藍紫色月季品種“紫霞仙子”花發育階段轉錄組分析

關鍵詞：“紫霞仙子”月季；藍紫色花色；轉錄組分析；類黃酮；花青素；類胡蘿卜素

中圖分類號：S685.12 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）11-0013-08

月季（Rosa hybrid）品種多、花色豐富且適應性強，是世界切花最多的花卉種類。花色作為月季最重要也是最受人們關注的經濟性狀之一，主要受花瓣中的黃酮類和類胡蘿卜素類色素的種類及含量影響。黃酮類色素多數屬于水溶性色素，存在于液泡中，花朵的紅、粉、綠等主要受其影響；類胡蘿卜素類色素多數是脂溶性的，存在于質體中，對花朵的橙色至黃色影響比較大。花色的形成受多種基因的影響及控制，其中，轉錄因子復合體R2R3MYB、WD40和bHLH等花青素合成相關轉錄因子以及MADS-box、NAC和AP2/ERF等類胡蘿卜素合成相關轉錄因子，通過調控查爾酮合成酶基因（CHS）、查爾酮異構酶基因（CHI）、花青素3-糖基轉移酶基因（A3GT）、二氫黃酮醇還原酶基因（DFR）、類黃酮3-羥化酶基因（F3H）、類黃酮3′，5′-羥化酶基因（F3′5′H）、八氫番茄紅素合成酶基因（PSY）、八氫番茄紅素去飽和酶基因（PDS）、ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因（ZDS）、紫黃質脫環氧化酶基因（VDE）、玉米黃質環氧化酶基因（ZEP） 等結構基因的表達水平來調控花色。此外，色素合成相關結構基因還受到IncRNA和siRNA等轉錄后調控的影響。因此，花色調控是通過一個非常復雜的調控網絡進行的。

藍色是花卉中比較少的花色，藍色花僅占花卉總量很小的比例，象征高貴，頗受人們青睞。薔薇屬缺少藍色色素合成的關鍵結構基因F3′5′H，因此自然界缺少藍色玫瑰與月季品種。為滿足市場需求，近年來研究人員培育出“藍色海洋”、“紫霞仙子”等接近藍紫色的月季品種，具有較高觀賞價值和經濟價值，也具有重要的研究價值。本研究選用藍紫色月季品種“紫霞仙子”（Rosa‘Nightingale’），在其花朵不同發育期采集花瓣樣品，進行轉錄組測序及差異表達基因篩選和富集分析，并挖掘類胡蘿卜素和類黃酮合成相關基因，篩選出引起其花色趨向藍色的關鍵基因，為月季種質創新提供重要參考。

1材料與方法

1.1供試材料與設備

1.1.1植物材料 于5月中旬在山東省農業科學院濟陽試驗示范基地挑選生長狀況良好、沒有病蟲害的三年生“紫霞仙子”月季植株。根據花的不同發育階段，分別在花蕾期（N_S1）、初開期（N_S2）、半開期（N_S3）、盛開期（N_S4）和落花期（N_S5）5個時期采集花朵的第3～5輪花瓣，每個樣本中至少包含取自10朵不同花的花瓣，每個時期3個重復，共得到15個轉錄組測序樣本。樣品采用液氮冷凍，送北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序。

1.1.2主要設備 冷凍高速離心機，-80℃超低溫冰箱，核酸定量儀，全自動凝膠圖像分析系統，水平電泳儀（美國Bio-Rad公司），PCR擴增儀（伯樂T100），Eppendorf移液器（德國Eppendorf公司），全自動毛細管電泳系統（Agilent 2100 bio-analyzer），分光光度計NanoDrop ND-1000（美國NanoDrop公司）。

1.2實驗方法

1.2.1轉錄組測序 采用天根多糖多酚總RNA提取試劑盒從“紫霞仙子”月季花瓣樣品中提取總RNA，并使用Agilent 2100 bioanalyzer嚴格檢測RNA樣品的完整性，以RNA總量gt;0.4μg、RIN5.6為合格標準。質檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量需求pooling后進行Illu-mina測序。

