CYP24A1酶多態性rs2762939與冠狀動脈疾病的相關性

摘要目的：探討CYPs 24亞家族A成員1（CYP24A1）酶多態性rs2762939和環境因素的交互作用及其與冠狀動脈疾病（CAD）的相關性。方法：選取2019年2月—2021年2月我院收治的230例CAD病人作為觀察組，另選取同期于我院進行體檢的183名冠狀動脈無明顯病變的健康者作為對照組。比較兩組一般資料；采用Sanger測序法檢測CYP24A1基因rs2762939多態性；采用多因素非條件Logistic回歸分析影響CAD發生的因素；比較rs2762939不同基因型病人間的臨床特征；分析rs2762939基因型與環境因素的交互作用。結果：兩組收縮壓、舒張壓、糖尿病、高血壓、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、同型半胱氨酸（Hcy）、rs2762939基因型、等位基因比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。糖尿病、高血壓、TC、TG水平升高、CYP24A1酶多態性rs2762939基因型為GC型、CC型、C等位基因是導致CAD發生的獨立危險因素（P＜0.05）。GG型、GC型、CC型糖尿病、高血壓比例、TC、TG比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；CC型糖尿病、高血壓比例、血清TC、TG水平高于GG型、GC型，差異均有統計學意義（P＜0.05）。rs2762939基因型GC型、CC型與糖尿病、高血壓、TC、TG存在明顯的交互作用（P＜0.05）。結論：攜帶rs2762939基因型為GC型、CC型屬于CAD高危人群，這些基因型與糖尿病、高血壓、TC、TG之間的交互作用促進了CAD的發生發展。

關鍵詞冠狀動脈疾病；CYPs 24亞家族A成員1；基因多態性；交互作用

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.025

冠狀動脈疾病（coronary artery disease，CAD）是由冠狀動脈粥樣硬化引起的，導致流向心臟血液受限的疾病［1］。CAD發病機制較復雜，受遺傳和環境因素的雙重影響，是造成世界范圍內殘疾和死亡的主要公共衛生問題之一，死亡人數約占老年總死亡人數的30%［2］。隨著人口老齡化程度的加劇及生活環境、飲食結構的改變，CAD發病率呈逐年升高趨勢［3］。流行病學研究結果顯示，年齡、吸煙、肥胖、飲食、家族史等因素與CAD的發生密切相關［4］。隨著蛋白質組學和基因組學研究的不斷深入，全基因組關聯研究顯示，越來越多的疾病發生與基因多態性有關［5］。細胞色素P450（cytochrome P450，CYPs）是單加氧酶，可催化與藥物代謝、脂質合成相關的反應，是一組超家族基因編碼結構和功能的同工酶［6］。CYPs 24亞家族A成員1（CYPs 24 subfamily A member 1，CYP24A1）是CYPs家族中的一員，可編碼24-羥化酶，通過多種途徑降解維生素D的活性形式［7］。有研究表明，CYP24A1基因多態性與腫瘤的發病風險有關［8］。文獻報道顯示，CYP24A1基因多態性與冠心病、川崎病等有關［9］，國內相關研究鮮有報道。由于CYP24A1種族和地域分布差異較大，我國CYP24A1基因多態性與CAD發生的相關性尚未明確。本研究通過檢測CYP24A1基因的rs2762939位點，探討CYP24A1酶多態性rs2762939與CAD的相關性，以期為闡明疾病的診斷和疾病發生的分子機制提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2019年2月—2021年2月我院收治的230例CAD病人作為觀察組，其中男88例，女142例；年齡45～75（62.58±7.35）歲；體質指數（24.45±2.12）kg/m²。另選同期于我院進行體檢的183名冠狀動脈無明顯病變（冠狀動脈狹窄程度＜25%）的健康者作為對照組，其中男85名，女98名；年齡45～75（61.35±7.65）歲；體質指數（24.39±2.28）kg/m²。對照組健康者至少存在CAD家族史、吸煙、糖尿病、高血壓、血脂異常等CAD危險因素中的1項。本研究經我院醫學倫理委員會審批。

CAD病人納入標準：經冠狀動脈造影證實回旋支、前降支、左主干、右冠狀動脈等主要血管中至少1支狹窄≥50%；臨床資料完整。排除標準：肺炎、敗血癥等感染性疾病；惡性腫瘤；自身免疫性疾病；嚴重血液系統疾病。

