肺動脈高壓病人血清miR-221、miR-222水平與預后的相關性

摘要目的：探討血清微小RNA-221（miR-221）、微小RNA-222（miR-222）評估先天性心臟病（CHD）合并肺動脈高壓（PAH）病人預后的臨床價值。方法：選取2018年6月—2020年7月我院收治的208例CHD病人，其中無PAH病人88例（CHD無PAH組），合并PAH病人120例（CHD合并PAH組）；另選取同期健康體檢者100名作為對照組。對120例CHD合并PAH病人隨訪，根據預后情況分為死亡組（43例）和存活組（77例）。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測血清miR-221、miR-222表達水平；受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-221、miR-222對CHD合并PAH病人死亡的預測價值；Logistic回歸分析CHD合并PAH病人不良預后（死亡）的影響因素。結果：CHD無PAH組、CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達水平高于對照組（P＜0.05）；CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達水平高于CHD無PAH組（P＜0.05）。與存活組比較，死亡組肺動脈收縮壓、左室舒張末期內徑（LVEDD）、血肌酐（Scr）、N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、miR-221、miR-222水平升高，左室射血分數（LVEF）及6 min步行距離（6MWD）降低，差異均有統計學意義（P＜0.001）。血清miR-221預測CHD合并PAH病人死亡的敏感度為72.09%，特異度為84.42%，截斷值為3.81，ROC曲線下面積（AUC）為0.817；血清miR-222預測CHD合并PAH病人死亡的敏感度為76.74%，特異度為79.22%，截斷值為4.03，AUC為0.824；miR-221聯合miR-222預測CHD合并PAH病人死亡的敏感度為81.40%，特異度為87.01%，AUC為0.889。Logistic回歸分析顯示，肺動脈收縮壓、miR-221、miR-222是CHD合并PAH病人不良預后的危險因素（P＜0.05），LVEF是CHD合并PAH病人不良預后的保護因素（P＜0.05）。結論：血清miR-221、miR-222水平升高與CHD合并PAH病人不良預后有關。

關鍵詞肺動脈高壓；先天性心臟病；微小RNA-221；微小RNA-222；預后

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.016

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是多種原因引起的嚴重心肺疾病，以肺動脈壓力、阻力持續增高為特征，由于肺血管阻力增加與肺動脈壓升高，導致右心衰竭和死亡，與先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）病人不良預后密切相關［1-2］。PAH發病機制復雜，有研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）與PAH發生、發展密切相關，通過調控肺動脈細胞增殖、分化及炎癥、氧化應激等參與疾病的發生發展［3］。另有研究顯示，PAH病人外周血miRNA異常表達與預后相關，如特發性PAH病人外周血miR-199a表達下調，與肺動脈平均壓、肺血管阻力和肺血管阻力指數均呈負相關，對病人預后具有較好的預測價值［4］。miR-221、miR-222參與腫瘤、心血管疾病的各種生理和病理過程，相關研究顯示，miR-221、miR-222在PAH肺組織與肺動脈平滑肌細胞中上調，可調節肺動脈平滑肌細胞增殖［5-6］。CHD合并PAH病人血清miR-221、miR-222表達及其與預后的關系尚未明確。本研究通過檢測CHD合并PAH病人血清miR-221、miR-222表達，分析miR-221、miR-222與病人預后的相關性。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2018年6月—2020年7月我院收治的208例CHD病人，其中男96例，女112例；年齡32～75（43.5±7.7）歲。其中無PAH病人88例（CHD無PAH組），合并PAH病人120例（CHD合并PAH組）。另選取同期健康體檢者100名作為對照組，其中男47名，女53名，年齡36～73（43.9±7.6）歲。本研究經過醫院倫理委員會批準。

納入標準：經超聲心電圖檢查并經血管CT或心血管造影確診為CHD，右心導管檢查肺動脈平均壓（mean pulmonary arterial pressure，MPAP）≥25 mmHg診斷為CHD合并PAH［7］；臨床資料完整。排除標準：合并其他心血管疾病病人；嚴重肝、腎功能不全病人；肺血管畸形、慢性阻塞性肺疾病等其他疾病繼發的PAH。

1.2研究方法

1.2.1血清miR-221、miR-222水平檢測

采集所有研究對象清晨空腹靜脈血5 mL，離心收集血清，生化檢測于當天進行，部分血清置于－80 ℃保存，用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測。