1.2.2差異基因篩選及富集分析 差異分析分為3個主要階段：首先，對原始的readcount進行標準化，并對測序深度進行校正。其次，應用統計學模型計算假設檢驗中的概率值（P-value）；進行多重假設檢驗校正后，計算得到FDR值（FDR指的是錯誤發現率，P_adj是它的常見形式）。富集分析基于超幾何分布原理，其中差異基因集為差異顯著分析所得并注釋到GO（Gene Ontology）或KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫的基因集，而將所有參與差異顯著分析并注釋到GO或KEGG數據庫的差異基因集作為背景基因集。

1.2.3花色合成相關基因的挖掘 結合KEGG注釋和Blast方法，對“紫霞仙子”月季類黃酮、花青素和類胡蘿卜素合成通路上的功能基因進行識別。從Phytozome網站（https：//phytozome. jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載草莓、蘋果中已經確定與類黃酮、花青素和類胡蘿卜素合成相關的蛋白序列，用其比對月季全基因組，通過NCBI蛋白數據庫中的保守序列鑒定篩選月季基因。

2結果與分析

2.1轉錄組分析

2.1.1轉錄組數據質量評估 對“紫霞仙子”月季花發育5個時期的15個樣品進行Illumina測序，結果（表1）顯示，去除低質量reads后，共獲得1634066710條、99.68Gb的有效數據；每個樣品的clean bases都在5.96Gb及以上，GC含量為45.55%～46.23%；Q30堿基所占百分比在92.75%及以上。以上數據證明本次轉錄組測序質量良好，結果可信。

2.1.2不同發育時期差異表達基因分析 利用轉錄組測序數據對“紫霞仙子”月季花不同發育時期進行比較，在4個比較組中，N_S2 vs N_S1共找到793個差異基因，其中上調286個，下調507個；N_S3 vs N_S2差異基因最多，共找到3341個，其中上調1492個，下調1849個；N_S4 vs N_S3共找到980個差異基因，其中上調830個，下調150個；N_S5 vs N_S4共找到1038個差異基因，其中上調255個，下調783個（圖1A）。

用韋恩圖展示4組差異基因的統計結果，可以看出在N_S2 vs N_S1、N_S3 vs N_S2、N_S4 vs N_S3、N_S5 vs N_S4組合中分別有516、2692、672、569個特異的差異基因（圖1B）。

聚類熱圖可以反映“紫霞仙子”月季各發育時期的差異基因表達情況。由圖2可見，花發育不同時期的基因表達存在明顯差異，但每個時期的生物學重復之間不存在顯著差異。“紫霞仙子”月季花基因的表達可分為4簇，Ⅰ簇在N_Sl和N_S2時期表達量較高；Ⅱ簇在N_S3時期表達量最高，N_S4與N_S5時期表達量較低；Ⅲ簇在不同時期均有表達，其中N_S4與N_S5時期表達量最高；Ⅳ簇在N_S4與N_S5時期表達量較高，在N_S3時期少量表達。整體而言，Ⅰ簇在花發育初期表達量較高，隨著花發育進入半開期則維持在比較低的水平；Ⅱ簇在花發育的前中期表達量較高，而在花的發育進入盛開期之后表達量急劇降低，在盛開期與落花期表達量極低；Ⅲ簇和Ⅳ簇主要表達于花發育后期，在花發育的前中期僅有少量表達。

