茶樹NFU基因家族的鑒定與表達模式分析

摘 要 Nitrogen-fixation-subunit-U蛋白（NFU）作為植物Fe-S簇裝配過程中重要的支架蛋白，在重金屬元素的吸收和富集過程中發(fā)揮了重要作用。以茶樹（Camellia sinensis）品種黃棪為研究材料，采用分子生物學及生物信息學分析方法對茶樹NFU基因家族進行了鑒定，并分析其基本理化性質(zhì)、順式作用元件、系統(tǒng)進化關系和組織特異性表達等，并探究了茶樹NFU基因在鐵、鎘脅迫處理下的表達模式。結(jié)果顯示：從茶樹基因組中共鑒定獲得4個NFU基因，分布在4條不同的染色體上，分別命名為CsNFU-1～CsNFU-4，編碼的蛋白序列長度為214～278 aa，分子量22.6～30.2 kD，等電點5.20～6.31，蛋白序列中包含3個保守的motif基序；系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，茶樹NFU蛋白被劃分為2類，CsNFU-1～CsNFU-3屬于Group I，CsNFU-4單獨屬于Group Ⅱ；啟動子順式元件分析發(fā)現(xiàn)CsNFU家族成員啟動子區(qū)含有多個激素與逆境脅迫響應有關的元件；組織特異性表達分析表明，茶樹CsNFU家族成員主要在茶樹根部和葉片中表達；在Fe3+和Cd2+脅迫處理下，CsNFU基因受到不同程度地誘導表達。

關鍵詞 茶樹；NFU基因；Fe-S；表達水平

中圖分類號：S571.1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.21.001

Fe是較早被發(fā)現(xiàn)的植物生長發(fā)育所必需的重要微量元素之一[1]，不僅能直接影響植物光合作用、電子傳遞等各項生理活動，還能與多種酶類結(jié)合，形成具有活性的鐵蛋白，間接參與到植物生理代謝的各個方面[2-3]。鐵硫蛋白（Iron-sulfur proteins，F(xiàn)e-S蛋白）是一種重要的含鐵蛋白質(zhì)，在植物的呼吸、光合、氨基酸和嘌呤代謝、植物激素合成等過程中發(fā)揮重要作用[4-5]，而Fe-S簇是Fe-S蛋白的關鍵活性部位[6]，植物細胞中Fe-S簇的組裝過程高度復雜，需要多種支架蛋白的參與[7]。

NFU蛋白作為一種重要的支架蛋白，能將供體提供的S和Fe在葉綠體或線粒體等細胞器中完成Fe-S簇的裝配[8]。越來越多的研究也逐漸揭示NFU蛋白在植物的生長發(fā)育和響應逆境脅迫過程中也發(fā)揮了重要的作用[9-10]。近年來，國內(nèi)外對植物NFU分子機制的研究主要集中在擬南芥[11]、水稻[3]、葡萄[12]和大豆[13]等植物中，然而有關茶樹（Camellia sinensis）中的NFU基因的作用機制及其分子基礎依然未知。茶樹作為我國重要的葉用經(jīng)濟作物，用其葉片加工制作而成的各類茶葉，深受消費者的喜愛，然而在其種植土壤中，重金屬元素含量過高會嚴重降低茶葉的品質(zhì)，尤其是對名優(yōu)茶的品質(zhì)影響更甚[14]。本研究以茶樹黃棪為材料，從茶樹基因組中對NFU基因進行篩選、鑒定并進行生物信息學分析，同時探究其在鐵、鎘處理下的表達水平，為進一步研究茶樹NFU基因在響應重金屬元素脅迫過程中的分子機制及功能提供一定的參考。

1" 材料與方法

1.1nbsp; 試驗材料

選取生長良好、長勢一致的一年生茶樹品種黃棪進行水培預培養(yǎng)，營養(yǎng)液參照小西茂毅茶樹水培營養(yǎng)液配方[15]。預培養(yǎng)1周后，分別進行50 mmol·L-1 Fe3+（FeCl3）、10 mmol·L-1 Cd2+[Cd （NO3）2·4H2O]處理，每個處理設置3組生物學重復。在處理后第0（對照）、1、2、4、8、12、24、48 h剪取茶樹第二、三葉位的鮮葉并混合，迅速放置液氮冷凍，存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2" 試驗方法

1.2.1" 茶樹NFU基因序列的獲取

基于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA（http：//tpia.teaplants.cn/）中的全基因組數(shù)據(jù)，利用擬南芥、水稻的NFU基因序列進行Blast比對，剔除重復冗余序列，再經(jīng)過NCBI保守結(jié)構(gòu)域比對，最終確定并獲得茶樹NFU基因家族全部成員。

1.2.2" 茶樹NFU基因序列及編碼蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）分析茶樹NFU蛋白的化學公式、分子量、理論等電點（pI）及亞細胞定位等理化性質(zhì)。

