基于氫氧化鈣為中和劑的大腸桿菌丁二酸發酵

摘要：氫氧化鈣因其價格相對低廉且與其配套的有機酸分離純化工藝成熟，常作為中和劑應用于有機酸發酵中。但在丁二酸發酵中，因其不能提供丁二酸合成所必需的二氧化碳，存在發酵產量低的問題。文章建立并優化了以氫氧化鈣為中和劑結合二氧化碳脈沖補料發酵生產丁二酸的方法。發酵初期不添加中和劑，pH值自然下降至5.7時，立即流加23%氫氧化鈣溶液使pH值升至7.5，然后停止添加中和劑，通入0.2 m3/（m3·min）二氧化碳氣體至pH值降至6.5時停止通氣使發酵液自然發酵，當pH值下降至5.7時，再循環上述操作。使用該方法時，發酵產量為88.47 g/L，糖酸轉化率為96.03%，平均生產強度為2.21 g/（L·h），相較于以氫氧化鈣為中和劑不補入或者連續通入二氧化碳的方式，糖酸轉化率分別提高了298%和95%。該方法為解決使用氫氧化鈣作中和劑發酵丁二酸產量低的問題提供了新思路，也為利用現有有機酸分離設備大規模生產丁二酸打下了良好基礎。

關鍵詞：大腸桿菌；丁二酸；氫氧化鈣；二氧化碳；中和劑

中圖分類號：TS201.1 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）10-0009-05

Succinic Acid Fermentation by Escherichia coli Based on

Calcium Hydroxide as Neutralizing Agent

CHEN Si-yu1， SUN Rui-xue1， BAO Chen-peng1， WANG Jin-hua1，2，3，

GAO Wa1，2，3， WANG Yong-ze1，2，3*

（1.School of Biotechnology and Food， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China;

2.Key Laboratory of Fermentation Engineering， Ministry of Education， Hubei University

of Technology， Wuhan 430068， China; 3.Industrial Fermentation Collaborative

Innovation Center Co-constructed by Province and Ministry of Education，

Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： Calcium hydroxide is often used as neutralizing agent in the fermentation of organic acids due to its relatively low price and mature matched organic acid separation and purification process. However， in the fermentation of succinic acid， there is a problem of low fermentation yield due to its inability to provide the necessary carbon dioxide for succinic acid synthesis. In this paper， with calcium hydroxide as the neutralizing agent， combined with carbon dioxide pulse feed fermentation， a method for producing succinic acid is established and optimized. When no neutralizing agent is added in the initial stage of fermentation to naturally lower the pH value to 5.7， 23% calcium hydroxide solution is immediately added to raise the pH value to 7.5.Then stop adding neutralizing agent， 0.2 m3/（m3·min） carbon dioxide gas is introduced until the pH value drops to 6.5， and stop ventilation to make the fermentation broth naturally ferment. When the pH value drops to 5.7， repeat the above operation. Using this method， the fermentation yield， sugar acid conversion rate， average production intensity are 88.47 g/L， 96.03% and 2.21 g/（L·h） respectively. The sugar acid conversion rate increases by 298% and 95% respectively

compared" to using calcium hydroxide as neutralizing agent， without adding or continuously introducing carbon dioxide. This" method has provided a new approach to solve the problem of low yield of succinic acid fermentation using calcium hydroxide as neutralizing agent， and also laid a good foundation for the large-scale production of succinic acid using existing organic acid separation equipment.

Key words： Escherichia coli; succinic acid; calcium hydroxide; carbon dioxide; neutralizing agent

丁二酸（succinic acid）又被稱為琥珀酸，是一種重要的四碳二羧酸，廣泛應用于食品、醫藥、農業和化學等領域[1]。在醫藥行業中，丁二酸可用于合成維生素和抗生素等保健品[2]。而在食品加工行業中，丁二酸的應用更廣泛，首先，由于丁二酸具有獨特的貝類風味，故可被制成我國食品添加劑中唯一許可使用的有機酸類鮮味劑——丁二酸二鈉（干貝素），可用于增強肉制品和海鮮制品的鮮味，是醬料、方便面、奶制品和膨化食品等食品中鮮味的主要來源[3-4]，丁二酸鈉鹽還可用作強化劑增強餅干等食品的韌性[2]；其次，丁二酸在啤酒、醋、醬油等產品中也發揮著重要的風味作用[5-7]，此外，丁二酸衍生物辛烯基琥珀酸酯可用作乳化增稠劑增加色拉油調味品的穩定性[8]。

