苦杏仁苷調節HMGA1/NF-κB信號通路對LPS誘導的心肌細胞炎癥反應的影響

摘要目的：探討苦杏仁苷（AMG）對脂多糖（LPS）誘導的心肌細胞炎癥反應的影響及對高遷移率族ATHook蛋白1（HMGA1）/核因子-κB（NF-κB）信號通路的調節機制。方法：將H9c2心肌細胞分為對照組、LPS組、AMG低劑量組、AMG高劑量組、AMG高劑量＋重組HMGA1組（AMG高＋HMGA1組）。采用四甲基偶氮唑藍（MTT）檢測心肌細胞的增殖活性；流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測細胞培養液炎性因子白細胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌細胞HMGA1/NF-κB通路相關蛋白的表達。結果：與對照組比較，LPS組心肌細胞存活率、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）蛋白表達降低，心肌細胞凋亡率、炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量、HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平升高（P＜0.05）。與LPS組比較，AMG各劑量組心肌細胞存活率、IκBα蛋白表達升高，心肌細胞凋亡率、炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量、HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平降低（P＜0.05），且HMGA1過表達可逆轉AMG對心肌細胞的保護作用（P＜0.05）。結論：AMG通過抑制HMGA1/NF-κB信號通路，減輕LPS誘導的心肌細胞炎癥反應。

關鍵詞心肌細胞；苦杏仁苷；高遷移率族ATHook蛋白1/核因子-κB信號通路；炎癥反應；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.007

Effect of Amygdalin on LPS-induced Myocardial Inflammation by Regulating HMGA1/NF-κB Signaling Pathway

YANG Gaining， SU Haiyan

No.215 Hospital of Shaanxi Nuclear Industry， Xianyang 712000， Shaanxi， China

Corresponding AuthorSU Haiyan， E-mail： 3335171801@qq.com

AbstractObjective：To investigate the effect of amygdalin（AMG）on lipopolysaccharide（LPS）-induced myocardial inflammation and its regulatory mechanism of high mobility ATHook protein 1（HMGA1）/nuclear factor-κB（NF-κB） signaling pathway.Methods：H9c2 cardiomyocytes were divided into control group，LPS group，AMG low-dose group，AMG high-dose group，AMG high-dose ＋ recombinant HMGA1 group（AMG high ＋HMGA1 group）.The proliferative activity of cardiomyocytes was detected by tetramethylazolium blue（MTT）.Cardiomyocyte apoptosis rate was detected by flow cytometry.The inflammatory factors interleukin（IL）-6，IL-1β and tumor necrosis factor（TNF）-α were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expressions of HMGA1/NF-κB pathway related proteins in cardiomyocytes were detected by Western Blot.Results：Compared with the control group，the survival rate of cardiomyocytes and the expression of NF-κB inhibitory protein α（IκBα） decreased in the LPS group，while the apoptosis rate，inflammatory factor IL-6，IL-1β，TNF-α content，HMGA1 protein and phosphorylation levels of NF-κB p65 and IκBα increased（P＜0.05）.Compared with the LPS group，the survival rate of cardiomyocytes and the expression of IκBα protein increased in AMG dose groups，while the apoptosis rate，inflammatory factor IL-6，IL-1β，TNF-α content，HMGA1 protein and phosphorylation levels of NF-κB p65 and IκBα decreased（P＜0.05）.Overexpression of HMGA1 could reverse the protective effect of AMG on cardiomyocytes（P＜0.05）.Conclusion：AMG could attenuate LPS-induced myocardial inflammation by inhibiting the HMGA1/NF-κB signalling pathway.

Keywordscardiomyocytes; amygdalin; high mobility ATHook protein 1/nuclear factor-κB signaling pathway; inflammatory response; experimental study

心肌炎是由感染、免疫反應和中毒引起的心肌炎癥，其持續性發生可能導致心肌細胞結構和功能異常，臨床癥狀主要表現為心律失常、急性心力衰竭、心源性休克等心肌功能障礙，但由于心肌炎癥狀多樣，與其他心血管疾病高度相似，且缺乏特異的診斷方法，目前尚無有效的治療方法［1-2］。因此，研究心肌炎的發病機制對尋找新的治療方法具有重要意義。高遷移率族ATHook蛋白1（high-mobility group AT-hook 1，HMGA1）作為結構性轉錄因子是高遷移率族蛋白家族成員之一，除與多種癌癥的發生密切相關外，與心肌梗死、心肌細胞肥大、冠狀動脈微栓塞等多種心血管疾病有關［3-4］。核因子-κB（NF-κB）是細胞內重要的核轉錄因子，可釋放多種促炎因子。有研究指出，HMGA1/NF-κB信號通路在炎癥的發展中發揮著重要作用，抑制該信號通路可減輕冠狀動脈微栓塞術誘導的心肌損傷［5］。脂多糖（LPS）是一種存在于革蘭氏陰性菌細胞壁中的細菌內毒素，通過激活NF-κB信號通路促進心肌細胞炎性因子產生，加劇心肌損傷［6-7］。苦杏仁苷（amygdalin，AMG）也稱為維生素B17，是一種含氰基的糖苷化合物，具有消炎、止咳化痰及抗腫瘤的作用，通過抑制Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號通路，改善LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥損傷［8］。關于LPS誘導的心肌細胞損傷的作用機制尚未明確。本研究旨在探討AMG是否通過調節HMGA1/NF-κB信號通路對LPS誘導的心肌細胞炎癥產生影響。

