗病基因組合，是水稻抗稻瘟病育種的重要方向^［11］。

隨著稻瘟病抗性基因的發掘和利用，水稻抗稻瘟病育種進程不斷加快，我國每年審定的水稻品種中抗病品種比例持續增加。為更好地開展揚輻粳系列水稻新品種的稻瘟病抗性改良工作，本研究對275份揚輻粳系列水稻新品系進行了穗頸瘟抗性鑒定，并利用分子標記檢測了Pi2、Pi5、Pia、Pik、Pigm和Pita等6個稻瘟病抗性基因在試驗材料中的分布。

1"材料與方法

1.1"試驗材料和接種菌株

試驗材料為筆者所在課題組新近育成的275份揚輻粳系列水稻新品系，2023年種植在位于江蘇省揚州市生態科技新城的江蘇里下河地區農業科學研究所萬福試驗基地，5月15日播種，6月14日栽秧，常規水肥管理，稻瘟病病菌接種時間為各個品系的孕穗期。穗頸瘟抗性鑒定使用的菌株由江蘇省農業科學院植物保護研究所提供，為2023年分離得到的江蘇省稻瘟病病菌代表菌株的孢子混合液。

1.2"穗頸瘟人工接種鑒定

在水稻孕穗初期采用混合菌株進行接種，用注射器將接種液注入稻苞內，每穗注射1 mL孢子懸浮液，每個品系接種8個稻穗^［12］。根據供試材料的生育期差異分期接種。接種后于水稻蠟熟期，按農業農村部發布的《水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術規程》（NY/T 2646—2014）進行病情調查，分級標準為：0級，無病；1級，小枝梗發病，每穗損失率≤5.0%；3級，主軸或穂頸發病，每穗損失率為5.1%～20.0%；5級，主軸或穂頸發病，谷粒半癟，每穗損失率為20.1%～50.0%；7級，穂頸發病，大部分癟谷，每穗損失率為50.1%～70.0%；9級，穂頸發病，每穗損失率gt;70.0%。

1.3"分子標記檢測

本研究檢測的6個稻瘟病抗性基因為Pi2、Pi5、Pia、Pik、Pigm和Pita。在水稻分蘗盛期，收集不同水稻品系新鮮葉片，按CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取基因組DNA。由武漢市景肽生物科技有限公司利用基于SNP（單核苷酸多態性）的PARMS（5引物擴增受阻突變體系）技術進行基因型檢測。

1.4"統計分析

采用辦公軟件Excel 2013 對研究中獲得的各類數據進行整理和作圖。方差分析、線性回歸（linear regression）分析和邏輯回歸（logistic regression）分析基于jamovi v2.3（https：//www.jamovi.org）完成。

2"結果與分析

2.1"稻瘟病抗性基因分布

6個稻瘟病抗性基因的分子標記檢測結果顯示，含有Pi2、Pi5、Pia、Pik、Pigm或Pita的品系數量分別為75、29、92、13、101、64，分別占總數的27.3%、10.5%、33.5%、4.7%、36.7%、23.3%（圖1-A）。含有0、1、2、3、4個稻瘟病抗性基因的品系數量分別為47、113、86、27、2個，分別占比17.1%、41.1%、31.3%、9.8%、0.7%，沒有含5或6個抗性基因的品系（圖 1-B，表1）。在所檢測的6個基因中Pigm出現頻率最高，表明該基因在揚輻粳系列新品系中被重點選擇利用。大部分品系攜帶的稻瘟病抗性基因數量為1個或2個，攜帶5個及以上數量抗性基因的品系沒有被選擇。

2.2"穗頸瘟抗性鑒定

275份水稻品系的穗頸瘟抗性人工接種鑒定結果為：病級為1、3、5、7、9的品系數量分別為56、60、32、34、93個，分別占總數的20.4%、21.8%、11.6%、12.4%和33.8%，無病級為0的品系（圖2）。結果顯示，揚輻粳系列新品系的稻瘟病抗性差異較大，表明在育種材料的前期選擇過程中沒有對穗頸瘟抗性進行嚴格篩選。

