腸道菌群通過(guò)Treg/IDO信號(hào)通路參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究

摘要目的：探討腸道菌群通過(guò)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）/吲哚胺2，3-雙加氧酶-1（IDO1）軸信號(hào)通路參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。方法：將C57BL無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)的5周雌性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠隨機(jī)分為普通飼料處理組（NC組）和高脂飲食（含0.2%膽固醇，42%脂肪）處理組（HF組），每組10只。通過(guò)主動(dòng)脈表面油紅O染色和蘇木精-伊紅染色分析主動(dòng)脈斑塊和硬化損傷面積。采用流式細(xì)胞術(shù)分析脾細(xì)胞中CD4＋CD25＋叉頭框蛋白p3（Foxp3）＋Treg在CD4＋T細(xì)胞中的百分比；蛋白免疫印跡法定量動(dòng)脈吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行糞便微生物群分析。結(jié)果：與NC組比較，HF組小鼠主動(dòng)脈斑塊和硬化損傷面積增加（P＜0.001），CD4＋CD25＋Foxp3＋/CD4＋T比例和Foxp3 mRNA水平均降低（P＜0.001）。與NC組比較，HF組小鼠IDO1含量降低（P＜0.001）。小鼠斑塊與Treg、IDO1呈負(fù)相關(guān)（r值分別為－0.87，－0.66，P＜0.01）。厚壁菌門與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊呈正相關(guān)（r＝0.64，P＜0.01）；放線菌與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.74，P＜0.01）。厚壁菌門與IDO1呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.59，P＜0.05）；擬桿菌門與IDO1呈正相關(guān)（r＝0.67，P＜0.01）。厚壁菌門與Treg呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.63，P＜0.01）；變形菌門與Treg呈正相關(guān)（r＝0.61，P＜0.01）。結(jié)論：腸道菌群改變可能通過(guò)Treg/IDO1信號(hào)通路，參與高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。

關(guān)鍵詞動(dòng)脈粥樣硬化；腸道菌群；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；吲哚胺2，3-雙加氧酶-1；高脂飲食；小鼠；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.009

Exprimental Study of Gut Microbiota Participating in Atherosclerosis Progression" through Treg/IDO Signaling Pathway

ZHANG Yuxiang， Maila·Enivar， Maila·Abudoukelimu

The Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830002， Xinjiang， China

Corresponding AuthorMaila·Abudoukelimu， E-mail： stowerow2008@163.com

AbstractObjective：To investigate gut microbiota participating in the progression of atherosclerosis through regulatory T cell（Treg）/indoleamine 2，3-dioxygenase-1（IDO1） axis signaling pathway.Methods：Five-week female apolipoprotein E gene knockout（ApoE-/-） mice of C57BL specific pathogen free（SPF） were randomly divided into ordinary feed treatment group（NC group） and high-fat diet（0.2% cholesterol，42% fat） treatment group（HF group），with 10 mice in each group.Aortic plaques and lesions were detected by oil red O staining and hematoxylin-eosin staining.The percentage of CD4＋CD25＋ Foxp3＋Treg in spleen cells was detected by flow cytometry.Indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO） was quantified by protein immunoblotting，and fecal microbiota was detected by polymerase chain reaction（PCR）.Results：Compared with the NC group，the aortic plaque and hardened lesion area in the HF group increased（P＜0.001），and the CD4＋CD25＋Foxp3＋/CD4＋T ratio and Foxp3 mRNA level decreased（P＜0.001）.Compared with the NC group，the content of IDO1 in the HF group decreased（t＝4.98，P＜0.001）.The plaques in mice were negatively correlated with Treg and IDO1（r values were －0.87 and －0.66，respectively，P＜0.01）.Firmicutes were positively correlated with atherosclerotic plaque（r＝0.64，P＜0.01）.Actinomycetes were negatively correlated with atherosclerotic plaque（r＝－0.74，P＜0.01）.Firmicutes were negatively correlated with IDO1（r＝－0.59，P＜0.05）.Bacteroidetes were positively correlated with IDO1（r＝0.67，P＜0.01）.Firmicutes were negatively correlated with Treg（r＝－0.63，P＜0.01）.Proteobacteria were positively correlated with Treg（r＝0.61，P＜0.01）.Conclusion：The changes of gut microbiota might participate in the progression of high-fat diet atherosclerosis via Treg/IDO1 signaling pathway.

