環境DNA技術在生物多樣性監測中的應用及展望

摘 要 生物多樣性是人類賴以生存和發展的基礎，正呈持續下降趨勢，保護生物多樣性已成為21世紀人類面臨的重大挑戰。保護生物多樣性的重要基礎是進行有效的物種監測，準確了解生物多樣性分布狀況。傳統的物種監測方法存在耗時耗力且不夠高效、無法滿足大規模生物多樣性監測需要等局限性。一種新的具有快速、低成本、高檢出率及對生物和環境破壞性小等特點的物種監測方法——環境DNA技術（eDNA技術）正越來越受到重視和推廣應用。綜述了eDNA技術在水環境、土壤環境、空氣環境生物多樣性監測及入侵物種監測方面的應用，并對環境DNA技術的應用前景進行了展望。

關鍵詞 環境DNA技術；生物多樣性；入侵物種；生物監測

中圖分類號：X176；X835 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.21.024

生物多樣性是人類賴以生存和發展的基礎。然而，由于人類活動、氣候變化等因素影響，生物多樣性正在持續下降，已成為21世紀面臨的重大挑戰之一[1]，保護生物多樣性已成為全球生態領域研究的重要課題。保護生物多樣性的基礎工作是進行有效的物種監測。只有通過監測物種的種類、分布、數量和種群動態等信息，準確了解生物多樣性狀況，才能有針性地采取保護措施。傳統的物種監測方法存在一定的局限性：1）通常需要長時間的實地觀察和手動記錄，耗時耗力且不夠高效[2]；2）只能涵蓋有限的空間范圍和物種數量，無法滿足大規模生物多樣性監測的需要[3]。

環境DNA技術，亦稱環境DNA宏條形碼技術（Environmental DNA Metabarcoding Technology，eDNA技術），是近年來逐漸被推廣應用的生物多樣性監測新技術。eDNA是指從環境樣本中獲取到的所有生物的總DNA[4]。通過從水、沉積物、土壤和空氣等環境樣品中收集提取生物的DNA片段，利用測序技術對其進行定性或定量分析，從而揭示該生境中的生物分布狀況[5-6]。與形態學鑒定等傳統方法相比，eDNA技術具有快速[7]、低成本[8]、高檢出率[9-11]及對生物和環境破壞性小[12-13]等優勢。如Shirey等[8]調查美洲紅點鮭（Salvelinus fontinalis），同時采用電氣捕獲和eDNA技術，eDNA技術只用采集水樣就可以檢測，取樣省時省力，可節省超過2/3的費用。目前，eDNA技術已經應用于水環境、土壤環境、空氣環境等的物種監測。本文綜述了eDNA技術在不同環境生物監測中的應用，展望未來發展趨勢。

1" 環境DNA技術在水環境中的監測應用

在生物多樣性監測中，水環境被認為是eDNA技術應用最為廣泛的領域，展現出比傳統調查方法更為準確、便捷和對物種與棲息地干擾更小的優勢[14]。在水生生態系統中，魚類發揮著重要作用，參與物質循環、能量流動和生態穩定性的維護[15]，eDNA技術在魚類監測中的應用最為成熟。

1.1" 目標物種監測

目標物種的空間分布與豐度對研究其生態習性和制定保護政策至關重要。水生生物的生存環境增加了監測難度，特別是那些種群密度極小的物種，比如隱存種、瀕危種和稀有種，調查工作更加困難[16]。傳統的監測方法往往難以捕獲到這些密度極小的種群，無法掌握其種群動態。采用eDNA技術監測，利用環境中存在的微量DNA可以推斷目標物種的存在與分布。2020年，Marquez等[17]在西班牙北部娜龍河和薩拉河運用eDNA技術監測歐洲鰻鱺（Anguilla anguill），通過收集水樣分析其中的DNA，揭示了種群的存在及在特定區域的分布情況，為歐洲鰻鱺保護提供了數據支持。Hueriman等[18]在關島西部海域使用eDNA技術實現了對路氏雙髻鯊（Sphyrna lewini）的監測，并建立了相應的監測體系，不僅能夠跟蹤這種瀕危物種的活動范圍，還可以評估其種群數量和分布變化，而傳統調查方法自1970年以來再未捕獲到路氏雙髻鯊，eDNA技術為保護這一瀕危物種提供了重要的參考依據。2022年，我國研究人員王夢等[19]基于eDNA技術在長江上游重慶段展開了多種珍稀特有魚類的本底調查，并檢測到了2種國家級保護魚類和10種長江上游特有魚類。