2.3"稻瘟病抗性基因與穗頸瘟抗性的相關性分析

對試驗品系的抗病基因數量與穗頸瘟病級進行回歸分析，回歸系數r為-0.68，r²為0.46，P值為0.21，表明試驗材料的穗頸瘟抗性強弱與攜帶的抗病基因數量之間不存在顯著的線性相關關系（圖3-A）。有的品系僅攜帶少數幾個基因但卻表現較強的穗頸瘟抗性，有的攜帶抗性基因數較多卻表現出對穗頸瘟高感（表1）。以上結果表明，在水稻的抗稻瘟病育種中應當充分結合表型鑒定與抗病基因檢測，而不能通過簡單地增加抗病基因數量來改良品種抗性。

為分析單個基因對穗頸瘟抗性的貢獻，對攜帶單個基因的品系進行差異分析，結果顯示攜帶Pi2或Pigm基因的品系穗頸瘟病級顯著低于不攜帶任何檢測基因的品系（圖3-B），表明Pi2和Pigm在單基因水平上能夠顯著增強水稻的穗頸瘟抗性。含Pigm的品系病級顯著低于Pi2，說明Pigm對本次所用稻瘟病菌生理小種的抗性作用要好于Pi2。進一步采用多因素有序邏輯回歸方法分析各基因與病級的相關性（表2），結果顯示Pi2、Pik和Pigm均與病級顯著負相關（Plt;0.001），表明Pi2、Pik和Pigm可能通過與其他基因間的互作提高水稻的穗頸瘟抗性。

3"討論與結論

穗頸瘟是稻瘟病中對水稻產量影響最大的類型，最經濟有效的防治方法是種植抗病品種^［13］。傳統抗病育種主要通過抗性鑒定進行表型選擇， 育種周期長而且限制條件多。近年來，越來越多的抗稻瘟病基因被定位或克隆，利用分子標記輔助選擇進行水稻抗病育種已經成為常規手段^［14-16］。然而，稻瘟病生理小種復雜多變，不同地區或不同年份流行的生理小種存在差異，會導致新品種的抗性逐漸喪失^［17］。因此，利用新近流行的稻瘟病病菌生理小種進行水稻品種的抗性鑒定，并解析稻瘟病抗性基因與水稻稻瘟病抗性之間的關系，對稻瘟病抗性品種的選育具有指導作用。

本研究利用江蘇省農業科學院植物保護研究所2023年分離得到的菌株進行揚輻粳系列新品系的穗頸瘟抗性鑒定，對6個稻瘟病抗性基因Pi2、Pi5、Pia、Pik、Pigm和Pita進行了分子標記檢測，并分析了稻瘟病抗性基因和水稻稻瘟病抗性之間的關系。結果發現這6個稻瘟病抗性基因出現頻率分別為27.3%、10.5%、33.5%、4.7%、36.7%、23.3%。其中Pigm出現頻率最高，說明揚輻粳系列新品系在選育過程中對其進行了選擇。Pigm是一個廣譜、持久的稻瘟病抗性基因，來源于我國四川秈稻地方品種谷梅4號^［18］。該基因對不同粳稻地區的大部分優勢稻瘟病菌生理小種具有良好的抗性，在水稻抗稻瘟病育種中得到廣泛應用^［19-23］。本研究發現Pigm對提高水稻穗頸瘟抗性具有極顯著的貢獻，證明了Pigm基因在水稻稻瘟病抗性改良中具有很高的育種利用價值。另外，Pi2也能夠顯著增強水稻稻瘟病抗性，同樣具有較高的育種利用價值。而Pi5、Pia、Pik和Pita單個基因對提高揚輻粳系列新品系穗頸瘟抗性的貢獻不顯著，這可能是由于樣本總數不夠多、稻瘟病菌生理小種或生態環境差異導致的。

