水稻對羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因(OsHPPD)位點突變對OsHPPD活性以及硝磺草酮抗性的影響

摘要：為明確水稻對羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因（OsHPPD）位點突變對OsHPPD活性及硝磺草酮抗性的影響，以日本晴水稻為材料，克隆獲得OsHPPD，并與玉米、擬南芥、熒光假單胞菌以及燕麥的HPPD進行BLAST比對，分析不同來源的HPPD蛋白序列，確定擬突變的氨基酸位點。再利用重疊PCR對OsHPPD上的12個氨基酸進行定點突變，獲得14個OsHPPD突變體。對OsHPPD以及突變體蛋白進行體外原核表達，利用比色法測定突變體蛋白酶的相對活性以及對硝磺草酮的相對抗性。結果表明，V224I位點突變后較OsHPPD相對抗性增強14百分點，V224I位點突變后OsHPPD催化位點發生改變，導致OsHPPD的相對活性和對硝磺草酮的抗性增強，這對研制耐HPPD除草劑的種質資源、培育抗除草劑水稻新品種均具有重要作用。

關鍵詞：OsHPPD；位點突變；相對活性；硝磺草酮；相對抗性

中圖分類號：S451.21" 文獻標志碼：A" 文章編號：1003-935X（2024）03-0042-09

Influention of p-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase from Oryza sativa （OsHPPD） Gene on Activity of OsHPPD and Resistance of Mesotrione

JIN Man^1，2，CHEN Lei2，LIU Zhihong1，CHEN Min1，TANG Xiaoyan2，YANG Xiaohuai1

（1.Shenzhen Agricultural Technology Promotion Center，Shenzhen 518040，China；2.Shenzhen Institute of Molecular Crop Design，Shenzhen 518110，China）

Abstract：This study aimed to clarify influence of p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from Oryza sativa （OsHPPD） gene on activity of OsHPPD and resistance of mesotrione. OsHPPD was cloned from O. sativa ‘Nipponbar’，and then OsHPPD was compared with HPPD of Zea mays，Arabidopsis thaliana，Pseudomonas fluorescein and Avena sativa by BLAST. We analyzed HPPD protein sequences from different species to determine the amino acid sites to be mutated. Using overlapping PCR，12 amino acids in OsHPPD were subjected to site directed mutagenesis，resulting in 14 OsHPPDmutants. OsHPPD and its mutants were expressed in prokaryotic cells in vitro. Then relative activity of HPPD enzyme and relative resistance to mesotrione were determined by colorimetry. The results showed that relative resistance was enhanced 14 percentage points after V224I site mutation. The site mutation changed the catalytic site of OsHPPD，which resulted in the enhanced relative activity of OsHPPD and relative resistance to mesotrione. This site mutation is of great significance for the development of HPPD-tolerant germplasm resources and new herbicide-resistant rice variety.

Key words：OsHPPD；site mutation；relative activity；mesotrione；relative resistance

收稿日期：2024-04-01

基金項目：深圳市科技計劃（編號：JCYJ20230807145759008）；國家自然科學基金（編號：31901532）。

作者簡介：金 曼（1989—），女，江蘇宜興人，博士，高級農藝師，主要從事除草劑抗性機制和農作物種質資源研究。E-mail：79342771@qq.com。

通信作者：唐曉艷，博士，教授，主要從事作物育種研究，E-mail：txy@frontier-ag.com；楊曉懷，碩士，高級農藝師，主要從事農作物種質資源研究，E-mail：35398385@qq.com。