1.2" 生物多樣性調查

生物多樣性調查是評價生物多樣性的重要手段。通過采集樣本并對其中的物種進行鑒定和統計，分析不同物種的分布、豐度和動態變化，明確生態系統的生物多樣性特征，從而對生態系統的健康狀況進行監測和評估[15]。2022年，李愛民等[20]在秦淮河利用eDNA技術開展水域內魚類生物的多樣性檢測，不僅測出了該水域內魚類生物的優勢種，還將實驗結果與歷史數據對比，發現在物種豐度鑒定方面eDNA技術顯著高于傳統形態學。李旭文等[21]用eDNA技術開展了江蘇省魚類群落監測，探索了eDNA技術應用于超大范圍水生態環境監測、評估和管理的適用性、可行性和易用性。除種類監測外，eDNA技術還用于調查研究魚類群落時空分布的動態變化[22]、各物種相對豐度[23]、系統發育多樣性[24]及功能多樣性等[25]。

1.3" 生物量評估

生物量是生態系統中維持種群數量和生態功能的關鍵因素，只有通過準確評估水生生物類群的生物量，才能更好地了解和管理生物群落、保護生態系統的穩定性和功能[15]。對于水生生物類群來說，準確評估其生物量具有挑戰性。現有評估方法不僅費用和人力要求高，還無法有效應用于種群數量極小的物種。2012年，Doi等[26]首次采用環境eDNA技術評估水域中魚類的生物量，之后又運用到鯉魚（Gprinus carpio）的生物量評估中，原理是通過分析水環境中魚類釋放的eDNA濃度與實際魚類生物量之間的關系，建立評估模型。2018年，Fukushima等[27]在日本北部以遠東哲羅鮭（Parahucho Perryi）為研究對象，研究不同生長階段的魚群釋放eDNA的濃度與其生物量之間的關系，研究結果發現在魚類生物量恒定的情況下，無論魚大小如何，釋放的DNA濃度都是相等的。這一發現為eDNA技術在生物量評估上的應用提供了有力支持，說明eDNA技術可以被廣泛應用于水域生態系統中魚類等生物量的評估，為該領域的研究和保護工作帶來了新的突破和可能。

2" 環境DNA技術在土壤環境中的監測應用

2.1" 土壤動物監測

陸地環境的eDNA監測技術目前主要用于土壤[28]。De Danieli等[29]利用eDNA技術對法國阿爾卑斯山發現的14種蚯蚓成功設計出引物并建立蚯蚓的線粒體DNA參考數據庫。Kershner等[30]使用COI基因與核糖體18S rRNA基因設計引物，成功鑒定了馬尼斯蒂國家森林的無脊椎動物生物多樣性。Duckert等[31]根據18S rRNA基因的V9區域，對高山環境中的頂復動物亞門（Apicomplexa）進行調查，推測生態系統中無脊椎動物的生物多樣性。eDNA技術在研究土壤動物多樣性方面非常具有潛力。

2.2" 微生物與植物監測

eDNA技術可以用來鑒定土壤中的微生物和區分不同植物根系。Murat等[32]利用eDNA技術調查了8種森林土壤中細菌和真菌的豐度與多樣性，研究結果超預期，展現出eDNA技術在土壤環境中的良好應用前景。Hardy等[33]分別通過傳統方法和eDNA技術檢測根區疫霉菌（Phytophthora spp.），后者檢測到的疫霉菌遠多于前者，表明eDNA技術對植物根系菌群檢測的有效性。植物根系研究在土壤學中有著重要作用，而其中讓人棘手的是準確辨別出不同植物的根系。伴隨著高通量測序（NGS）技術的發展，eDNA技術也用于植物根系研究。瑞典科學家Winsley等[34]改變傳統的Trnl引物，成功辨別了極地苔原和溫帶大陸草原氣候的植物根系樣本。