1.2方法

1.2.1一般資料收集

通過電子病歷收集所有研究對象的一般資料，包括年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病情況；測量病人身高和體重，計算體質指數（體質指數＝體重/身高2）；血壓計測量病人的舒張壓和收縮壓。高血壓病人的診斷參照《中國高血壓防治指南》2018年修訂版中的相關標準［10］，糖尿病病人的診斷參照美國糖尿病學會制定的《糖尿病醫學診療標準》［11］。

1.2.2樣本采集

于病人入院后次日清晨或對照組體檢當日，采集空腹靜脈血4 mL，以3 000 r/min離心15 min獲得血清，采用cobas c800全自動生化分析儀（羅氏公司）及配套試劑檢測病人血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（how density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平。

1.2.3全血DNA提取

采集所有研究對象空腹靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸二鉀（dipotassium ethylenediamine tetraacetate，EDTA-K2）抗凝管中，采用AxyPrep血基因組小量試劑盒（康寧生命科學有限公司）提取、純化全血基因組DNA，采用紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）測定全血基因組DNA的濃度和純度。以超純水為陰性對照，當OD260/OD230＞2.0、OD260/OD280≈1.8時，表明DNA純度合格，DNA濃度＞1.0 μg/μL。

1.2.4CYP24A1酶多態性rs2762939檢測

采用Sanger測序法對全血基因組DNA進行測序，檢測CYP24A1酶多態性rs2762939的等位基因。正向引物為5′-CTCTCCCTTATCCTTTTTACTCCT-3′，反向引物為5′-AGCTGTGAGGTGACCATTGAG-3′，引物序列均由上海生工合成。1）將提取的DNA進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），反應體系：MTHFR擴增液22 μL，1.0 μL反應液A，2 μL樣品DNA溶液（濃度為40 ng/μL），10 μmol/L的正向、反向引物各1 μL，使用無菌去離子水補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環；最后72 ℃修復延伸10 min。2）測序反應：檢測CYP24A1酶多態性rs2762939基因型（GG型、GC型和CC型）和等位基因（G等位基因、C等位基因）。PCR產物測序反應體系：純化后PCR產物2 μL，引物2 μL，滅菌水2 μL，Big Dye Seq 5*Buffer 1.2 μL，Big Dye 0.4 μL。PCR產物測序體系：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，60 ℃ 3 min，共30個循環。采用自動單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型軟件對SNP進行數據分析。3）PCR產物純化：每50 μL PCR產物中加入4 μL 3 mol/L NaAc和80 μL 95%乙醇，離心去上清液，待乙醇揮發后加入20 μL TE溶解。4）電泳及凝膠成像檢測：對PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后放入凝膠成像系統測定條帶情況。

1.3統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布和方差齊性的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗；定性資料以例數、百分比（%）表示，采用χ2檢驗。采用基因頻率計數法計算等位基因及基因型分布情況，Hardy-Weinberg（H-W）平衡采用擬合優度χ2檢驗。采用多因素非條件Logistic回歸分析影響病人CAD發生的因素。GMDR軟件分析CYP24A1酶多態性rs2762939基因型與環境因素的交互作用。檢驗水準α＝0.05。

2結果

2.1兩組臨床資料比較

兩組收縮壓、舒張壓、糖尿病、高血壓、TC、TG、Hcy比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。詳見表1。

2.2CYP24A1酶多態性rs2762939單核苷酸多態性分析

基因分型后獲得純合子GG型片段、雜合突變GC型片段和純合突變CC型片段，3、5、7、8、9、12為純合子GG型，2、4、6、10為雜合突變GC型，11為純合突變CC型。詳見圖1。

2.3兩組CYP24A1酶多態性rs2762939基因型及等位基因頻率比較

對照組和觀察組CYP24A1酶多態性rs2762939基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝0.092，P＝0.928），具有群體代表性。兩組CYP24A1酶多態性rs2762939基因型及等位基因頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。以野生型（GG）基因頻率及G等位基因為參考進行單因素Logistic回歸分析，結果顯示，GC、CC基因頻率及C等位基因為CAD的危險因素（P＜0.05）。詳見表2。

2.4多因素非條件Logistic回歸分析影響CAD發生的因素

將差異有統計學意義的指標作為自變量，將CAD發生情況（未發生＝0，發生＝1）作為因變量，采用多元線性逐步Logistic回歸分析影響CAD發生的因素。結果顯示，糖尿病、高血壓、TC、TG水平升高、CYP24A1酶多態性rs2762939基因型為GC型、CC型、C等位基因是CAD發生的獨立危險因素（P＜0.05）。詳見表3。

2.5不同rs2762939基因型臨床特征比較

GG型、GC型、CC型糖尿病、高血壓比例、TC、TG比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；CC型糖尿病、高血壓比例、血清TC、TG水平高于GG型、GC型，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.6CYP24A1酶多態性rs2762939基因型和環境因素的交互作用及其與CAD的關系

