生物炭與檸檬酸對石灰性土壤鎘形態轉化及紫花苜蓿鎘富集的影響

摘要：本研究以鎘污染石灰性土壤（Cd含量7.15 mg／kg）為基質進行盆栽試驗，設置Cd脅迫下施用不同熱解溫度生物炭（250、480℃，B1、B2）、檸檬酸不同用量（1、10 mmol/kg，N1、N2）及其組合處理（B1N1、B1N2、B2N1、B2N2），以單種植紫花苜蓿為對照（CK），研究不同熱解生物炭和檸檬酸用量對土壤性質、Cd形態轉化及紫花苜蓿Cd富集的影響。結果表明，生物炭、檸檬酸處理皆可提高土壤有效養分含量、提高土壤酶活性、改變低分子量有機酸組成，高溫熱解生物炭、高劑量檸檬酸處理效果更顯著。生物炭、檸檬酸處理影響土壤Cd形態轉化和紫花苜蓿Cd的富集，但二者的作用強弱與機制不同：不同熱解溫度生物炭對Cd皆為吸附鈍化效果，而低濃度檸檬酸略微鈍化Cd，高濃度檸檬酸活化土壤碳酸鹽結合態鎘（CA-Cd）和可交換態鎘（EX-Cd），提高有效Cd含量。生物炭與檸檬酸配施條件下，與CK相比，B1N2處理的土壤有效Cd含量、植株Cd含量及生物富集系數分別顯著提高40. 01%、57.48%及12. 40%，B2N1則分別顯著下降26. 79%、49. 38%及30. 81%。綜上，不同熱解溫度生物炭及檸檬酸劑量對Cd修復的作用強弱與機制存在差異，高溫生物炭配施低劑量檸檬酸可鈍化土壤Cd，低溫生物炭配施高劑量檸檬酸處理可活化土壤Cd及促進紫花苜蓿Cd富集。

關鍵詞：生物炭：檸檬酸；紫花苜蓿；土壤酶活性；鎘污染土壤；鎘形態；生物富集系數

中圖分類號：S541.1：X53 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）10-0119-08

隨著工業化和農業的快速發展，重金屬污染因其隱蔽性和較高的生態毒性，正成為各種農田土壤污染中最普遍、最嚴重的環境問題之一。最新的普查數據表明，在我國，82.8%的土壤不同程度地受到各種重金屬污染，其中9%的土壤鎘（Cd）濃度超標。Cd具有流動性高、持久性強及易富集等特點，對植物具有極強的破壞性，可顯著抑制植物的生殖、發育、代謝以及養分吸收，引起植物生理系統紊亂。Cd可通過徑流、灌溉、沉積物等途徑遷移到環境中，之后通過食物鏈富集于人體中。研究表明，持續接觸Cd可能引發多種疾病，如心腦血管疾病、腎衰竭和神經系統問題，嚴重影響人類健康。因此，環境保護和食品安全已成為各國保障人民安全健康的重要任務。通過土壤鈍化或降低土壤Cd含量是預防其進入食物鏈的首要環節，目前采用物理、化學以及生物技術的單一或組合手段已廣泛應用于土壤修復，并表現出良好的修復效果。

低分子量有機酸（LMWOA）是主要由動植物殘體分解、根系分泌、養分轉化以及土壤微生物代謝所產生的一類活性小分子有機化合物，可與重金屬之間發生螯合／絡合，因而在控制重金屬的溶解性方面發揮著關鍵作用，從而改變根際土壤中重金屬的轉化與移動。重金屬的遷移性很大程度上取決于LMWOAs的種類和濃度、土壤性質和其他環境因子。研究表明，低濃度的外源檸檬酸鹽和酒石酸鹽可促進重金屬的固定，而二者濃度較高時則促進重金屬的溶解，而高或低濃度的草酸皆可增強重金屬的活化能力。Ma等研究發現，低pH值條件下，增加檸檬酸、草酸或蘋果酸會導致酸性水稻土和紅壤鈍化Cd，而較高pH值條件下，只有檸檬酸顯著增加Cd的溶解度。