對羥苯基丙酮酸雙氧化酶（HPPD）廣泛存在于各種有機體內，催化生物體內對羥苯基丙酮酸（HPP）形成尿黑酸（HGA）的反應^［1］，是植物體中質體醌和生育酚生物合成途徑的關鍵酶。當其活性受到抑制時，植物類胡蘿卜素生物合成途徑中最終電子受體以及光合鏈電子傳遞體質體醌的生物合成受阻，進而導致類胡蘿卜素合成減少，光合鏈電子傳遞受阻，使得植物體出現白化癥狀并導致植物死亡^［2-3］。HPPD抑制劑類除草劑主要用于玉米、甘蔗、高粱等作物田中闊葉雜草和禾本科雜草的防治^［4］，主要包括異唑酮類、三酮類、比唑酮類等除草劑，具有高效、低毒、安全性好、不易產生抗藥性等優點^［4］。據統計，2019年銷售額超1億美元的HPPD抑制劑類除草劑有4個，分別為硝磺草酮、異唑草酮、環磺酮、苯唑草酮^［4］。HPPD抑制劑類除草劑都是通過一個和底物HPP相似的1，3-二羰基模序與Fe²⁺活性區域發生螯合作用，從而產生競爭性的抑制作用。具體來說，HPPD抑制劑類除草劑與植物HPPD的C端Fe²⁺相結合，其羰基氧與活性部位的Fe²⁺發生雙齒配位作用，其苯環與活性位點的苯丙氨酸發生堆積作用，從而與HPPD形成緊密的復合體^［5-6］，進而抑制HPPD催化HPP向HGA的轉化，間接抑制類胡蘿卜素的生物合成，從而導致植物白化死亡。研究表明，不同種屬來源的HPPD活性區域氨基酸殘基存在一定的差異，這在一定程度上會影響抑制劑與HPPD結合的穩定性，導致抑制劑分子對不同氨基酸序列的HPPD抑制活性有所不同^［3］，即在HPPD活性區域氨基酸殘基的差異造成催化活性區域蛋白構象發生改變，導致其對HPPD抑制劑類除草劑的敏感性不同，從而對HPPD抑制劑類除草劑產生一定的抗性。

研究發現，轉熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）HPPD基因的煙草、大豆對異唑草酮具有一定的抗性，但抗性較弱。為了增強這一抗性，對熒光假單胞菌的HPPD進行突變，篩選出P336W位點的突變體，轉入煙草、大豆后大大提高其對異唑草酮的抗性^［7］。經HPPD抑制劑類除草劑篩選獲得具有高度抗性并保持HPPD活性的銅綠假單胞菌，將其HPPD分別轉化擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa），轉化后的擬南芥和水稻均表現出對異唑草酮（一種HPPD抑制劑類除草劑）的高度抗性^［8］。已報道的植物HPPD鮮有對HPPD抑制劑類除草劑表現出高度抗性。燕麥（Avena sativa）HPPD（AvHPPD-03）與硝磺草酮和異唑草酮等HPPD抑制劑類除草劑表現出低親和力，燕麥對HPPD抑制劑類除草劑不敏感^［9］。在煙草中過表達燕麥4個位點（V218I、A327R、I340E、L359M）突變后的AvHPPD可增強煙草對硝磺草酮的抗性^［9］。對黃連（Coptics japonica）的研究發現，黃連培養細胞在含有HPPD抑制劑類除草劑DTP的培養基中生長良好，重組蛋白的體外生化分析表明，這種現象的產生是由于黃連的HPPD對DTP具有一定的抗性，黃連HPPD蛋白的米氏常數（Km值）遠高于其他植物HPPD蛋白的Km值^［10］。此外，對黃連HPPD進行定點突變，其突變后的蛋白抗性與活性均有不同程度的改變。

目前，在水稻中對抗HPPD抑制劑類除草劑靶標基因HPPD的研究并不多，對已知的位點改變后可以產生抗性的報道也很少。因此，本研究通過對OsHPPD上12個氨基酸位點進行突變，從而改變OsHPPD蛋白構象，進而引發水稻對HPPD抑制劑類除草劑抗性的提高，為研發抗HPPD抑制劑類除草劑的水稻提供有效的氨基酸突變位點，并為解析水稻HPPD抗性機制以及開發研制抗HPPD抑制劑類除草劑水稻提供理論依據。