1材料與方法

1.1實驗材料和儀器

大鼠心肌細胞H9c2（貨號：BW-5335，北京博沃爾斯生物科技有限公司）；四甲基偶氮唑藍（MTT）細胞增殖活性檢測試劑盒（貨號：R20228，上海源葉生物科技有限公司）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：E-CK-A211，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；白細胞介素（IL）-6酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（貨號：E0079r，武漢伊艾博科技股份有限公司）；IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA檢測試劑盒（貨號：EK-R36877、EK-R38696，廣州博輝生物科技有限公司）；HMGA1、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）一抗（貨號：ab129153、ab76302、ab32518、ab133462，英國Abcam公司）；羊抗兔免疫球蛋白G（貨號：SPA9-1，北京索萊寶科技有限公司）；CytoFLEX流式細胞儀（貝克曼庫爾特國際貿易有限公司）；Tecan Spark多功能酶標儀（上海帝肯實驗器材有限公司）；ChemiDoc MP System全能型成像系統（伯樂生命醫學產品有限公司）。

1.2細胞培養

將心肌細胞H9c2用含有10%的胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素抗生素的DEME培養基，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養，待細胞的匯合率達到80%后進行傳代，之后選擇生長狀態較好的細胞繼續后續實驗。

1.3細胞模型建立和分組

將培養的H9c2心肌細胞分為對照組、LPS組、AMG低劑量組、AMG高劑量組、AMG高劑量＋重組HMGA1組（AMG高＋HMGA1組）。除對照組外，其余組別心肌細胞均參照文獻［9］加入含1 μg/mL的LPS培養基培養24 h誘導細胞損傷；AMG低劑量組、AMG高劑量組心肌細胞分別用含80、320 μmol/L的AMG培養基培養［10］；AMG高＋HMGA1組用含320 μmol/L的AMG的培養基培養，轉染HMGA1重組蛋白的細胞。

1.4MTT檢測心肌細胞的增殖活性

將心肌細胞按照1.3中的分組接種至96孔板中培養（4×103個/孔），每組設置6個復孔，每孔加入100 μL細胞培養物；24 h后，每孔中加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，之后棄上清，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解晶體，使用酶標儀檢測570 nm下各孔的吸光度，每組實驗重復3次。

1.5流式細胞術檢測心肌細胞凋亡

收集心肌細胞按照1.3中的分組接種于6孔板中（2×105個/孔），培養24 h后棄上清收集細胞，之后用1×結合緩沖液重懸細胞，再依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，室溫孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況并計算凋亡率。

1.6ELISA檢測心肌細胞培養液炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平

收集按照1.3分組培養24 h的細胞培養液，以3 000×重力加速度（g），離心5 min，收集上清。采用ELISA試劑盒檢測炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.7蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌細胞HMGA1/NF-κB通路相關蛋白的表達

收集分組培養24 h后的H9c2心肌細胞，加入RIPA裂解液并提取總蛋白，之后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），分離蛋白樣品并轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。將PVDF膜置入含5%的脫脂牛奶中孵育2 h，之后與一抗稀釋液（HMGA1、p-NF-κB p65、IκBα比例為1∶2 000，p-IκBα比例為1∶10 000）4 ℃孵育過夜，再與羊抗兔IgG二抗稀釋液（1∶1 000）室溫下孵育2 h，最后采用電化學發光（ECL）顯色試劑顯色。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，在凝膠成像儀中成像，應用Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.8統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件分析數據。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組心肌細胞存活率比較

與對照組比較，LPS組心肌細胞存活率降低（P＜0.05）；與LPS組比較，AMG各劑量組、AMG高＋HMGA1組心肌細胞存活率升高（P＜0.05）；與AMG高劑量組比較，AMG高＋HMGA1組心肌細胞存活率降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2AMG對心肌細胞凋亡率的影響