生物炭（BC）是一類將生物殘體、有機廢棄物在限氧環境中熱解制備的富碳產物。BC具有弱堿性、表面電荷密度高、孔隙率大及富含多種羥基、烷烴和酰胺基官能團等特點。大量研究表明，BC可通過改善土壤酶活性、影響植物根系分泌物組成及調節土壤微生物群落結構等方式介導土壤中的重金屬形態轉化，從而影響植物對重金屬的吸收與富集。然而不同條件下制備的生物炭在基礎性質及使用效果上可能存在較大差異。紫花苜蓿（Medicago sativa）是根系分泌物較多且豐富的豆科植物，因其適應性強、體內蛋白活性高等特點，現已被廣泛用作修復重（類）金屬的功能植物。目前關于生物炭、低分子量有機酸對Cd修復效果的研究較少，且對富集型植物的研究更是鮮有涉及。本試驗研究了Cd污染土壤中檸檬酸、不同生物炭單獨或混合施用對石灰性土壤性質、鎘賦存形態及紫花苜蓿對Cd積累的影響，以期為鎘污染土壤的治理及修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2023年5-7月在濟寧學院大棚試驗區進行。供試紫花苜蓿品種為‘改革者’，秋眠級3.0。供試檸檬酸（C6H8O7）為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。供試土壤取自山東省濟寧市某皮革廠排水區0-30 cm土層，土壤類型為砂姜黑土，土壤主要理化性質：pH值8.05，有機質、全氮含量分別為13.37、0.78 g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為62. 75、15. 58、171. 64mg/kg。土壤DTPA提取態鎘含量為7.15 mg/kg。根據《農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB15618-2018），當土壤pH值＞7.5時，農田土壤污染鎘臨界值為0.8 mg/kg，本試驗供試土壤鎘超標近8倍，為中輕度污染水平。生物炭原料為花生殼，購自河南省生物炭工程技術研究中心，制備條件見彭紅宇等的方法，供試生物炭基本理化性質見表1。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區組設計，以污染土壤（DTPA-Cd 7.15 mg/kg）為盆栽基質，設置2因素2水平試驗，其中兩因素分別為施用生物炭（B）、施用檸檬酸（N）；生物炭類型為低溫（BI）、高溫（B2）制備，檸檬酸水平為低水平1 mmol/kg（N1）、高水平10 mmol/kg（N2）。相應單施和組合施用處理分別為B1、B2、N1、N2、B1N1、B1N2、B2N1、B2N2；以不施生物炭及檸檬酸為對照（CK），共9個處理，重復3次。其中生物炭施用量為盆栽用土質量（以干基計）的1%。每盆裝土5 kg，生物炭處理將生物炭與土壤混勻，檸檬酸處理為水溶施入。按田間種植密度8×107粒/hm2換算，每盆播6粒種子，培育周期91 d，期間保持60% - 75%土壤持水量。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 紫花苜蓿Cd含量測定

盆栽結束時，獲取紫花苜蓿完整植株，將干凈植株置于105℃烘箱中殺青30 min，60℃烘干以獲得干物質量。將烘干的植株采用SG65型實驗用小型研磨機粉碎為粉末，裝入自封袋密封備用。粉末樣品加入HNO3與HClO4混合液采用微波消解儀（MDS-6，上海新儀微波化學科技有限公司產品）消解，借助電感耦合等離子體質譜儀（IM2000E，江蘇天瑞儀器股份有限公司產品）采用ICP-MS法測定Cd含量。

1.3.2 土壤Cd形態、土壤性質及酶活性測定

從紫花苜蓿根表附近（＜0.5 cm）獲取根際土壤，過0.15 mm網篩后分為兩部分，一部分自然風干用于測定土壤Cd粗存形態，另一部分采用真空冷凍干燥機（2022-00986，東富龍科技集團股份有限公司產品）干燥后用于測定土壤酶活性和土壤性質。

土壤有效鎘含量采用二乙烯三胺五乙酸（DTPA）浸提，ICP-MS法測定。根際土壤鎘形態采用改進的BCR連續提取法進行測定。土壤Cd包含可交換態（EX-Cd）、鐵錳氧化物結合態（FM-Cd）、碳酸鹽結合態（CA-Cd）、有機結合態（OM-Cd）以及殘渣態（RE-Cd）共5種形態。