Trizol試劑（碧云天生物科技有限公司，貨號：R0016）提取血清總RNA，BeyoRTTM III cDNA第1鏈合成試劑盒（碧云天生物科技有限公司，貨號：D7178M）合成cDNA，采用qRT-PCR檢測血清miR-221、miR-222水平，其中PlatinumTMSYBRTM Green qPCR SuperMix-UDG購自Invitrogen公司（貨號：11733046），miR-221、miR-222及內參U6引物由廣州銳博生物科技有限公司合成，miR-221正向引物序列（5′-3′）：ACCTGGCATACAATGTAG，反向引物序列（5′-3′）：GAACATGTCTGCGTATCTC；miR-222正向引物序列（5′-3′）：CTCAGTAGCCAGTGTAG，反向引物序列（5′-3′）：GAACATGTCTGCGTATCTC；U6正向引物序列（5′-3′）：AAAGACCTGTACGCCAACAC，反向引物序列（5′-3′）：GTCATACTCCTGCTTGCTGAT。

反應體系共50 μL：其中SYBR Green Mix 25 μL，cDNA 2 μL，正向、反向引物各1 μL，無菌雙蒸水（ddH2O）加至體積為50 μL；反應條件：94 ℃、120 s，94 ℃、20 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，35個循環，反應結束后，以U6為內參，采用2－△△Ct法計算miR-221、miR-222相對表達量。

1.2.2臨床資料收集

收集病人一般資料，包括性別、年齡、收縮壓、舒張壓、心率、血氧飽和度（arterial oxygen saturation，SaO2）；超聲測定肺動脈收縮壓、左室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）；測量6 min步行距離（6 minute walk distance，6MWD）。實驗室指標尿酸（uric acid，UA）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、血清肌酐（serum creatinine，Scr）、N末端腦鈉肽前體（N-terminal brain natriuretic peptide，NT-proBNP）等。

對所有病人每3～6個月進行隨訪評估，共隨訪2年，以死亡為不良預后，原因明確為CHD合并PAH相關死亡。

1.3統計學處理

采用SPSS 25.0統計軟件分析數據，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗；不符合正態分布的定量資料以中位數、四分位數［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。定性資料以例數、百分比（%）表示，采用χ2檢驗。受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-221、miR-222對CHD合并PAH病人死亡的預測價值；Logistic回歸分析影響CHD合并PAH病人不良預后（死亡）的因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1CHD無PAH組、CHD合并PAH組、對照組血清miR-221、miR-222表達水平比較

CHD無PAH組、CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達水平高于對照組（P＜0.05）；CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達水平高于CHD無PAH組（P＜0.05）。詳見表1。

2.2CHD合并PAH不同預后病人臨床資料比較

隨訪結束，120例CHD合并PAH病人中死亡43例（死亡組），存活77例（存活組）。與存活組比較，死亡組肺動脈收縮壓、LVEDD、Scr、NT-proBNP、miR-221、miR-222水平升高，LVEF及6MWD降低，差異均有統計學意義（P＜0.001）。詳見表2。

2.3血清miR-221、miR-222表達對CHD合并PAH病人預后的預測價值

血清miR-221預測CHD合并PAH病人死亡的敏感度為72.09%，特異度為84.42%，截斷值為3.81，ROC曲線下面積（AUC）為0.817；血清miR-222預測CHD合并PAH病人死亡的敏感度為76.74%，特異度為79.22%，截斷值為4.03，AUC為0.824；miR-221聯合miR-222預測CHD合并PAH病人死亡的敏感度為81.40%，特異度為87.01%，AUC為0.889。詳見圖1。

2.4CHD合并PAH病人不良預后的影響因素

將表2中差異有統計學意義的指標作為自變量（賦值：miR-221≥3.81＝1，miR-221＜3.81＝0；miR-222≥4.03＝1，miR-221＜4.03＝0；肺動脈收縮壓、LVEF、LVEDD、NT-proBNP、Scr、6MWD為實測值），以CHD合并PAH病人是否死亡為因變量（否＝0，是＝1），進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，肺動脈收縮壓、miR-221、miR-222是CHD合并PAH病人不良預后的危險因素（P＜0.05）；LVEF是CHD合并PAH病人不良預后的保護因素（P＜0.05）。詳見表3。