1 材料與方法

本試驗于2019年3月至2020年12月在深圳市作物分子設計育種研究院實驗室中開展。

1.1 試驗材料

1.1.1 水稻對羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因（OsHPPD）

水稻對羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因號為LOC Os02g07160，本試驗以日本晴野生型OsHPPD作為突變體相對活性和相對抗性檢測的對照。水稻品種為日本晴，由深圳市作物分子設計育種研究院保存。

1.1.2 載體及菌株

原核表達載體pMAL-c5x，由深圳市作物分子設計育種研究院保存；大腸桿菌感受態BL21菌株，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3 主要試劑

無縫克隆試劑盒In-Fusion HD Cloning Kit以及異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），購自寶日醫生物技術有限公司（TaKaRa）；PCR酶KOD FX，購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；硝磺草酮（mesotrione，MST），購自于上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.4 試劑配制

LB培養液配制：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值調節至7.0。

10 mmol/L硝磺草酮（MST）母液配制：稱取 34 mg MST，用1 mL二甲基亞砜（DMSO）充分溶解，無菌水充分混勻后定容至10 mL，以1 mL/份用移液槍分裝保存于-20 ℃。根據試驗需要用LB培養液將10 mmol/L硝磺草酮母液稀釋至0.1、0.2、0.5、1 μmol/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 OsHPPD基因克隆

以水稻苗期葉片為材料，用Trizol法提取總RNA，反轉錄獲得cDNA。在水稻數據庫中搜尋OsHPPD堿基序列（LOC Os02g07160），設計引物（表1），以水稻葉片cDNA為模板進行PCR擴增，克隆獲得OsHPPD基因。反應體系（30 μL）：cDNA 1 μL（1 μg），上下游引物各1 μL（10 μmol/L），2×Taq PCR Master Mix 15 μL（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，500 μmol/L dNTP each，0.1 U/μL），Taq聚合酶ddH2O 12 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經回收用無縫克隆連接酶（In-fusion酶）連接至pMAL-c5x蛋白原核表達載體中。

1.2.2 OsHPPD位點突變

為了創制蛋白突變體，從而提高作物蛋白的活性和抗性，并根據前人研究結果^［7，9］對特定的氨基酸位點進行定點突變。將水稻、燕麥、玉米、擬南芥以及熒光假單胞菌的OsHPPD蛋白序列進行多序列比對，擬定V224I、A333R、R346E、L365M、C413Y、G414D、G414S、G415K、G415R、K418E、S422K、E423A、K426E、Y431D突變位點，在OsHPPD基因擬突變的位點處設計相應的引物（表1），通過重疊PCR技術對OsHPPD進行定點突變，將野生型和突變后的序列用In-fusion酶連接至pMAL-c5x蛋白原核表達載體中，并通過測序對突變位點的堿基加以驗證。引物合成和測序均由深圳華大基因股份有限公司完成。

1.2.3 OsHPPD蛋白誘導表達

將含有OsHPPD以及OsHPPD突變體序列的pMAL-c5x載體轉化至大腸桿菌菌株BL21中，挑取陽性克隆，在含 50 μg/mL 氨芐霉素的LB液體培養基中培養菌體。當吸光度D600 nm值為0.6～0.8時，添加終濃度為1 mmol/L的IPTG，從而誘導OsHPPD以及突變體蛋白的表達。