目前發酵法是丁二酸生產的主要方式[9]，而二氧化碳含量和發酵液pH值是影響丁二酸發酵的關鍵因素[10]，因此在發酵過程中常通過添加碳酸鹽的方法，在提供二氧化碳的同時維持發酵液pH的穩定。碳酸鎂被普遍認為是最能提高丁二酸產量的中和劑[11-12]，但是由于碳酸鎂價格昂貴且鎂離子在后續丁二酸分離工藝中難以被去除，最終使丁二酸的生產成本居高[13]，因此碳酸鎂不適用于丁二酸的大規模工業化生產。與碳酸鎂相比，氫氧化鈣作為傳統的有機酸發酵中和劑，不但成本較低，而且發酵液中的鈣離子可以轉化為硫酸鈣沉淀去除，成為很多有機酸發酵工廠首選的中和劑，成熟的配套工藝大大降低了有機酸的發酵成本。

只使用氫氧化鈣作為中和劑會導致丁二酸發酵產量極低，這與用氫氧化鈣作為中和劑不能提供丁二酸合成所需的二氧化碳有關。使用碳酸鈣作為中和劑似乎能解決這個問題，但我們又發現碳酸鈣堿性太弱，對發酵液pH無法實現很好的控制。使用氫氧化鈣作為中和劑時持續補入二氧化碳的方法看起來是一種較合理的解決方案，但實際發酵時卻發現發酵液中有大量沉淀生成，發酵液持續酸化，丁二酸產量仍然較低。

本文擬建立以氫氧化鈣為中和劑結合二氧化碳脈沖補料發酵生產丁二酸的方法，將氫氧化鈣和二氧化碳交替以脈沖方式補入發酵液中，期望達到更好的發酵液pH控制和二氧化碳補充的效果，從而達到以氫氧化鈣為中和劑時也能高產丁二酸的目的，進而降低丁二酸的生產成本，為利用現有成熟的有機酸發酵及分離純化設備大規模生產丁二酸打下了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）WS100[14]：由本實驗室構建并保存。

1.1.2 試劑

酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、十二水磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、葡萄糖、丁二酸、氫氧化鈣（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；碳酸鎂：上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.1.3 培養基

一級種子培養基：葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，固體培養基添加瓊脂粉18 g/L，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

二級種子培養基：葡萄糖40 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，十二水硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.14 g/L，硫酸銨0.3 g/L，十二水磷酸氫二鉀0.9 g/L，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

發酵培養基：葡萄糖80 g/L，玉米漿干粉3 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，十二水硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.14 g/L，硫酸銨0.3 g/L，十二水磷酸氫二鉀0.9 g/L，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

1.2 主要儀器與設備

ZWY-2102C恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；Waters-e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；DNP-9022電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；SBA-40D型生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；SW-CJ-2FB超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司；37070發酵罐 Sartorius Stedim Biotech GmbH。

1.3 方法

1.3.1 培養條件及方法

一級種子培養方法：將保存在－80 ℃冰箱中的菌種在LB固體培養基上劃線培養，在平板上挑選單菌落接種至250 mL三角瓶裝液量為50 mL的LB液體培養基中活化菌種，40 ℃ 200 r/min培養10～12 h。

二級種子培養方法：將一級種子液以5%接種量接種至二級種子培養基中，40 ℃ 200 r/min恒溫振蕩培養24 h至發酵液OD600 nm值為15左右，以此作為二級種子液。

發酵罐培養方法[15]：按照10%接種量將二級種子液接種到發酵罐培養液（裝液量4 L）中，全程恒溫40 ℃，攪拌轉速300 r/min。發酵培養基中初始添加葡萄糖80 g/L，以23%氫氧化鈣作為中和劑。發酵罐培養的初期階段不流加氫氧化鈣溶液，使發酵液的pH值自然下降，當pH值下降至5.4～6.0時，立即流加23%氫氧化鈣使發酵液pH值上升至7.0～8.0，停止添加中和劑后，通入二氧化碳氣體0.1～0.6 m3/（m3·min）使pH值下降至6.3～6.7，隨后立即停止通入二氧化碳，使發酵液自然發酵，當pH值自然下降至5.4～6.0時，再流加23%氫氧化鈣，并重復上述操作。發酵過程示意圖見圖1。

1.3.2 檢測方法

OD600 nm值的測定：取1 mL發酵液，使用稀鹽酸按體積比1∶1處理，再用純水稀釋至合適倍數后，用分光光度計測定發酵液在波長600 nm處的吸光度值，即OD600 nm值。

葡萄糖的測定：取1 mL發酵液，10 000 r/min離心2 min后取上清，用純水稀釋至合適倍數后，使用SBA-40D型生物傳感分析儀進行測量。

有機酸含量的測定：用6%的硫酸水溶液按體積比1∶1處理發酵液，靜置數分鐘，以10 000 r/min離心10 min，用超純水稀釋后，用0.22 μm濾膜過濾備用，使用高效液相色譜儀測量發酵液中有機酸的含量。HPLC 條件：色譜柱：Xtimate Sugar-H；流動相：5 mmol/L H2SO4溶液；流速：0.5 mL/min；柱溫：45 ℃；檢測器：PDA；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL。