2.3" 土壤環境狀況監測

目前土壤環境狀況評價仍以理化指標為主。eDNA技術的發展為開展土壤污染狀況和土壤生態修復效果評價提供了新的方法。eDNA技術可快速地開展土壤生物調查，精準地辨別出不同污染程度的土壤生物群落結構差異[35]，從而評估環境對土壤生物群落的影響和評價土壤健康狀況。黃湘云等[36]構建eDNA物種敏感性分布法（eDNA-SSD），嘗試判斷有哪些關鍵因素導致土壤污染嚴重，實驗結果證實即使在缺少污染基準值的條件下，通過eDNA技術仍然可以做出對土壤污染狀況的綜合評價。Gellie等[37]利用eDNA技術對土壤中真菌進行定量監測分析，研究其對生態系統恢復的反應，以評估恢復效果，結果表明eDNA技術在生態環境監測方面具有廣闊的應用前景。

3" eDNA技術在空氣環境中的監測應用

傳統空氣生物學一直以來依賴于培養基和顯微鏡來評估生物多樣性和物種豐度。這一方法存在局限性，如只能檢測出能夠在培養基上生長的微生物，而不能檢測出那些無法在體外培養的微生物；當微生物處于死亡或休眠狀態，也無法被傳統方法檢測到。eDNA技術應用到空氣環境微生物檢測，直接從空氣樣品中獲取微生物的遺傳信息，而不需要將其培養在特定的培養基上[38]，這就對空氣環境中微生物監測、分類、評估提供了可能性。2012年，Bibby等[39]首次使用eDNA技術對一座5層建筑屋頂空氣中真菌的組成進行研究，連續4個季節對空氣采樣進行eDNA分析，結果顯示空氣中真菌的多樣性與土壤環境不相上下。在室內空氣環境監測中，Zou等[40]采取培養基法和eDNA技術對一間病房的微生物多樣性進行檢測，包括真菌、古菌、細菌和病毒，eDNA技術提供了病房中完整的微生物分布情況，而傳統方法一次只能鑒定少量病原體。

除微生物外，eDNA技術還用于研究通過空氣傳播導致人或動物過敏甚至感染的物質。Ventayol等[41]運用eDNA技術研究空氣中花粉顆粒的種類組成，使用該技術與電子顯微鏡相結合，鑒定并分析采集到的粉粒樣本，結果表明，相比于傳統的顯微鏡方法，eDNA技術更易識別出致人過敏的植物花粉源。在國內，已經有研究人員將空氣中的eDNA技術延用到了生物多樣性評估當中，李應等[42]在海南大學校園內布設空氣eDNA提取器，改良提取方法使捕捉到的DNA序列更加符合要求，最后檢測到了遠超過校方已有記錄的植物種類。

4" 環境DNA技術在生物入侵監測中的應用

外來物種入侵是全球關注的重大生態問題，是導致生物多樣性減少的主要影響因素之一。早期監測和預警對防控外來生物入侵愈發重要，然而部分外來生物具有隱蔽性強、容易擴散的特點，使其難以及時被發現和防控[15]。eDNA技術具有高靈敏性和高效性特點，通過分析環境中的DNA，可以快速、準確地檢測到外來物種的存在，從而及時采取相應的防控措施。

