福州市行道樹杧果葉斑病發生情況調查與病原菌鑒定

2024-12-30 00:00:00陳婧

南方農業·上旬 2024年11期

摘要為了解福州行道樹杧果葉斑病發生情況并明確其病原菌，采用“Z”形選點法與五點取樣法對福州中心4城區的18條道路行道樹杧果葉斑病發生程度開展調查，并采集病樣進行病原菌分離純化，根據柯赫氏法則進行室內致病性測定，結合病原菌形態學觀察和分子生物學研究對其進行鑒定分析。結果表明，福州市4城區行道樹杧果葉斑病普遍存在且發生程度差異顯著，平均病情指數為25.63。從病樣共分離出鏈格孢菌（Alternaria）、炭疽菌（Colletotrichum）、擬莖點霉菌（Phomopsis）3種真菌菌株，均能侵染杧果葉片產生病斑，使葉片逐漸枯萎，導致杧果樹勢衰弱。

關鍵詞杧果；葉斑病；病情指數；病原菌鑒定；ITS序列

中圖分類號：S432 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.21.007

杧果Mangifera indica L.，又名檬果，漆樹科杧果屬常綠喬木，作為果樹和行道樹在中國廣泛栽種，主要分布在廣西、云南、海南、廣東、四川、臺灣、福建、貴州8省（區）約100多個縣（市）[1]。隨著杧果產業的發展，杧果炭疽病、白粉病、葉斑病、杧果流膠病、杧果蒂腐病、瘡痂病、煤煙病、枝枯病、褐根病、膏藥病、曲霉病等病害問題日益凸顯[2]，造成巨大的經濟損失。杧果葉斑病作為杧果較常見的一種病害，主要危害葉片，使葉片產生斑點并干枯，影響杧果光合作用[3]，對杧果產量和園林綠化應用都產生巨大的影響。杧果葉斑病致病病原菌種類多樣，有樹生黃單胞菌Xanthomonas arboricola、粉紅聚端孢菌Trichothecium" roseum、球座菌Guignardia [4]、黑曲霉Aspergillu niger、黑附球菌Epicoccum nigrum、鏈格孢菌Alternaria tenuissima、粉孢霉Oidium mangiferae Berther、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides [5]和擬莖點霉菌Phomopsis [6]等。

杧果因具有適應性廣、速生易長、抗逆性強、栽培管理容易、經濟壽命長（50 年以上）、樹形整齊等優點[1]，常作為福州城市園林建設綠化樹種，在鼓樓區、臺江區、晉安區、倉山區等中心4城區大量栽種。但近年來，福州城市行道樹杧果葉斑病危害日益嚴重，主要為害癥狀表現為葉片初生圓形、近圓形或不規則形的黑色小病斑，隨著病斑擴大或連片，病斑中央呈褐色，邊緣黑褐色或黑色，發病嚴重時葉片枯死，導致杧果樹出現黃葉、落葉和樹勢衰弱等，嚴重影響城市園林綠化景觀。為掌握福州市行道樹杧果葉斑病的發生情況，探明杧果葉斑病的致病病原菌，本研究對福州市中心4城區行道樹杧果葉斑病的發生情況開展系統性調查，并分離和純化病原菌，通過柯赫氏法則驗證，結合形態學觀察和分子生物學研究進行病原菌鑒定，以期為杧果葉斑病的防治提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 杧果葉斑病發生情況調查

1.1.1" 調查地點與方法

選擇福州市鼓樓區（北環中路、公益路、湖東路、六一北路），臺江區（群眾東路、廣達路），晉安區（連江中路、長樂中路、秀峰路）及倉山區（倉前路、望峰路、盤嶼路、照嶼路、鳳冠路、冠浦路、上下店路、金林路、高宅路）18條具有代表性的道路作為行道樹杧果葉斑病調查地點。

采用“Z”形選點法在每條道路兩側各選取5株成齡杧果樹，每株分別在樹冠的東、西、南、北、中5個位點截取1～2枝帶葉枝條，調查并記錄葉片總數、各級病葉數，計算病情指數。