1.3.3 數據處理

糖酸轉化率（SA）參考張震等[16]的方法，計算公式如下：

SA（%）=ρ×Vm×100%。

式中： ρ為丁二酸濃度（g/L）；V為發酵液總體積（L）；m為總耗糖量（g）。

使用Excel 2010對實驗數據進行整理；使用SPSS 26進行方差分析，Plt;0.05表示有顯著性差異，Plt;0.01表示有極顯著性差異。多重比對采用Duncan法，組間差異用字母法標記；使用Origin 2022作圖。

2 結果與分析

2.1 二氧化碳補入方式的選擇

碳酸鹽可以為丁二酸生產提供不可或缺的二氧化碳，而氫氧化鈣不是碳酸鹽，因此需要在發酵過程中補入二氧化碳。本文對比了3種二氧化碳的補入方式對丁二酸產量和糖酸轉化率的影響：發酵全程不補入；連續補料；以氫氧化鈣溶液結合二氧化碳氣體脈沖補料的方法將整個過程中pH值穩定在6.0～8.0范圍內：當發酵液pH值自然下降至6.0時，流加23%氫氧化鈣溶液至pH值升至8.0，然后停止添加中和劑，通入0.1 m3/（m3·min）二氧化碳氣體使pH值降至6.7時停止通氣使發酵液自然發酵，當pH值下降至6.0時，再循環上述操作，具體結果見表1。

由表1可知，不同的二氧化碳補入方式對丁二酸產量及糖酸轉化率的影響極顯著（Plt;0.01），發酵過程中不通入二氧化碳，僅靠氫氧化鈣調節pH值，得到的丁二酸產量極低，這是因為丁二酸的前體物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）需要固定一分子二氧化碳羧化為草酰乙酸，氫氧化鈣不能提供所需的二氧化碳，因此在不補入二氧化碳的情況下厭氧發酵，幾乎不生產丁二酸，丁二酸產量和糖酸轉化率僅有12.32 g/L和24.14%。

連續補入二氧化碳，丁二酸產量和糖酸轉化率也不高，僅為25.37 g/L和40.33%，但對比不通入二氧化碳的方式，丁二酸產量和糖酸轉化率分別提升了106%和67%。雖然丁二酸產量和糖酸轉化率有所提升，但是仍處于較低水平，這可能是由于二氧化碳連續補入時二氧化碳和氫氧化鈣反應生成碳酸鈣，碳酸鈣堿性較弱，發酵液的pH值難以控制，氫氧化鈣流加量過多，鈣離子濃度過高也會影響菌體的正常生長代謝。

使用氫氧化鈣結合二氧化碳脈沖補料發酵的效果最佳，不僅縮短了總發酵時長，而且丁二酸產量和糖酸轉化率較高，分別為47.45 g/L和83.46%，對比不補入二氧化碳分別提升了285%和246%，對比連續補入二氧化碳分別提升了87%和107%。使用氫氧化鈣結合二氧化碳脈沖補料生產過程中有兩個重要的影響因素，一是脈沖補料過程中，二氧化碳氣體流量及何時停止通氣的問題；二是脈沖補料過程中，何時流加氫氧化鈣及何時停止流加的問題。本研究后續將圍繞這兩個問題，通過調整發酵條件，實現更高的丁二酸產量及糖酸轉化率。

2.2 二氧化碳補料的控制

通過調整二氧化碳補入流量及停止通氣時機兩個方面優化脈沖補料工藝，具體結果見表2。

由表2可知，通過對氣體流量及停止時機的調控，發現二氧化碳的氣體流量對發酵有一定的影響，當氣體流量為0.1 m3/（m3·min），停止通氣時發酵液pH值為6.3時，丁二酸產量和糖酸轉化率最低，僅為39.26 g/L和72.25%。當氣體流量為0.2 m3/（m3·min）時，丁二酸產量和糖酸轉化率上升，但隨著氣體流量的上升，丁二酸產量和糖酸轉化率并沒有相應地提升，可能是由于發酵液中可利用的二氧化碳含量已達到飽和[17]。不同的脈沖補料停止時機得到了不同的發酵結果，當pH值為6.5時停止通氣，丁二酸產量和糖酸轉化率均最高。當氣體流量為0.2 m3/（m3·min），pH值為6.5時停止補料，有最大的丁二酸產量（50.37 g/L）和糖酸轉化率（86.37%）。