4.1" 入侵生物識別

在防控外來物種入侵過程中，如何快速精準地發現入侵物種或潛在外來威脅物種非常關鍵。Taberlet等[43]在歐洲中部地區采集15個水體樣本，使用基因特異性引物進行PCR擴增和測序，檢測到了傳統方法未能發現的入侵物種美國牛蛙，打開了eDNA技術用于入侵生物早期監測的思路。此后該技術逐漸被推廣用于魚類、軟體動物等入侵生物的監測。2011年，美國有研究報道在芝加哥水道可能存在外來魚類入侵風險。Chadderton等[44]通過分析水道中的環境DNA，檢測到鳙魚（Hypophthalmichthys nobilis）和鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）這兩種外來魚類的存在。瑞典研究人員Zaiko等[45]制訂了用于北美楔蛤（Rangia cuneate）監測的特異性分子標記法和eDNA監測法，在北冰洋附近波羅的海和威斯佤銹湖實地檢驗了該方法的有效性，在種群密度較小的情況下仍發現了北美楔蛤的蹤跡。Hopken等[46]在北美洲南部地區采集6個地方的水樣，用eDNA技術在其中5個地點檢測到了來自緬甸的兩棲動物緬甸蟒（Python bivittatus），檢出率超過了90%，在當年被稱為監測緬甸蟒蛇分布的重大技術突破。

船舶壓艙水及其沉積物具有攜帶和傳播外來物種的風險。eDNA技術已被廣泛應用于壓艙水檢測，識別是否存在外來生物。Borrell等[47]在位于歐洲南部的西班牙港口中的6條貿易商船中檢測出了72種藻類，約22%是西班牙本土之外的物種，其中又有一半為有害種，會對當地生態環境造成破壞。Zhan等[48]分別用淡水、半咸水和氯處理水對壓艙水中的生物進行處理，用eDNA技術檢測三者的生物豐度，結果顯示，即使經過氯消毒處理，仍不能減輕壓艙水中外來生物帶來的入侵風險。

除水環境外，eDNA技術在21世紀20年代開始用于農林業的外來物種監測。Rooyen等[49]在采摘葉片上檢測到了美洲斑潛蠅（Liriomyza sativae）留下的DNA痕跡，由于該昆蟲個體小且行動迅速，相較于直接捕捉，通過對樹葉或農作物植株殘留的痕跡進行采樣分析則容易得多。

4.2" 生物入侵過程監測

研究外來物種入侵，還需要搞清楚外來物種是通過何途徑進入到所定居的生態系統中，eDNA技術已用于這方面研究。

Steinke等[50]對黑魚（Channa argus）進行特異DNA標記，再利用eDNA技術和GenBank大數據合并矩陣分析，結果在該黑魚捕撈地分支的49條河流或溪流中檢測到了相同的DNA，為該生物通過何種路徑入侵提供了的證據。Takahara等[51]在日本本島附近的19處海域發現了外來入侵魚類藍鰓太陽魚（Lepomis macrochirus），為弄清這種魚從何而來，采集本州島、四國島及九州島附近的70個水樣進行eDNA分析，結果顯示該魚在本州島附近的密度最高，向外呈擴散趨勢，其余地點則趨勢不明顯或密度很低。Uchida等[52]采取多重熒光定量技術分別對3種本土魚和入侵魚進行標記，在各地的100個池塘分季節分時間段進行了監測，發現不論是本土魚還是入侵魚均在夏至左右檢出率較高，且伴隨著人類活動越頻繁的地方，3種外來入侵魚類的DNA要明顯高出本土魚。這些研究結果為弄清外來物種的擴散入侵過程提供依據。

5" 環境DNA技術應用中注意的問題與展望

在生物多樣性監測中，eDNA技術作為新興調查技術優勢明顯，應用潛力巨大，但目前eDNA技術仍未能取代傳統調查方式成為主流方法，多作為一種輔助調查手段，其存在的問題和不足亟需改進和完善。

5.1" eDNA技術操作流程的標準化

最佳的eDNA技術操作流程與實驗方案，可減少調查過程誤差，確保調查結果的準確性和可靠性；規范化的操作技術流程，可確保調查結果的一致性和可比性。目前在eDNA技術應用方面，亟待制訂全球或國家范圍內的統一技術標準或操作流程技術規范，如從濾膜孔徑選擇到最后算法的整個環節，在全球或國家范圍內統一技術標準和操作流程，規范采樣方法、實驗流程和數據分析，為eDNA技術應用提供參考。為推動eDNA技術在魚類生態學研究中的標準化，一些國際組織已開始相關工作，如歐洲標準化委員會（CEN）和日本分別在討論制訂eDNA技術的標準化問題[53-54]。