土壤pH值（水：土=2.5：1）采用pH計[ ST3100/F，奧豪斯儀器（上海）有限公司產品]測定。土壤可溶性有機碳（DOC）采用水浸提—有機碳分析儀（IFIA7，北京吉天儀器有限公司產品）測定。腐植酸（HA）采用焦磷酸鈉浸提—重鉻酸鉀法測定。土壤堿解氮（AN）、有效磷（AP）及速效鉀（AK）分別采用堿解擴散法、鉬藍法及火焰光度法測定。土壤過氧化氫酶（CAT）、土壤轉化酶（INV）、土壤堿性蛋白酶（ALPT）、土壤脲酶（SUE）活性采用試劑盒提取—分光光度法測定，試劑盒均購自蘇州科銘生物技術有限公司，型號分別為：S-CAT-2-Y、SINV-2-Y、S-ALPT-2-Y、S-UE-2-Y。

1.3.3 土壤低分子量有機酸含量測定

根際土壤低分子量有機酸含量測定參照Tao等，的方法，略有修改。稱取10.00 g根際土于三角瓶中，加入45 mL超純水，使用渦旋振蕩儀（2-16KL，上海納茲儀器有限公司產品）以2 000 r/min渦旋振搖2 min，使其充分混勻。將勻漿采用高速低溫離心機以15 000 r/min離心10 min，用0.22 μm的微孔濾膜抽真空過濾。濾液采用樹脂柱吸附有機酸組分，采用1 mol/L鹽酸洗脫，采用旋轉蒸發儀以90 r／min蒸發濃縮至2mL。濃縮液加入超純水至10 mL，采用0.22 μm的微孔濾膜抽真空過濾，借助高效液相色譜儀（HPLC-20AT，上海昂軒儀器有限公司產品）采用HPLC法測定根際低分子量有機酸譜。色譜條件、流動相及參數設置參照Zhao等的方法，采用相應低分子量有機酸標準品用于校正。

1.4 數據處理與分析

鎘的生物富集系數（BCF）按照下式計算：

BCF=植株Cd含量／土壤有效Cd含量。

采用Microsoft Excel、SPSS 23.0軟件對試驗數據進行整理與統計分析，采用Origin 11軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 生物炭與檸檬酸對污染土壤理化性質的影響

由表2可知，各處理土壤pH值范圍為7.85 -8.07，其中以B2處理最高，其他處理較之降低0.62% - 2.73%，僅BIN2與B2處理差異顯著。土壤溶解性有機碳（DOC）含量表現為單施檸檬酸處理（N1、N2）高于單施生物炭處理（B1、B2），與對照（CK）相比，生物炭與檸檬酸相關處理提高15.61% - 51.93%，除B2外其他處理皆顯著高于CK。腐植酸（HA）含量表現為B1處理顯著高于N1處理，而B2處理顯著低于N2處理，且N1處理與CK無顯著差異：生物炭與檸檬酸組合處理中，以B1N2處理HA含量最高，顯著高于其他組合處0理。堿解氮（AN）、有效磷（AP）及速效鉀（AK）含量均以單施生物炭整體大于單施檸檬酸處理，其中單施檸檬酸處理表現為N2＞N1，單施生物炭處理表現為B2＞B1。綜上，生物炭與檸檬酸配施處理土壤各指標中以B2N2（HA除外）、B1N2（pH值除外）處理存在較大值。

2.2 生物炭與檸檬酸對土壤酶活性的影響

由表3可知，土壤轉化酶（INV）活性以B2N2處理最高，B1N2次之，但兩處理間無顯著差異，而其他處理較B2N2、BIN2分別顯著降低20. 09% -54.30%、14. 65% - 51. 18%。土壤過氧化氫酶（CAT）活性，就單施生物炭或檸檬酸處理而言，CAT活性皆以N2大于N1;生物炭與檸檬酸配施處理CAT活性則表現為B1N1＜ B2N1＜ B1N2＜B2N2，其中BIN2、B2N2較B1N1分別顯著提高7.60%、12.57%；B1、N1與CK的CAT活性較低且處理間均無顯著差異；土壤脲酶（SUE）活性以CK最低，其他處理較之顯著提高118.66% -211.94%；生物炭與檸檬酸配施處理中，以B1N2處理的SUE活力最旺盛，但處理間差異不顯著：各單施處理中B1、B2、N1及N2較B1N2分別顯著降低29.90%、15.07%、22.97%及16.27%。土壤堿性蛋白酶（ALPT）活性以B2N2處理最高，CK、B1、B2、N1及BINI較之分別顯著降低50.46%、42.69%、31.62%、35. 84%及44. 14%，其余處理亦低于B2N2處理，但差異均未達顯著水平。