Keywordsatherosclerosis; gut microbiota; regulatory T cell; indoleamine 2，3-dioxygenase-1; high-fat diet; mice; experimental study

動(dòng)脈粥樣硬化是由于低密度脂蛋白膽固醇在動(dòng)脈壁中滯留和積聚引發(fā)的慢性炎癥性疾病［1］。有研究證實(shí)，血管壁中“調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）/吲哚胺2，3-雙加氧酶-1（indoleamine 2，3-dioxygenase-1，IDO1）軸”的激活可影響動(dòng)脈粥樣硬化［2］。IDO1是催化色氨酸降解的犬尿氨酸途徑中代謝物產(chǎn)生的限速酶，與T細(xì)胞效應(yīng)子反應(yīng)的調(diào)節(jié)和Tregs的擴(kuò)增有關(guān)［3］。在高膽固醇血癥小鼠中應(yīng)用吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）可抑制色氨酸代謝，導(dǎo)致血管炎癥顯著增強(qiáng)和斑塊形成加速［4］。目前尚未明確Treg/IDO1軸的調(diào)節(jié)因子腸道微生物群作為動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的新型診斷和治療靶點(diǎn)［5］。腸道菌群通過(guò)調(diào)節(jié)微生物代謝物在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的組成變化可對(duì)IDO1的活性產(chǎn)生影響［6］。本研究旨在探討腸道菌群是否通過(guò)Treg/IDO1信號(hào)通路參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，以期為研究動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制提供新方向。

1材料與方法

1.1動(dòng)物模型建立

C57BL無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)的5周雌性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［生產(chǎn)編號(hào)：SCXK（京）2019-0011］。動(dòng)物飼養(yǎng)在受控環(huán)境中［溫度（22±2）℃，12 h晝夜循環(huán)］，自由進(jìn)食和飲水。在為期1周的適應(yīng)期內(nèi)，所有小鼠均喂以普通飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司），之后隨機(jī)分為普通飼料處理組（NC組）和高脂飲食（含0.2%膽固醇，42%脂肪，購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司）處理組（HF組），每組10只，為期14周。

1.2動(dòng)脈粥樣硬化病變分析

第14周，使用磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）沖洗循環(huán)系統(tǒng)，用含4%多聚甲醛的PBS固定。之后從主動(dòng)脈根部到髂分叉處取出心臟和主動(dòng)脈組織，置于4%多聚甲醛中6 h。為評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化損傷區(qū)域，縱向切開(kāi)主動(dòng)脈以暴露內(nèi)膜表面，通過(guò)脂肪染色（油紅O）觀察斑塊區(qū)域。從主動(dòng)脈弓到髂分叉（不包括頭臂動(dòng)脈干、左頸總動(dòng)脈、左鎖骨下動(dòng)脈和其他分支血管）對(duì)主動(dòng)脈區(qū)域的損傷進(jìn)行量化。主動(dòng)脈弓定義為從升弓的起點(diǎn)到左鎖骨下動(dòng)脈遠(yuǎn)端3 mm的范圍。將2 mm近端主動(dòng)脈的心臟包埋在石蠟中，制成4 μm切片，用于蘇木精和伊紅染色，分析主動(dòng)脈竇中動(dòng)脈粥樣硬化損傷面積。使用Image J軟件對(duì)損傷面積進(jìn)行量化。

1.3流式細(xì)胞術(shù)

使用尼龍細(xì)胞濾器分離脾細(xì)胞，溶解紅細(xì)胞并進(jìn)行洗滌。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞染色試劑盒（美國(guó)eBioscience公司）分析CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg在總CD4＋T細(xì)胞中的百分比。在FACS流式細(xì)胞儀上使用CellQuest軟件（美國(guó)Becton-Dickinson公司）進(jìn)行分析。調(diào)整細(xì)胞熒光和非特異性背景熒光之間的差異后，以陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比分析數(shù)據(jù)。

1.4蛋白印跡法定量動(dòng)脈IDO

參照相關(guān)文獻(xiàn)［7］，從冷凍的主動(dòng)脈根部切片中提取總蛋白。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，4%～15%，美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司）分離10 μg提取物，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF，美國(guó)GE Healthcare公司）膜。使用M-48抗體（美國(guó)BioLegend公司）探測(cè)膜的鼠IDO。α-微管蛋白定量（抗α-微管蛋白；英國(guó)Abcam公司）作為加載對(duì)照。