1.2.4 OsHPPD突變體相對活性測定

HPPD能催化對羥苯基丙酮酸（HPP）轉化為尿黑酸（HGA），尿黑酸暴露在氧氣中時發生氧化聚合形成一種褐色素——膿黑素，可用比色法測定膿黑素的含量。酪氨酸（Tyr）代謝生成HPP，因此在誘導表達后的液體培養基中添加底物酪氨酸，在OsHPPD蛋白酶的催化下發酵產生膿黑素，呈褐色。用膿黑素產生的量表征OsHPPD以及OsHPPD突變體的相對活性。將OsHPPD以及V224I、A333R、R346E、L365M、C413Y、G414D、G414S、G415K、G415R、K418E、S422K、E423A、K426E、Y431D 等14個突變體菌液離心，取上清液，以pMAL-c5x空載體菌液上清作為空白對照，在 400 nm 處測定上清液吸光度D400 nm，若所測上清液的吸光度超過分光光度計的量程1，則將上清液稀釋2倍后重新測定，直至所測上清液的吸光度小于分光光度計的量程1，上清液實際D400 nm=讀數×稀釋倍數。將野生型OsHPPD菌液上清的吸光度D400 nm值設為100%，以膿黑素產生的相對量對各個突變的OsHPPD酶活性進行標準化^［11］。相對活性=突變體 OsHPPD 的D400 nm/野生型OsHPPD的 D400 nm×100%。

1.2.5 MST對OsHPPD抑制效果的測定

在誘導表達后的液體培養基中添加底物酪氨酸（Tyr）以及終濃度為0、0.1、0.2、0.5、1 μmol/L的硝磺草酮（MST）；繼續發酵培養，觀察菌液的顏色變化，離心取上清液，在400nm處測定未添加MST菌液上清液的吸光度D400 nm，iD400 nm為加入MST抑制劑后在400 nm處的吸光度，以pMAL-c5x空載體作為空白對照。通過D400 nm值以及iD400 nm值計算結合率和抑制率，結合率=iD400 nm/D400 nm×100%，抑制率=（1-結合率）×100%。結合率指酪氨酸和OsHPPD蛋白的結合能力，抑制率指添加硝磺草酮后對酪氨酸與OsHPPD蛋白結合的抑制能力。通過SPSS計算獲得硝磺草酮半抑制濃度（IC50）值，半抑制濃度即抑制Tyr與OsHPPD結合50%時MST的濃度。

1.2.6 OsHPPD突變體相對抗性測定

在液體培養基中添加底物酪氨酸（Tyr），以及終濃度為IC50值的MST，抑制OsHPPD蛋白酶的活性；以空載作為空白對照，以吸光度表征色素產生的相對量，代表突變體蛋白對MST的抗性強弱^［11］。相對抗性性=突變體OsHPPD的 iD400 nm/野生型OsHPPD的iD400 nm×100%。

1.2.7 OsHPPD及其突變體蛋白理化性質分析

通過Protparam預測OsHPPD以及定點突變后的蛋白理化性質，這些蛋白理化性質主要包括：相對分子質量，是指各原子的相對原子質量總和，表示蛋白相對分子質量的大小，反映氨基酸位點突變后分子量的變化。理論等電點（pI），是指蛋白呈電中性狀態的pH值，表征蛋白所帶電荷性質。不穩定系數（instability index，II），表征蛋白的穩定性，不穩定系數越小，表明該蛋白越穩定，反之，不穩定系數越大，則表示該蛋白越不穩定。總平均親水性（grand average of hydropathicity，GRAVY），表征蛋白的親疏水性，通過序列中每個氨基酸殘基的親水性來計算：GRAVY值=∑GRAVYn，式中：∑GRAVY值代表蛋白序列中每個氨基酸GRAVY值的總和；n代表蛋白質序列的長度（即氨基酸個數）；如果GRAVY值＜0，表示該蛋白為親水蛋白，如果GRAVY值＞0，表示該蛋白為疏水蛋白^［12-13］。

1.3 數據處理與分析

利用Clustal X2序列比對軟件對水稻、燕麥、玉米、擬南芥以及熒光假單胞菌的HPPD蛋白序列進行多序列比對。通過SPSS中Probit模型計算獲得硝磺草酮半抑制濃度（IC50）值。通過Protparam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）對OsHPPD以及定點突變后的蛋白理化性質進行預測。