1.2.3" 茶樹NFU保守基序及蛋白高級結(jié)構(gòu)分析

通過MEME網(wǎng)站（http：//meme-suite.org.jsafc.vpn358.com）對蛋白序列進行基序分析；利用在線網(wǎng)站（http：//h-p.www.sbg.bio.ic.ac.uk.jsafc.vpn358.com/phyre2/html/page.cgi？id=index）對茶樹NFU蛋白的三級結(jié)構(gòu)特征進行分析。

1.2.4" 茶樹NFU系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和順式作用元件預測

選取擬南芥、水稻、大豆、葡萄NFU蛋白序列，采用MEGA7.0軟件進行多序列比對，并選用鄰近連接法（Neighbour-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)設置為1 000次。

1.2.5" 茶樹NFU染色體定位和啟動子順式元件分析

利用TBtools軟件將NFU基因在染色體上的分布情況進行可視化處理；在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中，分別搜尋截取茶樹NFU基因上游2 000 bp的基因序列，并在PlantCare在線網(wǎng)站（http：//h-p.bioinformatics.psb.ugent.be.jsafc.vpn358.com/webtools/plantcare/htmI）中進行順式作用元件分析。

1.2.6" 茶樹NFU基因組織特異性表達分析

從茶樹基因組（http：//tpia.teaplants.cn/）中獲取NFU基因在不同組織部位的表達水平（組織包括頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、果實、莖、根），并利用MeV軟件繪制成熱圖。

1.2.7" 總RNA的提取和實時熒光定量PCR分析

利用CTAB法提取茶樹對照組和處理組的總RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用在線網(wǎng)址（https：//sg.idtdna.com/pages/tools/primerquest）進行熒光定量引物設計（見表1），并選用CsPTB基因為內(nèi)參基因，反應體系為：SYBR? Premix ExTaqII（10 μL），上下游引物（各1 μL），cDNA 模板（2 μL），ddH2O（6 μL）；反應程序為：95 ℃預變性3 min；（95 ℃，30 s；60 ℃， 90 s）40 個循環(huán)，使用 IQ5 Multi-Color Real time PCR Detection System熒光定量儀，定量結(jié)果采用2-△△Ct法[16]計算基因相對表達量，并用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 茶樹NFU基因家族的鑒定與理化分析

從茶樹基因組中共鑒定獲得4個NFU基因成員，分別命名為CsNFU-1、CsNFU-2、CsNFU-3和CsNFU-4。通過Prot Param tool軟件在線分析，結(jié)果顯示，CsNFU編碼的氨基酸數(shù)量為214～278，分子量在22.6～30.2，pI范圍在5.20～6.31。 亞細胞定位預測結(jié)果顯示，所有CsNFU蛋白均定位于葉綠體（見表2）。由圖1可知，CsNFU-1～CsNFU-4基因分別分布在茶樹的第13、3、4、7號染色體上。

2.2" "茶樹NFU家族成員保守基序及三維結(jié)構(gòu)分析

Motif分析結(jié)果（圖2，見封二）顯示，茶樹CsNFU蛋白包含了3個典型的保守基序motif1～motif3，其中CsNFU-1、CsNFU-2和CsNFU-3均含有3個motif結(jié)構(gòu)，而CsNFU-4則缺失了motif3。

蛋白三級結(jié)構(gòu)預測（圖3，見封二）顯示，茶樹CsNFU-1、CsNFU-2和CsNFU-3蛋白的三級結(jié)構(gòu)非常相似，而CsNFU-4卻具有獨特的三維結(jié)構(gòu)。

2.3" 植物NFU蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對茶樹（4個）、擬南芥（5個）、水稻（4個）、大豆（4個）、葡萄（4個）5種植物的NFU同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，所有NFU同源蛋白被劃分為兩個亞家族。茶樹CsNFU-1、CsNFU-2和CsNFU-3同屬于GroupⅠ亞家族，CsNFU-4則單獨屬于GroupⅡ亞家族（見圖 4）。

2.4" 茶樹NFU基因家族順式元件分析

對CsNFU基因家族成員起始密碼子上游的2 000 bp進行順式作用元件預測，結(jié)果表明，CsNFU-1～CsNFU-4包含了眾多光響應元件和生長素、脫落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素等激素響應元件；此外，在CsNFU-1中還發(fā)現(xiàn)了低溫脅迫響應元件LTR，CsNFU-2中有與干旱脅迫相關的響應元件MBS，CsNFU-3中發(fā)現(xiàn)了脅迫響應元件TC-rich repeats（圖 5，見封二）。

2.5" 茶樹CsNFU基因組織特異性表達分析

為進一步探究CsNFU在不同組織部位及生長發(fā)育中的生物學功能，選取了茶樹的花、果實、幼葉、成熟葉、老葉、嫩莖、老莖和根8個組織部位的表達模式進行分析。結(jié)果顯示，CsNFU-1和CsNFU-2主要在茶樹的成熟葉、老葉及花中檢測出較高的表達水平；CsNFU-3主要在茶樹的成熟葉、老葉和莖中表達；CsNFU-4則主要在葉片（成熟葉、老葉、嫩葉）中表達，在其他部位表達量較低（圖 6，見封二）。