2.2差異基因的GO富集分析

我們將在兩組樣品中的表達量差異達到兩倍以上且P_adjlt;0.05的基因確定為顯著差異表達基因，對其進行GO富集分析，結果如圖3所示。

從N_S1期到N_S2期，差異基因顯著性較低，未富集到顯著差異表達基因。

從N_S2期到N_S3期，共有750個差異基因可在GO數據庫中得到注釋，其中上調300個，下調450個。差異基因在生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）方面均有富集，BP方面參與最多的為碳水化合物代謝過程（carbohydrate metabolic process），共有88個差異基因；CC方面參與最多的為細胞壁（cell wall）、外部封裝結構（ external encapsulating structure）、細胞外周（cell periphery）和胞外區（extracellular re-gion），差異基因數量分別為18、18、21個和10個：MF方面差異基因最多的為葡萄糖基轉移酶活性（transferase activity， transferring glycosyl groups）、己糖轉移酶活性（transferase activity，transferring hexosyl groups）、血紅素結合（heme binding）和四吡咯結合（tetrapyrrole binding），差異基因數量分別為71、61、57個和57個。

從N_S3期到N_S4期，共有641個差異基因可在GO數據庫中得到注釋，其中上調608個，下調33個。該時期基因表達差異最為顯著，在BP、CC和MF方面均有富集。BP方面參與最多的為多有機體過程（multi-organism process）、細胞識別（cell recognition）、授粉（pollination）、花粉一雌蕊相互作用（ pollen-pistil interaction）、花粉識別（rec-ognition of pollen）和多細胞生物過程（multicellularorganismal process），差異基因數量分別為20、18、18、18個和18個；CC方面參與最多的為細胞外周，有9個差異基因；MF方面參與最多的為DNA結合的轉錄因子活性（DNA binding transcriptionfactor activity）、轉錄調節因子活性（Transcription regulator activity）和作用于成對供體的氧化還原酶活性（oxidoreductase activit， acting on paired donors），差異基因數量分別為38、38個和29個。

從N_S4期到N_S5期，差異基因主要集中于MF方面，參與最多的為銅離子結合（copper ion binding），有10個差異基因。

2.3差異基因的KEGG通路富集分析

采用clusterProfile軟件對4個比較組（N_S2vs N_S1、N_S3 vs N_S2、N_S4 vs N_S3、N_S5 vsN_S4）的差異基因進行KEGG通路富集分析，用P_adjlt;0.05作為確定顯著性富集的閾值，結果見圖4。圖中展示了每個對比組顯著性最高的20個通路，橫坐標表示注釋到KEGG通路的差異基因數與總差異基因數的比率，縱坐標代表富集到的KEGG通路：點的大小表示注釋到KEGG通路的基因數大小，顏色由紅色到紫色代表了富集到的基因的顯著性由大到小。

在N_S1期到N_S2期，有202個基因可在KEGG數據庫中得到注釋，共富集到81條通路，其中顯著富集1條通路，即苯丙烷類生物合成通路（phenylpropanoid biosynthesis），共包含18個差異基因。

在N_S2期到N_S3期，共有1108個基因可在KEGG數據庫中得到注釋，共富集到115條通路，顯著富集12條通路。其中富集差異基因較多的是糖酵解／糖異生（glycolysis，gluconeogenesis）、植物MAPK信號通路（MAPK signaling pathway-plant）、苯丙烷類的生物合成和a-亞麻酸代謝（alpha-linolenic acid metabolism），分別含有29、26、25、23個差異基因。

在N_S3期到N_S4期之間，共有227個基因在KEGG數據庫中得到了注釋，共富集到77條通路，有8條通路顯著富集，其中植物MAPK信號通路、苯丙烷類的生物合成以及倍半萜和三萜的生物合成（sesquiterpenoid and triterpenoid biosyn-thesis）通路是富集差異基因多的通路，分別含有12、11、10個差異基因。

在N_S4期到N_S5期，共254個基因在KEGG數據庫中有注釋，共有88條通路被富集，5條通路顯著富集。其中苯丙烷類生物合成和植物激素信號轉導（plant hormone signal transduction）是富集差異基因最多的通路，分別包含14個和13個差異基因。