2.3 生物炭與檸檬酸對紫花苜蓿根際土壤低分子量有機酸含量影響

由表4可知，紫花苜宿根際土壤低分子量有機酸各組分含量表現為丙二酸＜奎寧酸＜琥珀酸＜酒石酸＜檸檬酸＜草酸。不同處理各組分含量存在一定差異，其中BIN2處理的檸檬酸、草酸及奎寧酸含量最高，其他處理較之分別降低5. 36% -32.97%、8.16% - 36.57%及3.91% - 34. 16%。酒石酸含量各處理表現為CK＜B1＜B2＜N1＜B2N1＜B1N1＜B2N2＜B1N2＜N2，與N2相比，其他處理顯著降低8.05% - 46.40%。CK琥珀酸含量最高，其他處理較之顯著降低4.20% - 38.72%。丙二酸含量各處理表現為CK ＜B1＜ B2＜ N1 ＜N2 ＜B1N1、B2NI＜BIN2＜B2N2，與CK相比，B1提高7.83%，但二者無顯著差異，其他處理顯著提高9. 57% -37.39%。

2.4 生物炭與檸檬酸對土壤有效鎘含量及鎘形態比例的影響

由圖IA可知，土壤碳酸鹽結合態（CA-Cd）、可交換態（EX-Cd）有效鎘含量均以B1N2處理最高，其他處理較之分別顯著降低12. 29% -66.42%、2.33% - 31.79%：B1N2處理的總有效鎘含量最高，較CK顯著提高40.01%，而B2N1處理最低，較CK顯著降低26.79%。表明高溫生物炭配施低水平的檸檬酸對土壤Cd具有鈍化作用。

由圖1B可知，土壤不同形態鎘占比表現為CA-Cd＜EX-Cd＜OM-Cd＜RE-Cd＜FM-Cd，且不同處理鎘組分比例存在差異，其中CA-Cd、EX-Cd占比以BIN2處理最高，分別為24.22%、23.29%。FM- Cd、RE - Cd組分占比分別為21. 98% -32.62%、14.18% - 26. 21%，分別以B2N2、BC2處理最高。OM-Cd組分占比各處理表現為B1N2＜NM2＜CK＜NM1＜B2N2＜BC1＜BC2 ＜B2N1＜B1N1，其他處理較B1N1顯著降低5.33 - 15.95個百分點。

2.5 生物炭與檸檬酸對紫花苜蓿鎘含量與富集的影響

由圖2A可知，各處理紫花苜蓿植株Cd含量表現為B1N2處理最高，顯著高于CK 57.48%，NM2處理次之，也顯著高于CK，其他處理均顯著低于對照，其中B2N1處理最低，較對照降低49.38%。單施檸檬酸植株的Cd含量整體高于單施生物炭處理，其中單施生物炭處理差異不顯著，而單施檸檬酸則以N2顯著較高：二者組合處理中，以B1N2含量最高，B1N1、B2N1及B2N2較之顯著降低49.51%、67.86%及56.24%。表明低溫生物炭配施高水平的檸檬酸對土壤Cd具有活化作用從而提高植株Cd含量。

由圖2B可知，各處理的BCF值以BIN2最高，較CK顯著提高12.40%；B2N1處理最低，較CK顯著降低30.81%。

2.6 土壤性質、低分子量有機酸（LMWOA）含量與鎘指標間的相關性分析

土壤性質、LMWOA含量與不同形態鎘指標間的相關性分析結果（表5）表明，CA-Cd與檸檬酸、草酸、丙二酸均呈顯著或極顯著正相關，與pH值、DOC、HA、INV、CAT、ALPT、琥珀酸呈顯著或極顯著負相關。EX-Cd與草酸呈顯著正相關，與pH值、DOC、AP、CAT、SUE、琥珀酸呈顯著負相關。FM-Cd與pH值、草酸分別呈顯著正、負相關。OM-Cd與AK、琥珀酸分別呈顯著正、負相關。RE-Cd與pH值、草酸分別呈顯著正、負相關。植株Cd含量與AP、檸檬酸、草酸呈顯著正相關，與pH值、DOC、AN、AK呈顯著負相關。BCF與檸檬酸呈顯著正相關，與DOC、HA、AN、CAT呈顯著負相關，與丙二酸呈極顯著負相關。