5.2" DNA及rRNA數據庫的完善

在生物監測中，eDNA技術廣泛推廣應用面臨的一個重要問題是DNA序列參考數據庫的不完整性和錯誤信息。進行物種鑒定和分類注釋通常依賴于公共參考數據庫，如NCBI（美國國家生物技術信息中心數據庫）、EMBL（歐洲分子生物學實驗室數據庫）、BOLD（生命條形碼數據庫）等[55]，目前這些數據庫中并非所有物種的DNA序列都得到了充分收錄，而且可能存在數據錯誤或缺失。由于物種分布的地區差異，建立本土基因數據庫也非常重要。目前本土基因數據庫的物種覆蓋度仍然較低，使用已有的本土數據庫進行研究時，存在無法檢測到一些物種的信息的情況[56]。與DNA相比，以12S rRNA作為靶向基因可以獲得更準確的鑒定結果，但在全球范圍內，以12S rRNA為主的數據庫嚴重缺乏，未來需在不斷完善DNA序列數據庫的同時建立以12S rRNA為主的基因參考數據庫。

5.3" eDNA的假陽性和假陰性

應用eDNA技術檢測時，常面臨假陰性和假陽性問題。假陰性指的是目標物種DNA實際存在于樣品中，卻未能檢出；假陽性則指檢測出取樣環境中并不存在的物種或已經死亡的物種[56]。

導致假陰性的原因有多種可能：1）目標物種在樣品中的eDNA濃度過低，沒有達到檢測下限閾值，特別是低豐度物種在樣品中的eDNA濃度較低，很可能無法檢測到[57]；2）樣品本身的理化特性可能對PCR擴增產生抑制作用，影響目標物種的檢測結果[58]；3）引物的通用性和分辨率也可能影響檢測的準確性，如果引物選擇不當或低通用性，可能導致一些物種被遺漏或誤檢[59]。此外，PCR擴增本身具有一定的隨機性，即使是同一個樣本，在多次平行擴增實驗中所得到的結果可能不盡相同。使用高清晰引物及多點位序列分析（Multilocus Sequence Typing）的方法可增加eDNA檢測效率。導致假陽性的原因主要是樣品污染，樣品之間污染或外源污染導致檢測結果不準確，在實驗檢測中注意操作規范，避免樣品污染。

5.4" eDNA采集地點和時間的不確定性

eDNA分布存在空間和時間的不確定性。在不同類型環境中，eDNA擴散的距離可能差異較大。在靜水水域，水生動物的活動區域相對固定，eDNA擴散范圍也相對有限[60]；而在溪流等流動水體中，eDNA可能擴散較遠，如一條河流中瀕危蛙類的eDNA可以在下游20 km外的地方被檢測到[61]。在動態生態系統中，如流水、強風及活動范圍大的生物，eDNA的擴散能力強，可能導致在不同環境中的研究結果存在較大差異。eDNA濃度也受季節影響，尤其是在繁殖季節期間及雄性競爭、配子釋放等行為活動增加時，會導致eDNA濃度和檢出率的提高[62]，而不同水生動物的交配季節存在差異。有研究指出兩棲動物的eDNA同樣受到季節的影響，Godwin等[63]對兩種瀕危兩棲爬行動物的研究中發現，它們所釋放的eDNA濃度與不同時間的活動強度呈正相關。因此，充分了解目標物種的生活史和行為特征對確定合適的取樣時間、提高eDNA檢出效果非常重要，否則檢出結果可能存在較大誤差。

隨著eDNA技術的不斷發展，如新的測序技術可以允許更長的trnL片段被測序，進一步提高分辨率與降低成本，以及現有不足的不斷改進和完善，eDNA技術將會在生物多樣性監測中得到廣泛推廣應用。

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（責任編輯：敬廷桃）