病情指數（DI）=[∑（各級病葉數×相對級數值）/（調查總葉數×9）]×100

1.1.2" 葉片病害發生程度分級

根據每株杧果樹采集的葉片病斑面積進行分級，分為6級[7]。

0級：葉片無病斑；1級：病斑面積占整個葉片面積的5%以下；3級：病斑面積占整個葉片面積的6%～15%；5級：病斑面積占整個葉片面積的16%～25%；7級：病斑面積占整個葉片面積的26%～50%；9級：病斑面積占整個葉片面積的51%以上。

1.1.3" 數據處理

采用SPSS 23.0軟件進行數據處理，運用DMRT法進行方差分析。

1.2" 病原菌分離與鑒定

1.2.1" 病樣采集和病原菌分離純化

于福州市城區道路兩側杧果樹上采集具有典型癥狀的杧果葉片，將杧果病葉清潔后，參考組織分離法，切取約3 mm×3 mm病健交界處的葉片組織，用75%酒精浸洗30～35 s后，用無菌水浸洗4～5次，再用無菌濾紙去除多余水分后將小塊病葉組織轉移到無菌PDA培養基上，置于25 ℃恒溫箱內培養3 d。再在分離培養得到的單株病原菌菌落邊緣處切取約1 mm×1 mm菌絲塊，轉至無菌PDA培養基上，置于25 ℃恒溫箱內培養3 d，如此重復純化培養3次，最后將純化菌株轉至PDA斜面培養基上，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2" 病原菌的形態學鑒定

病原菌在PDA培養基上培養4～6 d，觀察菌落顏色、形狀、大小、菌絲形態、是否產孢、分生孢子及分生孢子梗形態等，根據其形態特征進行病原菌初步鑒定[8]。

1.2.3" 病原菌致病性測定及柯赫式法則驗證

實驗室條件下，選擇帶柄的健康杧果葉片進行菌餅接種。將葉片消毒處理后，在葉主脈兩側制造微傷口，一側接種純化后的菌餅，一側接種無菌的PDA培養基塊作為對照，且上下設置未造傷和造傷對照，最后于保濕條件下，25 ℃恒溫進行光暗周期培養，觀察接種葉片發病情況，通過組織分離法對接種葉片病部的病原菌進行分離鑒定。

1.2.4" 病原菌的分子生物學鑒定

通過TPS法提取培養5～7 d真菌菌絲基因組DNA，用ITS通用引物（ITS1序列為5’-TCCGTAGG TGAACC TGCGC-3’，ITS4序列為5’-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3’[5]）進行PCR擴增，將PCR產物送至北京擎科生物科技有限公司測序。通過NCBI-BLAST網站進行序列比對，選擇同源性高的序列并使用MEGA-X64軟件采用NJ法構建系統發育樹。

2" 結果與分析

2.1" 杧果葉斑病調查結果

調查結果表明，所有調查路段內行道樹杧果都存在葉斑病危害情況，病情指數均值為25.63，其中晉安區秀峰路最高（DI均值為36.29），倉山區鳳冠路次之（DI均值為33.37），臺江區廣達路最低（DI均值為19.45）。DMRT法檢驗結果表明，不同路段間的病情指數均值存在顯著差異（p＜0.05，見圖1）。

比較各區杧果葉斑病的病情指數均值，晉安區（DI均值為28.38）＞倉山區（DI均值為26.76）＞鼓樓區（DI均值為24.02）＞臺江區（DI均值為19.66），晉安區危害程度最重，臺江區危害程度最輕（見表1）。

2.2" 病原菌的分離鑒定

2.2.1" 病原菌形態學鑒定

從杧果葉斑病病部共分離到3種菌落形態不同的病原菌MG1、MG2、MG3。

病原菌MG1的菌落初期為白色，呈放射狀，菌絲致密，后期中部形成黃褐色圓形菌圈；分生孢子呈倒棍棒形，褐色，初步鑒定為鏈格孢菌。

病原菌MG2的菌落初期為白色、近圓形，菌絲致密呈放射狀，后期中部變成黑褐色，邊緣呈淺褐色，并產生橘紅色分生孢子堆；分生孢子呈橢圓形，兩端鈍圓，單胞，無色，初步鑒定為炭疽菌。