1.5糞便微生物群分析

使用QIAamp DNA糞便迷你試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）提取糞便微生物DNA，采用納米滴分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Electron公司）進(jìn)行定量，并儲(chǔ)存在20 ℃條件下進(jìn)一步分析。使用引物338F和806R對(duì)微生物16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。將PCR混合物加熱至95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，共27個(gè)循環(huán)。使用2%瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案在Illumina MiSeq平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行匯集和成對(duì)末端測(cè)序。測(cè)序完成后，所有原始數(shù)據(jù)通過(guò)Trimmomatic和FLASH進(jìn)行解復(fù)用和質(zhì)量過(guò)濾。使用UCHIME去除嵌合序列，并通過(guò)QIIME工具（1.7版本）將高質(zhì)量序列聚集到操作分類單元（OTUs）中。OTUs定義為基于16S rRNA序列的具有97%相似性的一組閱讀序列。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用學(xué)生t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于微生物群數(shù)據(jù)，每個(gè)樣本的采樣深度為30 000個(gè)。相關(guān)性分析用Spearman法。

2結(jié)果

2.1高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化

與NC組比較，HF組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積［（2.84±0.32）%和（10.64±0.56）%］和硬化損傷面積［（15.23±1.26）%和（41.87±3.48）%］增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為－7.91，－10.24，P＜0.001）。詳見(jiàn)圖1。

2.2HF飲食降低Treg細(xì)胞的脾臟含量

與NC組比較，HF組小鼠CD4＋CD25＋Foxp3＋/CD4＋T比例［（13.47±0.86）%和（6.23±0.41）%］和Foxp3 mRNA水平［（1.00±0.04）、（0.42±0.05）］均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為7.46，8.41，P＜0.001）。詳見(jiàn)圖2。

2.3HF飲食降低腸道組織的IDO1含量

與NC組比較，HF組小鼠IDO1含量［（1.54±0.73）μg prot和（0.47±0.19）μg prot］降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.98，P＜0.001）。詳見(jiàn)圖3。

2.4HF改變的腸道微生物群與Treg/IDO1軸和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊相關(guān)

NC組和HF組腸道微生物群的組成在門水平不同，包括厚壁菌門和去鐵細(xì)菌門增加，擬桿菌門和放線菌門減少。詳見(jiàn)圖4。本研究進(jìn)一步分析動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、改變的微生物和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因素，Treg、IDO1之間是否存在相關(guān)性，進(jìn)行了Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積與Treg、IDO1呈負(fù)相關(guān)（r值分別為－0.87，－0.66，P＜0.01）。厚壁菌門與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積呈正相關(guān)（r＝0.64，P＜0.01）；放線菌門與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.74，P＜0.01）。厚壁菌門與IDO1呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.59，P＜0.05）；擬桿菌門與IDO1呈正相關(guān)（r＝0.67，P＜0.01）。厚壁菌門與Treg呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.63，P＜0.01）；變形菌門與Treg呈正相關(guān)（r＝0.61，P＜0.01）。結(jié)果提示，腸道微生物群、Treg、IDO1和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊存在相關(guān)性。

3討論

動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致冠心病，是全球范圍內(nèi)的主要死亡原因。盡管基于他汀類藥物的降脂治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入和危險(xiǎn)因素修正的廣泛應(yīng)用降低了冠心病的死亡率，但該病的全球負(fù)擔(dān)仍較重［1］。因此，確定冠心病的其他危險(xiǎn)因素和新的治療策略是研究熱點(diǎn)。Treg在維持對(duì)自身抗原的耐受性和抑制過(guò)度、有害的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化中，Treg與較多保護(hù)功能相關(guān)，包括抑制效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)、樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和免疫刺激能力，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的促炎反應(yīng)，促進(jìn)人平滑肌細(xì)胞增殖和膠原蛋白生成［8-9］。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠脾臟中Treg細(xì)胞的生成能力降低，表明Treg的減少可能與動(dòng)脈粥樣硬化惡化有關(guān)。