分析CYP24A1酶多態性rs2762939基因型和環境因素的交互作用與CAD的關系。結果顯示，rs2762939基因型GC、CC分別與糖尿病、高血壓、TC、TG間的交互作用均有統計學意義（P＜0.05），交叉驗證一致性較好。詳見表5。

3討論

CAD又稱為冠狀動脈性心臟病，是由于冠狀動脈改變引起的管腔狹窄、痙攣或阻塞，導致心肌缺血、缺氧或壞死的心臟病，動脈粥樣硬化是CAD的主要發病機制［12］。世界衛生組織報道，我國每年約70萬例病人死于CAD［13］。血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平異常與CAD的發生密切相關，這些因素也是干預和治療CAD的靶點［14］。CAD的發生是環境和遺傳因素共同作用的結果，是一種復雜的異質性疾病。家族流行病學研究顯示，遺傳敏感性是導致CAD發生的重要因素，遺傳因素占CAD所有危險因素的40%～60%［15］。SNP是人類可遺傳變異中的常見類型，指在基因水平由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性。相關研究表明，肝細胞核因子1A（hepatocyte nuclear factor 1 A，HNF1A）、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、溶酶體酸性脂肪酶A（lysosomal acid lipase A，LIPA）等脂類代謝相關基因多態性與CAD的發病有關［16］。目前，關于CYP24A1基因多態性與我國人群CAD風險關系的研究報道較少。因此，本研究探討CYP24A1酶多態性rs2762939與CAD的相關性，以期為闡明疾病的診斷和疾病發生的分子機制提供參考。

CYP24A1是CYPs家族的成員之一，參與膽固醇、類固醇和其他脂質合成及藥物代謝等過程，具有促進1，25-二羥基維生素D［1，25-（OH）2D］的分解代謝和25-羥維生素D（25-OH）D的轉換、消除作用［17］。據報道，CYP24A1功能的喪失可影響血清1，25-（OH）2D水平，維生素D缺乏導致腎素和血管緊張素Ⅱ生成增加，是影響心血管疾病進展的重要因素［18］。CYP24A1的基因位點包括rs2762939、rs1570669、rs6068816等，其中，CYP24A1基因位點rs1570669與腦卒中風險降低有關，rs6068816可增加缺血性腦卒中的易感性［19］。Verdoia等［9］研究結果顯示，CYP24A1基因rs2762939多態性與冠心病的患病率和病情嚴重程度無關，C等位基因攜帶者顯著降低了冠狀動脈硬化的發生率。本研究結果顯示，CYP24A1酶多態性rs2762939基因型為GC型、CC型、G等位基因是導致CAD發生的獨立危險因素，與Verdoia等［9］研究結果存在差異，可能與不同種族和地域分布差異有關。

El-Menyar等［20］研究結果顯示，女性是影響CAD發生的獨立危險因素，CAD多發于中老年人群，中老年人群中的女性多處于圍絕經期和絕經期狀態，雌激素驟然降低，失去對心血管的保護作用，增加了CAD的發生風險。本研究未得到與El-Menyar等［20］研究結果一致的結論，可能與本研究樣本量不足有關，需擴大樣本量進一步探討。Jamee等［21］研究結果顯示，糖尿病、高血壓與CAD有顯著相關性。糖尿病病人血糖升高及胰島素抵抗，使血管內皮合成一氧化氮含量減少，促進血管收縮和血小板黏附，導致CAD風險增加。高血壓病人在血流動力學的作用下，冠狀動脈管壁剪切力發生變化，導致血管內皮結構和功能改變，發生脂質、血小板黏附沉積、血管內膜損傷，促進動脈粥樣硬化進展，從而增加CAD的發生風險。本研究結果顯示，血清TC、TG水平增加是導致CAD發生的獨立危險因素，與Qiu等［22］研究結果一致。進一步分析CYP24A1酶多態性rs2762939基因型與環境因素的交互作用結果顯示，GC、CC基因型均與糖尿病、高血壓、TC、TG均存在明顯的交互作用，表明GC、CC基因型與相關危險因素相互作用促進了CAD的發生發展。

綜上所述，CYP24A1酶多態性rs2762939與冠狀動脈疾病存在相關性，基因型GC型、CC型、C等位基因均是影響CAD發生的獨立危險因素，rs2762939的基因型GC、CC與糖尿病、高血壓、TC、TG之間的交互作用和CAD的發生有關。

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（收稿日期：2023-02-20）

（本文編輯薛妮）