病原菌MG3的菌落初期為白色，呈扁平狀，后期逐漸形成多層黃褐色輪紋；分生孢子無色單胞，紡錘形，初步鑒定為擬莖點霉菌。

2.2.2" 病原菌分子生物學鑒定

3種病原真菌DNA模板通過ITS通用引物擴增片段的長度約為500 bp，將檢測所得基因序列提交 GenBank數據庫，通過BLAST進行同源比對，同源性均在95%以上。選擇相似度高的菌株序列，以NJ法構建系統進化樹，結果表明，本次試驗分離到的病原菌分別為鏈格孢菌、炭疽菌、擬莖點霉菌。

2.3" 病原菌致病性測定及柯赫式法則驗證

通過柯赫氏法則對杧果葉斑病病原菌進行致病性測定，觀察菌餅接種發病情況，部分葉片造傷處接種后2～3 d逐漸形成黑褐色病斑并不斷擴大，4 d后部分病斑處開始產生少量菌絲，5 d后發病葉片逐漸枯萎，空白對照組未出現病害癥狀。通過組織分離法對接種葉片病部的病原菌再次進行分離鑒定，結果與接種病原菌一致。

3" 討論與結論

調查結果表明，福州市4城區道路杧果樹普遍存在葉斑病危害現象，且不同路段發病程度差異明顯，以秀峰路最嚴重。初步分析，導致道路杧果葉斑病發病嚴重的原因有：道路兩側杧果樹種植過密，樹干附著苔蘚、地衣及蕨類植物等，樹冠郁閉度大，不通風，濕度較高，當達到適宜溫度與濕度時，易發生葉斑病危害；道路周邊無高層建筑物遮擋，杧果樹受日灼影響導致整體樹勢弱，長勢不佳，易被病菌侵染；養護水平差異影響，非中心區域的道路管理較粗獷，未能及時對病蟲枝、病葉、枯枝進行修剪與清理，常常導致病原菌仍在病殘體內，繼續對杧果樹產生危害；部分道路杧果樹同時存在煤煙病、介殼蟲或黑斑病等其他病蟲危害，導致樹勢減弱，其他病蟲造成的微傷口為葉斑病病原菌入侵危害提供了便利，加快了致病菌的侵染發病。因此，福州4城區所有調查路段杧果葉斑病發病程度存在顯著性差異主要與杧果樹勢、環境溫度、濕度條件及道路養護水平不同密切相關。同時，本研究明確了福州城區行道樹杧果葉斑病的3種病原菌為鏈格孢菌、炭疽菌、擬莖點霉菌，均在侵染杧果葉片后產生黑褐色病斑，影響杧果樹的園林觀賞價值。其中，鏈格孢菌與周銀麗等[2]對杧果葉斑病病原菌的鑒定結果一致，擬莖點霉菌與張頂洋等[3]從杧果葉斑病病葉中分離到的病原菌一致，炭疽菌與任一兵等[5]報道的5種杧果葉斑病病原菌中的膠孢炭疽菌同為Colletotrichum屬，但還需進一步定種。

可選用80%代森錳鋅和50%克菌丹防治由鏈格孢菌引起的杧果葉斑病[9]；或使用對杧果炭疽菌具有較好拮抗作用的沃豐康-復合微生物菌劑，對杧果炭疽病的防效在60%及以上[10]；或使用貝萊斯芽孢桿菌，能顯著抑制杧果膠孢炭疽菌菌絲的生長[11-12]；或使用0.3%四霉素水劑，研究表明，該水劑對火龍果膠孢炭疽菌起到較好的抑制作用[13]；或使用45%咪鮮胺EW抑制杧果膠孢炭疽菌的生長，使用咪鮮胺與三唑酮6︰4的混配藥劑能起到明顯的增效作用[14]；或選用高效納米氫氧化鎂抗真菌制劑抑制杧果擬莖點霉葉斑病病原菌，質量濃度越高，抑菌活性越強[3]。除了采取化學防治與生物防治措施，行道樹杧果葉斑病防治還可采取合理密植、病殘枝清除、內膛枝疏剪、樹木復壯、工具消毒等養護管理措施，降低病原菌的初侵染源數量，增強樹勢，減少病害發生。

本研究的調查與病原菌鑒定結果可為福州城區行道樹杧果葉斑病的科學防治提供參考，提高杧果樹的園林觀賞價值和經濟效益，助力城市園林生態建設可持續發展。

參考文獻：

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