2.4類黃酮與花青素合成相關基因的挖掘與分析

根據轉錄組數據的分析發現，類黃酮與花青素合成的相關基因中有15個基因在“紫霞仙子”月季花的不同發育時期差異表達。其中，關鍵基因CHI、CHS、DFR、F3H、A3GT5隨著花的發育表達量先上升后下降，CHI、CHS、F3H在半開期達到峰值，而DFR、A3GT5在盛開期達到峰值；MYB轉錄因子基因MYB6和MYB113與上述基因表達趨勢相同，可能也對類黃酮及花青素的合成存在調控作用（圖5）。

2.5類胡蘿卜素合成相關基因的挖掘與分析

根據轉錄組數據的分析發現，類胡蘿卜素合成的相關基因中有14個在“紫霞仙子”月季花的不同發育時期差異表達。其中，關鍵基因PSY2、PDS、ZDS、VDE和ZEP隨著花的發育表達量先上升后下降，PSY2、PDS、ZDS在初開期表達量達到峰值，VDE和ZEP則在半開期達到峰值（圖6）。

3討論與結論

本研究通過轉錄組測序分析的方法，分析了“紫霞仙子”月季花不同發育時期影響花色變化的差異基因，結果表明，初開期到半開期的差異表達基因最多，共3341個：半開期到盛開期的差異基因最少，共980個。證明初開期到半開期是“紫霞仙子”月季花生理活動最為活躍的時期。整個花發育過程中均與苯丙烷類的合成密切相關。從花蕾期到半開期，均與己糖轉移酶活性和葡萄糖基轉移酶活性的KEGG通路密切相關，證明糖代謝參與到“紫霞仙子”月季花的開放過程中。有研究表明糖的轉運與代謝可促進牡丹解除休眠和二次開花，這也可以佐證本研究在“紫霞仙子”月季中得到的結果。從初開期到盛開期，均與植物MAPK信號通路的KEGG通路密切相關。從盛開期到落花期，植物激素信號轉導的KEGG通路都與花的發育階段密切相關，證明在花發育后期植物激素發揮著重要作用。有研究表明茉莉酸、水楊酸和脫落酸可能協同調控杜鵑花的衰老過程，這也佐證了本研究結果。

在研究類黃酮與花青素合成通路的基因變化規律時，共找到15個基因在“紫霞仙子”月季花不同發育時期差異表達，其中，CHI、CHS、F3H基因表達在半開期達到頂峰，證明半開期是“紫霞仙子”月季大量積累二氫黃酮醇的時期：而DFR作為合成無色矢車菊素、無色天竺葵素和無色飛燕草素的重要基因，A3GT5作為對花青素進行糖基化修飾的糖基轉移酶，二者的表達量均在盛開期達到頂峰，這一時期也是“紫霞仙子”月季花中花青素快速積累的時期。有研究表明MYB6與MYB113作為R2R3MYB轉錄因子，可以正向調控植物花中的花青素合成；本研究結果也表明MYB6與MYB113可能在“紫霞仙子”月季花發育過程中參與花青素合成的調控。

本研究在對類胡蘿卜素合成相關基因的分析中找到了14個基因在“紫霞仙子”月季花不同發育時期差異表達。其中，PS Y2、PDS、ZDS基因表達量在初開期達到峰值，隨后逐步下降，這可使植物積累的類胡蘿卜素減少。在某些橙色和黃色花卉中，類胡蘿卜素的表達量從花蕾期到落花期始終居高不下，如龍膽。“紫霞仙子”作為藍紫色月季花，其類胡蘿卜素合成基因從早期就開始下調，推測可能是通過減少類胡蘿卜素在體內的積累降低黃色對藍紫色花色的干擾。而VDE和ZEP基因的表達量在半開期達到峰值，隨后逐漸下降，可能是由于這兩個基因位于類胡蘿卜素合成通路的下游，存在一定的響應延遲。

綜上所述，本研究通過“紫霞仙子”月季花發育不同時期的轉錄組分析，找出了開花過程中類黃酮與花青素、類胡蘿卜素合成通路中的差異基因，探討了其花色形成機理，為日后月季的花色改造奠定了理論基礎。