本研究試驗材料中，大部分品系攜帶的稻瘟病抗性基因數量為1個或2個，沒有攜帶5個及以上數量抗性基因的品系。進一步分析發現，穗頸瘟抗性與抗病基因數量之間不存在顯著的線性相關關系，與前人的研究結果一致^{［7，10，24］}。通過多因素有序邏輯回歸分析發現，Pi2、Pik和Pigm均與病級極顯著負相關，表明這3個基因可能通過與其他基因的互作提高水稻的穗頸瘟抗性。例如，Pi2+Pia+Pik組合品系的病級低于Pi2+Pia，Pi2+Pia+Pik+Pita組合品系病級低于Pi2+Pia+Pita。然而，由于Pigm、Pi2和Pik相互組合的品系數量缺乏，本研究沒有對不同基因組合的抗性貢獻進行統計分析。

在稻瘟病抗性育種中，聚合主效抗性基因是改良水稻稻瘟病抗性的有效策略^［25］。宛柏杰等對80份骨干親本材料進行接種鑒定和基因型分析，發現高抗的材料都聚合了2個及以上的抗病基因，其中主效抗病基因為Pita或Pigm^［26］。王小秋等研究發現，Pita+Pi5以及Pita+Pia基因組合對增加江蘇粳稻品種的稻瘟病抗性具有顯著作用^［10］。周坤能等發現，Pi5和Pia基因對水稻苗瘟抗性有顯著貢獻，Pi5+Pia基因組合的抗性高于單個基因，Pi5+Pia+Pik基因組合抗性更強^［26］。綜上可知，除了挖掘和利用廣譜持久的單個抗性基因，通過基因聚合也是一種提高水稻品種稻瘟病抗性的重要育種策略。

本研究明確了揚輻粳系列水稻新品系中主要稻瘟病抗性基因的基因型和穗頸瘟抗性，鑒定出穗頸瘟抗性較好的新品系，為揚輻粳系列水稻新品種的選育提供了理論指導。此外，抗性基因和穗頸瘟抗性的相關性分析，有助于鑒別對江蘇省稻瘟病菌生理小種具有高效抗性的基因，為江蘇省抗稻瘟病粳稻新品種的選育提供參考。

參考文獻：

［1］劉"杰，曾"娟，楊清坡，等. 2023年農作物重大病蟲害發生趨勢預報［J］. 中國植保導刊，2023，43（1）：32-35.

［2］劉定富，尹合興，應繼鋒. 中國水稻百年育種的一些關鍵基因［J］. 中國稻米，2022，28（2）：1-11.

［3］Wu Y Y，Chen Y，Pan C H，et al. Development and evaluation of near-isogenic lines with different blast resistance alleles at the Piz locus in japonica rice from the lower region of the Yangtze River，China［J］. Plant Disease，2017，101（7）：1283-1291.

［4］田大剛. 水稻稻瘟病抗性基因座Piz和Pik的探秘之旅［J］. 福建農業科技，2022，53（5）：1-11.

［5］燕孟嬌，賈曉清，郝麗芬，等. 水稻稻瘟病抗病基因挖掘及育種研究進展［J］. 北方農業學報，2021，49（2）：94-103.

［6］Gao P，Li M Y，Wang X Q，et al. Identification of elite R-gene combinations against blast disease in Geng rice varieties［J］. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（4）：3984.

［7］李"剛，袁彩勇，曹奎榮，等. 544份水稻種質稻瘟病抗性鑒定及抗性基因的分布研究［J］. 中國農業大學學報，2018，23（5）：22-28.

［8］王"軍，宮丹妮，楊"杰，等. 江蘇省粳稻品種抗稻瘟病基因型與穗頸瘟抗性分析［J］. 江蘇農業學報，2016，32（2）：250-256.