2.6" "茶樹CsNFU基因在高鐵脅迫下的表達分析

在50 mmol·L-1 Fe3+脅迫處理下（見圖 7），茶樹CsNFU-1的表達水平在處理的第8 h顯著上調(diào)，在第48 h達到峰值，是對照組的4倍左右；CsNFU-2基因則在處理的第 4 h開始呈現(xiàn)上調(diào)表達，并在第24 h達到最大表達水平；CsNFU-3和CsNFU-4的表達水平總體上變化幅度較小，其中CsNFU-3的最大表達水平約是對照的1.2倍，而CsNFU-4僅在處理的第12、24 h與對照組有顯著差異，其他處理時間無顯著差異。

2.7" "茶樹CsNFU基因在高鎘脅迫下的表達分析

在10 mmol·L-1 Cd2+脅迫處理下（見圖 8），CsNFU-1～CsNFU-4也受到不同程度地誘導表達，其中CsNFU-1在處理第12 h后，檢測到具有較高的表達水平，達到對照組的4倍左右；CsNFU-2從處理第2 h便呈現(xiàn)出逐步上調(diào)表達，在第12 h達到峰值后，表達水平又有回落的趨勢；CsNFU-3的表達水平總體變化幅度不大，在處理第2 h顯著上升后，又回落到對照組水平；CsNFU-4則在處理第4 h開始上調(diào)表達，并在8～24 h維持較高的表達水平。

3" 結(jié)論與討論

Fe-S 簇裝配機制是植物鐵素營養(yǎng)和鐵代謝的核心環(huán)節(jié)，需要依賴多種支架蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白的共同參與。迄今為止，許多重要的支架蛋白如SUFB、SUFC、NFU 等已被探明[17-19]。

該研究從茶樹基因組中鑒別到4個NFU家族成員，這一數(shù)量與葡萄[12]、大豆[13]、桃[10]相同，而擬南芥中還發(fā)現(xiàn)了AtNFU-5[19]。Li等對比了多個植物基因組中NFU同源蛋白的數(shù)量情況，發(fā)現(xiàn)相對草本植物而言，大多數(shù)多年生木本植物中缺少NFU-5[19]。推測茶樹可能在長期的生長演化過程中，NFU-5作為支架蛋白的功能逐漸退化而被丟失。

蛋白的結(jié)構(gòu)特征往往與其發(fā)揮的生物學功能密切相關。保守基序分析結(jié)果表明，茶樹CsNFU-1、CsNFU-2和CsNFU-3均含有3個典型的motif基序，而CsNFU-4則缺少了motif3，此外蛋白三維結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示CsNFU-4與CsNFU-1、CsNFU-2和CsNFU-3存在明顯差異。推測茶樹CsNFU家族成員可能在Fe-S簇裝配等生理活動過程中發(fā)揮著不同的生物學功能。另外，為了初步探明茶樹CsNFU基因受順式作用元件的調(diào)控機制，本研究對茶樹CsNFU基因家族成員啟動子區(qū)順式元件進行預測，發(fā)現(xiàn)了茉莉酸甲酯、脫落酸、乙烯、生長素和赤霉素等多個激素響應元件和干旱、低溫、厭氧等逆境脅迫響應元件，表明茶樹CsNFU與植物激素和逆境響應應答機制存在密切關系。

已有研究表明，F(xiàn)e-S簇裝配基因在植物不同組織部位的表達量差異明顯[21]。本研究亦發(fā)現(xiàn)CsNFU家族成員的表達具有明顯的組織特異性，CsNFU-1～CsNFU-4普遍在茶樹根系的表達量最高，相關研究已經(jīng)揭示，在茶樹各部位中，根系中的鐵元素含量普遍高于葉片、嫩莖等其他組織部位[22]，由此推測CsNFU功能的發(fā)揮可能需要適量的鐵素供應；而且，CsNFU-1和CsNFU-2還在茶樹花中具有較高的表達量，這與擬南芥中的AtSUFE2類似[23]，暗示CsNFU-1和CsNFU-2可能也與茶樹花的發(fā)育有關。前人研究已表明，NFU基因的表達受到鐵素供應水平的顯著調(diào)控[9]，本研究也發(fā)現(xiàn)在高濃度鐵脅迫下，茶樹CsNFU-1和CsNFU-2受到顯著誘導，尤其是CsNFU-1，其最高表達水平約是對照的4倍，推測二者在Fe-S 簇裝配過程中發(fā)揮了主要作用，且其活性直接受外界鐵素水平的調(diào)控。與此同時，本文還探究了茶樹CsNFU在鎘脅迫處理下的表達模式，CsNFU-1和CsNFU-2同樣被誘導上調(diào)表達，這一結(jié)果說明CsNFU-1和CsNFU-2在響應茶樹其他重金屬脅迫中也發(fā)揮了重要作用。此外，與Fe3+處理所不同的是，CsNFU-4在鎘脅迫下也被顯著誘導表達，這表明了茶樹CsNFU-4在應對不同金屬元素脅迫時，其生物學功能具有一定的差異性。

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（責任編輯：易" 婧）