2 結果與分析

2.1 OsHPPD及突變序列原核表達載體構建

根據水稻對羥苯基丙酮酸雙氧化酶基因序列（LOC Os02g07160）以及pMAL-c5x載體序列，選擇限制性內切酶NdeⅠ以及EcoRⅠ酶切位點，設計In-fusion無縫克隆引物（表1），通過PCR擴增和In-fusion連接，構建獲得OsHPPD原核表達載體OsHPPD-pMAL-c5x以及OsHPPD突變體表達載體。

2.2 MST對OsHPPD具有抑制作用

于0 ℃搖培養箱振蕩培養含有OsHPPD-pMAL-c5x的BL21大腸桿菌菌株，不添加硝磺草酮的液體培養液呈現出棕褐色（圖1），說明Tyr在OsHPPD蛋白酶的催化下生成了膿黑素，可見OsHPPD具有催化能力。添加不同濃度硝磺草酮后，培養液顏色隨硝磺草酮濃度的增加而變淺，說明隨著硝磺草酮濃度的增加，對OsHPPD競爭性的抑制作用增強，抑制了膿黑素的生成，導致培養液顏色變淺、吸光度下降，數值由2.80下降為0.04（圖1、表2）。

由表2可知，隨著MST濃度增加，MST對OsHPPD蛋白酶催化能力的抑制先快后慢，最終達到飽和。當MST濃度為0.1 μmol/L時，OsHPPD與底物HPP的結合率為49%；當MST濃度為 1.0 μmol/L 時，OsHPPD與底物的結合率僅1%。OsHPPD與底物HPP的結合受到MST的抑制。用SPSS處理試驗數據，結果顯示，OsHPPD對硝磺草酮的IC50值約為0.075 μmol/L，濃度區間范圍為0.016～0.134 μmol/L。

2.3 OsHPPD擬突變位點突變分析

將水稻、玉米、擬南芥以及熒光假單胞菌HPPD蛋白H11結構域的氨基酸進行同源比對，對水稻H11結構上的C413Y、G414D、G414S、G415K、G415R、K418E、S422K、E423A、K426E、Y431D位點進行定點突變（圖2）。通過氨基酸序列比對，將燕麥的4個位點對應至水稻OsHPPD蛋白序列中，對水稻V224I、A333R、R346E、L365M進行定點突變（圖3）。

對OsHPPD以及定點突變后蛋白理化性質的預測結果（表3）表明，單一位點氨基酸的突變對OsHPPD的理化性質并沒有引起很大的改變。OsHPPD蛋白等電點為5.32，單一位點突變后，等電點變化范圍在5.19～5.39之內。V224I、K426E和Y431D單一位點突變后，不穩定系數大于42，較OsHPPD蛋白穩定性減弱；R346E、G415K和S422K單一位點突變后，不穩定系數小于41，較OsHPPD蛋白穩定性增強。在總平均親水性方面，各單一位點突變后略有變化，但整體上均小于0，均為親水蛋白，表明位點突變后蛋白整體的親水性并沒有發生改變。

2.4 OsHPPD位點突變后對相對活性與相對抗性的影響

各單一位點突變后，對OsHPPD突變體蛋白酶的相對活性以及對硝磺草酮的相對抗性進行測定（表4），發現V224I、A333R、K418E位點突變后，突變體蛋白酶相對活性略有降低，分別降低10、8、

4百分點；其余位點突變后相對活性大大降低，其中G414D、S422K、E423A、Y431D位點突變后，其突變體蛋白酶的相對活性僅為野生型的10%、15%、7%、5%。在液體培養基中加入0.1 μmol/L硝磺草酮抑制劑后，V224I位點突變后，對硝磺草酮的相對抗性較野生型增強14百分點；A333R位點突變后，其相對抗性無明顯變化，為野生型的97%；其余位點突變后相對抗性都發生不同程度的降低，表現出對硝磺草酮抑制劑的敏感特性。說明單一位點突變后，改變了蛋白的催化活性區域構象，導致其突變體蛋白酶的相對活性以及對硝磺草酮相對抗性發生不同程度的變化。