3 討論與結論

土壤Cd污染是影響農田生態的主要因素之一，目前Cd污染土壤修復策略為有效態／半有效態鈍化及固持態活化以促進超積累植物Cd富集。低分子量有機酸、生物炭皆是目前常用的土壤重金屬修復材料，但關于不同熱解溫度生物炭、不同檸檬酸水平對土壤Cd的修復效果尚不清楚。土壤可溶性有機碳、腐植酸是土壤中重要的有機物質，可與Cd2+發生吸附、絡合及沉淀反應。本研究中，B1N2處理具有最高的DOC、HA含量，且pH值最低，表明該處理具有較強的絡合鈍化潛力，換言之，B1N2處理沒有發生鈍化作用。有效養分是影響植物生長的關鍵因素，其含量高低反映著土壤供給能力，決定著當季植物的生長發育及生產性能。本研究中，單施生物炭、檸檬酸處理的AN、AP、AK含量皆高于CK，其中B2N2、B1N2處理存在較大值。這表明檸檬酸對有效養分的影響較大，且較高的檸檬酸水平具有較強的養分周轉能力。

土壤酶在促進土壤元素循環、微生物代謝及生態穩定性中發揮著重要作用，其活性可反映土壤健康狀況，有助于調節土壤質量與生態。本研究中，與CK相比，生物炭、檸檬酸單施或組合處理土壤轉化酶、過氧化氫酶、脲酶及堿性蛋白酶均具有較高活性，且高溫熱解生物炭處理優于低溫熱解生物炭。前人研究表明，生物炭制備過程中的熱解溫度是影響生物炭結構、元素組成及理化性質等的重要因素，高溫熱解生物炭往往含有更多底物養分、微孔結構和更大的表面積，可提供更多的生態位，從而更有利于改善土壤質地，這可能是本研究高溫熱解生物炭處理土壤的酶活性更旺盛的原因。本研究中，B1N1、B1N2、B2N1、B2N2整體具有較高的土壤酶活性，表明適宜生物炭與檸檬酸組合處理可以增加土壤微生物活性，進而提高土壤養分周轉。

LMWOA是根系分泌物中的重要成分，植物能夠通過根系向根際釋放不同數量不同組分的LMWOA來響應外界刺激。本研究中，10mmol/kg檸檬酸相關處理（N2、B1N2、B2N2）的檸檬酸、草酸、酒石酸、奎寧酸及丙二酸含量較高。這與馬歡歡等的研究結果基本一致：檸檬酸是可溶性LMWOA的重要組成部分，外源施用高劑量的檸檬酸可誘導油葵釋放更多的LMWOA，從而有利于提高鎘的生物可用性。本研究結果發現，在僅種植紫花苜蓿條件下，琥珀酸含量較高，顯著高于生物炭、檸檬酸單施或組施處理。琥珀酸是紫花苜蓿釋放較多的LMWOA成分，檸檬酸與琥珀酸具有互斥作用，因此檸檬酸處理下琥珀酸含量下降：生物炭的表面電荷為負，且具有一定量的官能團，因此生物炭施用下琥珀酸可能被吸附、分解，因此含量亦較少。

重金屬的生物毒性和有效性與其含量、賦存形態及植物耐受性密切相關。本研究中，紫花苜蓿根際土壤Cd形態的組成表現為碳酸鹽結合態＜可交換態＜有機結合態＜殘渣態＜鐵錳氧化物結合態：土壤顆粒表面對RE-Cd、CA-Cd的吸附較弱，可在土壤溶液中游離，是可以被植物吸收的有效Cd形態。本研究中，B1N2較CK顯著提高土壤有效鎘含量40.01%，而B2NI處理土壤總有效態鎘含量最低，較CK顯著降低26.79%。紫花苜蓿Cd含量、生物富集系數均以BIN2處理最大，分別較CK顯著提高57. 48%、12. 40%，B2N1處理最低，分別較CK顯著降低49.38%、30.81%。前人研究表明，檸檬酸具有增強植物抵抗Cd脅迫、絡合土壤Cd2+、促進超富集植物吸收Cd2+及改善土壤Cd的遷移轉化等功能。

綜上，不同熱解溫度生物炭及檸檬酸劑量對Cd修復的作用強弱與機制存在差異，高溫生物炭配施低劑量檸檬酸可鈍化土壤Cd，低溫生物炭配施高劑量檸檬酸處理可活化土壤Cd及促進紫花苜蓿Cd富集。

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（41807053）