與對照組比較，LPS組心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與LPS組比較，AMG各劑量組、AMG高＋HMGA1組心肌細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與AMG高劑量組比較，AMG高＋HMGA1組心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）。詳見圖1、表2。

2.3AMG對心肌細胞炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

與對照組比較，LPS組心肌細胞培養液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（P＜0.05）；與LPS組比較，AMG各劑量組、AMG高＋HMGA1組心肌細胞培養液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低（P＜0.05）；與AMG高劑量組比較，AMG高＋HMGA1組心肌細胞培養液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.4AMG對H9c2心肌細胞HMGA1/NF-κB通路相關蛋白的影響

與對照組比較，LPS組心肌細胞HMGA1、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達升高，IκBα蛋白表達降低（P＜0.05）；與LPS組比較，AMG各劑量組、AMG高＋HMGA1組心肌細胞HMGA1、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達降低，IκBα蛋白表達升高（P＜0.05）；與AMG高劑量組比較，AMG高＋HMGA1組心肌細胞HMGA1、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達升高，IκBα蛋白表達降低（P＜0.05）。詳見表4、圖2。

3討論

心肌炎是由各種因素引起的危及生命的心血管疾病，如感染或接觸有毒物質和免疫系統激活等，均可導致心臟功能障礙，也是膿毒癥等多種疾病的并發癥。目前關于心肌炎的發病機制尚未明確，而加大關于心肌炎的研究對新藥物的開發具有重要幫助［11-12］。天然物質因廣泛的可用性和相對較低的成本廣泛用于各種疾病的治療。AMG是廣泛存在于薔薇科植物中的一種芳香族生氰化合物，已被推廣作為天然抗癌劑，具有抗菌、抗炎及免疫活性調節等多種藥理作用［13-14］。有研究表明，AMG通過抑制炎性因子分泌，減輕LPS誘導的急性肝損傷［15］。關于LPS誘導的心肌細胞損傷的作用機制尚未明確。LPS是炎癥反應的關鍵介質之一，可引發全身炎癥、多器官衰竭及心功能受損，常用于模擬心肌細胞炎癥［16］。本研究利用LPS誘導心肌細胞，結果顯示，LPS組心肌細胞存活率降低，凋亡率升高，促進炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α釋放；AMG各劑量組心肌細胞存活率升高，凋亡率降低，減少了IL-6、IL-1β、TNF-α釋放。提示AMG可抑制心肌細胞凋亡及炎性因子的釋放，從而促進細胞增殖，減輕LPS誘導的心肌細胞損傷。

HMGA1蛋白是一種核結構因子，具有高遷移率，主要調節染色質結構、轉錄調節蛋白與下游DNA的相互作用，促進多種類型癌癥的發生［17］。相關研究顯示，HMGA1通過增強NF-κB的轉錄活性誘導參與炎癥反應的基因表達［5，18］。NF-κB是一個可誘導信號調節因子家族，調節一系列基因，刺激誘導炎癥反應進程，其中p65亞基是構成NF-κB的有效轉錄激活因子［19］。IκBα是NF-κB抑制劑家族的一員，其被泛素依賴性蛋白酶體降解后，促進p65磷酸化并轉移至細胞核，進而促進炎性因子的分泌［20］。本研究結果顯示，LPS組心肌細胞HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平升高，IκBα蛋白表達降低，AMG各劑量組HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平降低，IκBα蛋白表達升高。進一步應用重組HMGA1蛋白轉染培養細胞發現，HMGA1過表達可逆轉AMG對心肌細胞的保護作用。提示AMG可抑制HMGA1/NF-κB通路被激活，阻止NF-κB p65進入細胞核轉錄激活，從而減輕LPS誘導的心肌細胞炎性損傷。

綜上所述，AMG通過抑制HMGA1/NF-κB信號通路，進而減輕LPS誘導的心肌細胞炎癥。本研究為治療心肌炎等心血管疾病提供了新方向。但關于HMGA1在炎性損傷疾病方面的研究較少，作用機制尚未明確，今后需對本研究結果進行體內實驗驗證。

參考文獻：

［1］KONG Y R，HAN B，ZHANG L，et al.Long noncoding RNA NONHSAT177112.1 aggravates inflammation and apoptosis in LPS-treated human cardiomyocytes［J］.Epigenomics，2021，13（6）：411-422.

［2］SURESH A，MARTENS P，WILSON TANG W H W.Biomarkers for myocarditis and inflammatory cardiomyopathy［J］.Current Heart Failure Reports，2022，19（5）：346-355.

［3］QIAO G B，WANG R T，WANG S N，et al.GRP75-mediated upregulation of HMGA1 stimulates stage Ⅰ lung adenocarcinoma progression by activating JNK/c-JUN signaling［J］.Thoracic Cancer，2021，12（10）：1558-1569.