3 討論與結論

硝磺草酮是一種HPPD抑制劑類除草劑，可以有效防除多種闊葉雜草和禾本科雜草，具有作物（玉米、高粱、甘蔗等）安全性高以及環境相容性好等優勢，并且與乙酰乳酸合成酶抑制劑類等除草劑無交互抗性^［14-16］。常規栽培稻對硝磺草酮極為敏感，噴施硝磺草酮會導致水稻苗白化死亡。如果在水稻種植時，將硝磺草酮與抗性水稻配套使用，可有效殺滅稻田中的惡性雜草，尤其是雜草稻，同時解決現有抗性水稻（如抗咪唑啉酮類水稻）的農藥殘留對后茬作物的影響以及抗性雜草（如抗咪唑啉酮、ACCase抑制劑類雜草）的問題。目前由于水稻OsHPPD基因位點突變而對HPPD抑制劑類除草劑產生抗性的報道并不多見。因此，解析水稻對硝磺草酮產生抗性的分子機制，從而開發獲得抗性水稻，具有重要意義。

熒光假單胞菌的HPPD蛋白晶體結構是第1個被報道的、通過X射線晶體衍射法得到的HPPD類蛋白晶體^［17］，隨后擬南芥和玉米的HPPD蛋白晶體相繼被報道^［18-19］。通過對熒光假單胞菌、擬南芥以及玉米的HPPD蛋白晶體結構進行研究，發現在蛋白C端作為活性位點的門控區域的α螺旋H11并非保持開放狀態，可作為屏障將活性位點與溶劑隔離。α螺旋H11可以繞著作為軸點的Asn-416的α碳原子旋轉，形成開閉構象^［18］。當處于開放構象時，則有利于底物HPP進入到催化位點以及產物的釋放；而處于閉合構象時，則有利于保護催化反應免受溶劑的影響^［20］。在HPPD蛋白構象閉合時，α螺旋 H11上Phe-421、Leu-420、Ile-424以及Tyr-427等氨基酸殘基起重要作用。在活性位點區域的一側，α螺旋 H8與之前的氨基酸殘基形成穩定的邊界，確保α螺旋 H11可以往復形成開放與閉合的構象；在活性位點區域的另一側，則由結構更為靈活的部分組成旋轉區域連接B3和C3的β折疊^［18］。這些區域以及氨基酸位點對活性區域構象的開放和閉合至關重要，而活性區域構象的開放和閉合影響底物如HPP（或抑制劑如MST）與酶的親和能力。

本研究通過對水稻HPPD蛋白C端門控區域的α螺旋H11序列上的12個氨基酸位點進行定點突變，發現OsHPPD的14個位點突變體中除了V224I位點，其余位點突變體活性和抗性與野生型相比均降低，說明H11序列上氨基酸對OsHPPD蛋白酶相對活性很重要性。當位點突變后，OsHPPD構象發生改變，底物HPP進入活性區域與Fe²⁺結合能力變弱，導致突變體OsHPPD蛋白酶相對活性下降。V224I位點突變后，其蛋白酶對硝磺草酮的相對抗性較野生型OsHPPD增強14百分點，可能是由于V224I位點突變后，空間位組發生改變，阻礙了硝磺草酮與Fe²⁺結合，這在一定程度上提高了OsHPPD對硝磺草酮的抗性能力。后續仍需繼續發掘新的抗性位點，將多個單一突變變位點相互結合起來，研發HPPD活性強、對硝磺草酮抗性強的突變體。本研究為開發抗除草劑水稻新品種提供了理論依據與技術支撐，解決了現有抗除草劑水稻帶來的交互抗性、對后茬作物生長影響等問題。

參考文獻：

［1］Moran G R. 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics，2005，433（1）：117-128.