Treg通過(guò)分泌抗炎細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制作用。有研究報(bào)道了一種新機(jī)制，即誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)酶IDO1的能力［10］。Treg上的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）β或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4表達(dá)可調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞中IDO1，參與IDO1表達(dá)的自我擴(kuò)增和部分細(xì)胞耐受表型的維持［11］。由于人類表觀遺傳介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4下調(diào)，導(dǎo)致抗原呈遞細(xì)胞IDO1表達(dá)減少，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人Treg活性降低［12］。使用IDO抑制劑1-MT預(yù)處理后，耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的Treg抑制膠原型關(guān)節(jié)炎癥狀消失［13］。炎癥可調(diào)節(jié)不同細(xì)胞類型中IDO1的表達(dá)和活性，包括成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞。先前的研究表明，IDO在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)有助于增強(qiáng)血管壁對(duì)炎癥的天然抵抗力［14］。本研究結(jié)果顯示，HF組小鼠動(dòng)脈組織IDO1含量顯著低于NC組，與Wang等［15］報(bào)道的結(jié)果一致。有研究顯示，IDO1通過(guò)快速選擇性降解色氨酸抑制體外T細(xì)胞增殖［16］。因此，色氨酸的高速降解與平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生物活性色氨酸代謝物形成重要的反饋環(huán)，穩(wěn)定甚至增強(qiáng)Treg在血管壁中的作用。上述研究結(jié)果證實(shí)了Treg/IDO1信號(hào)通路參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

腸道微生物群是一種重要的環(huán)境因素，與宿主相互影響并共同進(jìn)化［6］。相關(guān)研究分析了腸道微生物群在肥胖、2型糖尿病、高膽固醇血癥和代謝綜合征中的作用［17］。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、破裂與循環(huán)中高水平的腸道微生物群衍生的脂多糖和炎癥細(xì)胞因子有關(guān)［18］。有研究表明，高脂飲食通過(guò)改變腸道微生物群組成、誘導(dǎo)腸道屏障功能障礙和增加腸道通透性提高血漿脂多糖水平［18］。包埋在腸上皮細(xì)胞來(lái)源的乳糜微粒中的脂多糖穿過(guò)腸屏障進(jìn)入血流，并與Toll樣受體結(jié)合，啟動(dòng)宿主先天免疫系統(tǒng)的促炎反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和破裂［19］。相關(guān)研究指出，腸道菌群改變使IDO1依賴的色氨酸代謝向犬尿氨酸生成、腸道炎癥轉(zhuǎn)變［6］。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)導(dǎo)致微生物群門水平的變化，主要包括ApoE-/-小鼠中擬桿菌門的減少和厚壁菌門的增加。有研究結(jié)果顯示，厚壁菌門與冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病率有關(guān)［20］。與一些特定分類群和斑塊面積相關(guān)的研究結(jié)果一致［20］。本研究結(jié)果顯示，厚壁菌門與動(dòng)脈粥樣斑塊呈正相關(guān)，而放線菌呈負(fù)相關(guān)。雖然放線菌占腸道微生物群的一小部分，但其對(duì)維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定十分重要［21］。本研究結(jié)果還顯示，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與Treg、IDO1呈負(fù)相關(guān)，提示Treg和IDO1是動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。厚壁菌門與Treg表達(dá)呈正相關(guān)。據(jù)研究報(bào)道，變形菌門與冠心病有關(guān)［22］。本研究中高脂飲食處理后變形菌門變化較少，其與Treg表達(dá)呈正相關(guān)；擬桿菌門、厚壁菌門與IDO1分別呈正相關(guān)、負(fù)相關(guān)，表明腸道微生物區(qū)系與催化色氨酸降解的犬尿氨酸途徑中代謝物生成之間存在聯(lián)系。結(jié)果表明，腸道菌群改變可能通過(guò)Treg/IDO1信號(hào)通路參與高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。

綜上所述，Treg/IDO1信號(hào)抑制在高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與腸道微生物群的調(diào)節(jié)有關(guān)。結(jié)果揭示了高脂飲食對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的新機(jī)制，可建立腸道微生物群和Treg/IDO1信號(hào)介導(dǎo)的色氨酸代謝之間的關(guān)聯(lián)，作為預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化形成的研究新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2023-04-04）

（本文編輯薛妮）