3討論

PAH是一種致命疾病，其特征是肺動脈重塑和收縮，與內皮細胞功能失調及肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，HPASMCs）異常增生、分化、凋亡等密切相關，目前對PAH尚無治愈方法，尋找有效的PAH標志物，對病人進行預后評估具有重要的臨床意義［8］。CHD合并PAH病人長期處于肺充血狀態，肺動脈壓力升高，血流動力學參數可反映心功能狀態，血清指標可反映心腎功能［9-10］。本研究結果顯示，與存活組比較，死亡組肺動脈收縮壓、LVEDD、Scr、NT-proBNP升高，LVEF降低，表明CHD合并PAH病人心室負荷增加，心腎功能受損，不利于預后，易發生死亡；Logistic回歸分析結果顯示，肺動脈收縮壓、miR-221、miR-222是CHD合并PAH病人不良預后的危險因素，LVEF是CHD合并PAH病人不良預后的保護因素，提示CHD合并PAH病人死亡可能與心臟高負荷有關。

miRNA主要通過對靶基因的轉錄后調控，參與多種病理生理進程。相關研究顯示，肺血管中miRNA具有維持肺動脈穩態的作用，其異常表達與PAH的發生有關［11］。有研究表明，PAH病人外周血miRNA異常表達，檢測miRNA水平可用于PAH早期診斷及預后判斷。CHD合并PAH病人血清miR-21、miR-210高表達，是CHD病人發生PAH的危險因素［12］。miRNA通過調控肺動脈平滑肌細胞增殖與凋亡、血管內皮細胞損傷、細胞外基質異常沉積等影響PAH的發生發展［13］。miR-221、miR-222與心血管疾病、炎癥性疾病、腫瘤等多種疾病密切相關。有研究顯示，PAH病人肺組織和缺氧HPASMCs中miR-221和miR-222表達顯著增加，lnc-Ang362可上調HPASMCs中miR-221和miR-222表達并激活核因子（NF）-κB信號通路，促進細胞增殖與遷移［14］。miR-221、miR-222在血管重塑中發揮著重要作用，miR-221、miR-222可刺激血管平滑肌細胞增殖，引起血管內膜增厚［15］。本研究結果顯示，CHD無PAH組、CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達水平高于對照組，CHD合并PAH組血清miR-221、miR-222表達水平高于CHD無PAH組，提示血清miR-221、miR-222水平升高可能與CHD發生及合并PAH有關。分析原因是高水平miR-221、miR-222可調控肺動脈平滑肌細胞增殖，血管內膜增厚，升高肺動脈壓力。

本研究結果還顯示，死亡組血清miR-221、miR-222水平高于存活組，提示miR-221、miR-222表達與CHD合并PAH病人預后相關。PAH的發病機制包括肺動脈內皮功能障礙、氧化應激和炎癥等。有研究顯示，PAH與NF-κB通路激活有關，抑制NF-κB通路激活可減輕小鼠低氧性肺動脈高壓［16］。另有研究顯示，miR-221、miR-222通過激活NF-κB通路促進乳腺癌干細胞樣細胞特性和腫瘤生長［17］。推測miR-221、miR-222在PAH中表達升高，通過持續激活NF-κB通路、增加體內炎癥反應，導致病人病情加重，預后不良。本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-221預測CHD合并PAH病人死亡的敏感度為72.09%，特異度為84.42%，截斷值為3.81，AUC為0.817；血清miR-222預測CHD合并PAH病人死亡的敏感度為76.74%，特異度為79.22%，截斷值為4.03，AUC為0.824；二者聯合檢測AUC為0.889，提示miR-221、miR-222預測CHD合并PAH病人預后不良有一定的臨床價值，且二者聯合的預測價值更高。多因素Logistic分析結果顯示，miR-221、miR-222是CHD合并PAH病人不良預后的危險因素，提示血清miR-221≥3.81，miR-222≥4.03，CHD合并PAH病人有發生預后不良的風險，可為臨床針對性治療提供依據。

綜上所述，CHD合并PAH病人血清miR-221、miR-222水平升高，對CHD合并PAH病人發生預后不良具有一定預測價值，且二者是CHD合并PAH病人預后不良的獨立危險因素，可能作為預測CHD合并PAH病人預后不良的潛在標志物。

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（收稿日期：2023-03-23）

（本文編輯薛妮）