2.3 氫氧化鈣脈沖補料時機及停止時機

通過調整氫氧化鈣補料時機及停止時機兩個方面進一步優化了該發酵方法，具體結果見表3。

由表3可知，通過調整不同的氫氧化鈣脈沖補料時機及停止時機可以發現，當pH值自然下降至5.7時再補入氫氧化鈣至pH值為7.5，有最大的丁二酸產量和糖酸轉化率，分別為53.47 g/L和92.46%。當反饋補料pH值為5.4時，所得到的丁二酸產量和糖酸轉化率都較低，可能是因為反饋補料pH值過低，不適宜大腸桿菌的生長，從而影響了丁二酸產量和糖酸轉化率。

2.4 優化條件的驗證

根據對脈沖補料條件的優化，得到優化后的發酵條件為當pH值自然下降至5.7時，流加23%氫氧化鈣至發酵液pH值為7.5，再通入二氧化碳（0.2 m3/（m3·min））至pH值為6.5，停止通氣后使發酵液自然發酵，當pH值降至5.7時再重復此操作。依照此條件，對優化的結果進行了驗證，發酵條件為初始葡萄糖含量80 g/L，當發酵過程中葡萄糖含量低于10 g/L時再補加20 g/L葡萄糖。由圖2可知，發酵40 h結束時，丁二酸產量達到88.47 g/L，糖酸轉化率為96.03%，副產物乙酸產量僅為3.82 g/L，平均生產強度2.21 g/（L·h）。采用優化后的脈沖補料方法，糖酸轉化率比優化前提升了15.06%，相比于不補入或者連續通入二氧化碳的方式，轉化率分別提高了298%和95%。整個過程pH穩定在5.7～7.5范圍內，達到了較好的發酵液pH控制效果。

將優化后的結果與使用不同中和劑（使用本文實驗菌株）和文獻中其他控制發酵液pH和二氧化碳通入方式相比的結果進行了對比，見表4。

由表4可知，無論是丁二酸產量還是糖酸轉化率，優化后的發酵結果均最佳，僅在總發酵時間和平均生產強度上稍遜色于使用碳酸鎂時的發酵結果。然而雖然使用碳酸鎂時平均生產強度較高，但同時副產物乙酸含量也較高，達到4.84 g/L，而本文優化后的方法僅積累3.82 g/L的乙酸。碳酸鎂一直被認為是生產丁二酸的最佳中和劑[11-12]，但是由于其本身價格昂貴，且鎂離子對后續分離提取工藝有影響，使生產成本過高，因此不適用于工業化生產。而使用氫氧化鈣作為中和劑，發酵結束后可以使用成熟的鈣鹽法[18]進行分離提取，并且氫氧化鈣價格相對低廉，較適用于丁二酸的工業化生產。通過對比可以得出，優化后的脈沖補料方法不僅提高了丁二酸產量及糖酸轉化率，而且縮短了總發酵時間，提升了平均生產強度，副產物乙酸的產量也有所降低。

3 結論

本文建立了以氫氧化鈣為中和劑結合二氧化碳脈沖補料發酵生產丁二酸的方法。相比于以氫氧化鈣為中和劑不補入或者連續通入二氧化碳的方式，轉化率分別提高了298%和95%。

對脈沖補料法進一步優化，優化后的工藝將整個發酵過程pH值穩定在5.7～7.5范圍內，達到了較好的發酵液pH值控制效果。脈沖補料法優化后的工藝為發酵初期不添加中和劑使pH值自然下降至5.7時，立即流加23%氫氧化鈣溶液至pH值升至7.5，然后停止添加中和劑，通入0.2 m3/（m3·min）二氧化碳氣體使pH值降至6.5時停止通氣使發酵液自然發酵，當pH值下降至5.7時，流加23%氫氧化鈣并重復上述操作。使用該方法，發酵40 h時丁二酸產量為88.47 g/L，糖酸轉化率為96.03%，平均生產強度為2.21 g/（L·h），乙酸產量僅為3.82 g/L，優化后的脈沖補料方法得到的丁二酸糖酸轉化率比優化前提升了15.06%。

使用優化后的工藝發酵生產丁二酸，對比使用其他方式，具有丁二酸產量和糖酸轉化率高、總生產強度大、副產物乙酸產量低等優勢。并且使用氫氧化鈣作中和劑，便于后續使用鈣鹽法分離提取丁二酸，為降低丁二酸生產成本、利用現有成熟的有機酸發酵及分離純化設備大規模生產丁二酸打下了良好基礎。

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收稿日期：2024-03-20

基金項目：國家自然科學基金青年項目（31501677）；企業合作項目（2023077）

作者簡介：陳思宇（1999—），女，碩士，研究方向：食品科學。

*通信作者：王永澤（1976—），男，副教授，博士，研究方向：微生物代謝與發酵。