［9］閆"影，王"凱，周鋒利，等. 長三角地區粳稻種質的稻瘟病抗性基因鑒定及其抗性評價［J］. 核農學報，2022，36（1）：14-23.

［10］王小秋，杜海波，陳夕軍，等. 江蘇近年育成粳稻新品種/系的稻瘟病抗性基因及穗頸瘟抗性分析［J］. 中國水稻科學，2020，34（5）：413-424.

［11］Xiao N，Wu Y Y，Li A H. Strategy for use of rice blast resistance genes in rice molecular breeding［J］. Rice Science，2020，27（4）：263-277.

［12］賀"閩，尹俊杰，馮志明，等. 水稻稻瘟病和紋枯病抗性鑒定方法［J］. 植物學報，2020，55（5）：577-587.

［13］Chen R Z，Deng Y W，Ding Y L，et al. Rice functional genomics：decades^，"efforts and roads ahead［J］. Science China Life Sciences，2022，65（1）：33-92.

［14］李育紅，吳云雨，戴正元，等. 分子標記輔助選擇培育抗稻瘟病雜交秈稻新品種揚兩優316［J］. 揚州大學學報（農業與生命科學版），2018，39（3）：52-57.

［15］王"雨，孫全翌，杜海波，等. 利用抗稻瘟病基因Pigm和抗紋枯病數量性狀基因qSB-9^TQ、qSB-11^HJX改良南粳9108的抗性［J］. 中國水稻科學，2023，37（2）：125-132.

［16］宛柏杰，張夢龍，岳紅亮，等. 分子標記輔助選育抗稻瘟病水稻新品種中科鹽8號［J］. 江蘇農業科學，2022，50（17）：21-26.

［17］許志文. 江蘇稻區稻瘟菌無毒基因分布特征及致病性分析［D］. 揚州：揚州大學，2023：48-50.

［18］Deng Y W，Zhai K R，Xie Z，et al. Epigenetic regulation of antagonistic receptors confers rice blast resistance with yield balance［J］. Science，2017，355（6328）：962-965.

［19］于苗苗，戴正元，潘存紅，等. 廣譜稻瘟病抗性基因Pigm和Pi2的抗譜差異及與Pi1的互作效應［J］. 作物學報，2013，39（11）：1927-1934.

［20］呂學蓮，白海波，惠"建，等. 利用廣譜抗病基因Pigm改良水稻稻瘟病抗性［J］. 分子植物育種，2017，15（11）：4336-4342.

［21］田紅剛，陳紅旗，胡"江，等. 抗稻瘟病基因Pigm導入對寒地粳稻抗病性和產量性狀的影響［J］. 沈陽農業大學學報，2016，47（5）：520-526.

［22］何旎清，楊德衛，鄭向華，等. 利用分子標記輔助選擇Pigm-1基因改良恢復系R20的稻瘟病抗性［J］. 核農學報，2022，36（2）：245-250.

［23］陳宗祥，馮志明，張亞芳，等. 分子標記輔助選擇育成抗稻瘟病粳稻新品種揚農粳3091［J］. 中國稻米，2022，28（6）：107-109.

［24］吳子帥，李"虎，陳傳華，等. 常規秈稻品種的稻瘟病抗性基因及穗頸瘟抗性分析［J］. 華南農業大學學報，2023，44（5）：718-724.

［25］Wu Y Y，Xiao N，Chen Y，et al. Comprehensive evaluation of resistance effects of pyramiding lines with different broad-spectrum resistance genes against Magnaporthe oryzae in rice （Oryza sativa L.）［J］. Rice，2019，12（1）：11.

［26］宛柏杰，劉"凱，趙紹路，等. 水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54在骨干親本中的分布以及對穗頸瘟抗性的作用［J］. 西南農業學報，2020，33（1）：1-6.

［27］周坤能，張彩娟，夏加發，等. 長江中下游地區粳稻稻瘟病基因型與苗瘟抗性分析［J］. 核農學報，2022，36（10）：1920-1928.