［4］CAI Z L，SHEN B，YUAN Y，et al.The effect of HMGA1 in LPS-induced Myocardial Inflammation［J］.International Journal of Biological Sciences，2020，16（11）：1798-1810.

［5］SU Q，LV X W，SUN Y H，et al.Role of high mobility group A1/nuclear factor-kappa B signaling in coronary microembolization-induced myocardial injury［J］.Biomedicine amp; Pharmacotherapy，2018，105：1164-1171.

［6］SU Z D，WEI X B，FU Y B，et al.Melatonin alleviates lipopolysaccharide-induced myocardial injury by inhibiting inflammation and pyroptosis in cardiomyocytes［J］.Annals of Translational Medicine，2021，9（5）：413.

［7］LUO Q，YANG A K，CAO Q，et al.3，3′-Diindolylmethane protects cardiomyocytes from LPS-induced inflammatory response and apoptosis［J］.BMC Pharmacology amp; Toxicology，2018，19（1）：71.

［8］SI Z Y，ZHANG B.Amygdalin attenuates airway epithelium apoptosis，inflammation，and epithelial-mesenchymal transition through restraining the TLR4/NF-κB signaling pathway on LPS-treated BEAS-2B bronchial epithelial cells［J］.International Archives of Allergy and Immunology，2021，182（10）：997-1007.

［9］LIANG D S，JIN Y M，LIN M M，et al.Down-regulation of Xist and miR-7a-5p improves LPS-induced myocardial injury［J］.International Journal of Medical Sciences，2020，17（16）：2570-2577.

［10］KUNG Y L，LU C Y，BADREALAM K F，et al.Cardioprotective potential of amygdalin against angiotensin Ⅱ induced cardiac hypertrophy，oxidative stress and inflammatory responses through modulation of Nrf2 and NF-κB activation［J］.Environmental Toxicology，2021，36（5）：926-934.

［11］XU Z，LI X M，LI X W，et al.Dioscin attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory myocardial injury through oxidative stress-related pathway［J］.Annals of Palliative Medicine，2021，10（8）：8827-8836.

［12］GUO T，JIANG Z B，TONG Z Y，et al.Shikonin ameliorates LPS-induced cardiac dysfunction by SIRT1-dependent inhibition of NLRP3 inflammasome［J］.Frontiers in Physiology，2020，11：570441.

［13］KOLESAROVA A，BALDOVSKA S，ROYCHOUDHURY S.The multiple actions of amygdalin on cellular processes with an emphasis on female reproduction［J］.Pharmaceuticals，2021，14（9）：881.

［14］BARAKAT H，ALJUTAILY T，ALMUJAYDIL M S，et al.Amygdalin：a review on its characteristics，antioxidant potential，gastrointestinal microbiota intervention，anticancer therapeutic and mechanisms，toxicity，and encapsulation［J］.Biomolecules，2022，12（10）：1514.

［15］TANG F Y，FAN K F，WANG K L，et al.Amygdalin attenuates acute liver injury induced by D-galactosamine and lipopolysaccharide by regulating the NLRP3，NF-κB and Nrf2/NQO1 signalling pathways［J］.Biomedecine amp; Pharmacotherapie，2019，111：527-536.

［16］ZHANG Y，XU Y，ZHOU K，et al.Hypoxia-inducible transcription factor-1α inhibition by topotecan protects against lipopolysaccharide-induced inflammation and apoptosis of cardiomyocytes［J］.Bio Medical Engineering OnLine，2021，20（1）：88.

［17］MARUTHI PRASAD E，LIU T，ZHANG X，et al.High-mobility group A1（HMGA1） gene expressions in various colorectal cancer cell lines and correlation with prognosis［J］.Translational Cancer Research，2020，9（2）：763-773.

［18］BARON R M，KWON M Y，CASTANO A P，et al.Frontline Science：targeted expression of a dominant-negative high mobility group A1 transgene improves outcome in sepsis［J］.Journal of Leukocyte Biology，2018，104（4）：677-689.

［19］SUN J L，SUN J H，ZHOU X Z.Retracted article：protective functions of myricetin in LPS-induced cardiomyocytes H9c2 cells injury by regulation of MALAT1［J］.European Journal of Medical Research，2019，24（1）：20.

［20］ZHANG H，LIN J Y，SHEN Y H，et al.Protective effect of crocin on immune checkpoint inhibitors-related myocarditis through inhibiting NLRP3 mediated pyroptosis in cardiomyocytes via NF-κB pathway［J］.Journal of Inflammation Research，2022，15：1653-1666.

（收稿日期：2023-04-03）

（本文編輯薛妮）