［2］Ndikuryayo F，Moosavi B，Yang W C，et al. 4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitors：from chemical biology to agrochemicals［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2017，65（39）：8523-8537.

［3］何 波，王大偉，楊文超，等. 對羥基苯丙酮酸雙加氧酶（HPPD）的結構及其吡唑類除草劑的最新研究進展［J］. 有機化學，2017，37（11）：2895-2904.

［4］柏亞羅. HPPD抑制劑類除草劑的產品研發及市場概況［J］. 世界農藥，2021，43（5）：1-13，56.

［5］Neidig M L，Decker A，Kavana M，et al. Spectroscopic and computational studies of NTBC bound to the non-heme iron enzyme （4-hydroxyphenyl） pyruvate dioxygenase：active site contributions to drug inhibition［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，338（1）：206-214.

［6］Siehl D L，Tao Y M，Albert H，et al. Broad 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitor herbicide tolerance in soybean with an optimized enzyme and expression cassette［J］. Plant Physiology，2014，166（3）：1162-1176.

［7］Dreesen R，Capt A，Oberdoerfer R，et al. Characterization and safety evaluation of HPPD W336，a modified 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase protein，and the impact of its expression on plant metabolism in herbicide-tolerant MST-FG72-2 soybean［J］. Regulatory Toxicology and Pharmacology，2018，97：170-185.

［8］徐海英，何 峰，初 宇，等. 一種來源于銅綠假單胞菌的抗HPPD抑制劑基因及其應用：CN105543245A［P］. 2016-05-04.

［9］Hawkes T R，Langford M P，Viner R，et al. Characterization of 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenases，inhibition by herbicides and engineering for herbicide tolerance in crops［J］. Pesticide Biochemistry and Physiology，2019，156：9-28.

［10］Liang Y L，Minami H，Sato F.Isolation of herbicide-resistant 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from cultured Coptis japonica cells［J］. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2008，72（11）：3059-3062.

［11］姚紅寶. 黃連hppd基因在E.coli中表達產褐色素研究［D］. 保定：河北大學，2010.

［12］田祥瑞，徐夢彬，王 飛，等. 千金子葉綠體基因組的結構及特征分析［Ｊ］. 雜草學報，2022，40（2）：6-14.

［13］Kyte J，Doolittle R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein［J］. Journal of Molecular Biology，1982，157（1）：105-132.

［14］Ahrens H，Lange G，Müller T，et al. 4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitors in combination with safeners：solutions for modern and sustainable agriculture［J］. Angewandte Chemie，2013，52（36）：9388-9398.

［15］Beaudegnies R，Edmunds A J F，Fraser T E M，et al. Herbicidal 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitors：a review of the triketone chemistry story from a Syngenta perspective［J］. Bioorganic amp; Medicinal Chemistry，2009，17（12）：4134-4152.

［16］Wang D W，Lin H Y，Cao R J，et al. Synthesis and herbicidal activity of triketone-quinoline hybrids as novel 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitors［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2015，63（23）：5587-5596.

［17］Serre L，Sailland A，Sy D，et al. Crystal structure of Pseudomonas fluorescens 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase：an enzyme involved in the tyrosine degradation pathway［J］. Structure，1999，7（8）：977-988.

［18］Fritze I M，Linden L，Freigang J，et al. The crystal structures of Zea mays and Arabidopsis 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase［J］. Plant Physiology，2004，134（4）：1388-1400.

［19］Yang C，Pflugrath J W，Camper D L，et al. Structural basis for herbicidal inhibitor selectivity revealed by comparison of crystal structures of plant and mammalian 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenases［J］. Biochemistry，2004，43（32）：10414-10423.

［20］林 軍，李祖光，鄒建衛，等. 基于HPPD靶標酶的分子對接研究［J］. 化學學報，2012，70（11）：1309-1314.