基于表型性狀的花苜蓿遺傳多樣性分析

摘要：為探究花苜蓿（Medicago ruthenica L.）種質資源表型性狀的遺傳多樣性，本研究對采集自不同種源地的113份花苜蓿種質的19個表型性狀進行相關分析、主成分分析及聚類分析，為花苜蓿遺傳育種提供理論依據。結果表明，花苜蓿種質數量性狀和質量性狀的遺傳多樣性指數變化范圍分別為1.77～2.09，0.05～1.43。19個表型性狀間存在復雜的相關性，呈極顯著相關（Plt;0.01）和顯著相關（Plt;0.05）性狀分別有48和18對。19個表型性狀用主成分分析提取7個綜合因子，累積貢獻率為72.73%，通過計算綜合得分，并以綜合得分為因變量，19個性狀為自變量，利用逐步回歸分析篩選到評價花苜蓿種質的11個關鍵指標。113份花苜蓿可聚為3類，類群I代表種子粒大飽滿、產量較高的種質；類群II代表株叢面積大、種子產量中等的種質；類群III代表葉量豐富、種子產量較差的種質。

關鍵詞：花苜蓿；表型性狀；遺傳多樣性；種質資源

中圖分類號：S541""" 文獻標識碼：A" """"文章編號：1007-0435（2024）12-3733-10

收稿日期：2024-05-14；修回日期：2024-07-02

基金項目：內蒙古自治區種業科技創新重大示范工程“揭榜掛帥”項目（2022 JBGS0040）；內蒙古自治區科技重大專項（2021ZD0031）；內蒙古農業大學高層次人才引進科研啟動項目（NDGCC2016-18）資助

作者簡介：

杜柯（1999-），女，漢族，內蒙古巴彥淖爾人，碩士研究生，主要從事牧草種質資源與育種研究，E-mail：18247839261@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：fta223@imau.edu.cn

Genetic Diversity Analysis of Medicago ruthenica L.

Based on Phenotypic Traits

DU Ke， HUANG Wei-ye， HOU Rui-hong， GAO Jia-he， TANG Fang*

（Key Laboratory of Grassland Resources， Ministry of Education， Key Laboratory of Forage Cultivation， Processing and High

Efficient Utilization of Ministry of Agriculture， College of Grassland Science， Inner Mongolia Agricultural

University，Hohhot， Inner Mongolia 010010， China）

Abstract：In order to explore the genetic diversity of phenotypic traits of Medicago ruthenica L. germplasm resources，this study conducted correlation analysis，principal component analysis，and cluster analysis on 19 phenotypic traits of 113 M. ruthenica germplasm from different provenances. It will provide theoretical basis for genetic breeding of M. ruthenica. The results showed that the genetic diversity index of quantitative and quality traits ranged from 1.77 to 2.09 and from 0.05 to 1.43，respectively，in these 113 germplasm resources accessions of M. ruthenica. There were complex correlations among 19 phenotypic traits，with 48 and 18 pairs of traits showing extremely significant correlation （Plt;0.01） and significant correlation （Plt;0.05），respectively. Principal component analysis converted the 19 phenotypic traits into 7 composite factors with a cumulative contribution of 72.73%. By calculating the comprehensive score and using it as the dependent variable and 19 phenotypic traits as the independent variable，stepwise regression analysis was used to screen 9 key indicators for evaluating M. ruthenica germplasm. In addition，113 M. ruthenica varieties were grouped into 3 categories. Group I represented germplasm with large seeds and high seed yield;Group II represented germplasm with large cluster area and moderate seed yield;and Group III represented germplasm with abundant leaves and poor seed yield.

Key words：Medicago ruthenica L.;Phenotypic traits;Genetic diversity;Germplasm resources

花苜蓿（Medicago ruthenica L.）曾用名扁蓿豆，又名扁豆草、野苜蓿等，為豆科苜蓿屬多年生草本植物，其蛋白質含量高、不含皂素、家畜喜食，具有較高的飼用價值［1］。花苜蓿廣泛分布于我國甘肅、寧夏、內蒙古、山西、陜西、河北、黑龍江和四川等地［2-3］。由于花苜蓿生態幅較廣，其不同種群之間以及同一種群內不同個體之間的性狀具有豐富的遺傳多樣性［4］。

牧草種質資源的遺傳多樣性是牧草育種的基礎［5］，且表型變異作為植物遺傳多樣性的關鍵表征，由基因和環境因素共同影響和決定。同種牧草在不同的生長環境下或不同的選擇壓力等因素下，會不同程度地表現出遺傳的多樣性［6］。同時表型變異也是種質資源研究中的基礎手段［7］。近年來，國內外對花苜蓿的研究主要集中在抗性評價［8-9］、破除種子硬實［10］以及利用分子標記技術分析其遺傳多樣性［11-12］等方面，但基于表型性狀評價花苜蓿遺傳多樣性的研究鮮有報道。因此，本研究對113份采集自不同地區的野生花苜蓿種質資源進行表型性狀的調查，并對表型數據進行相關分析、主成分分析及聚類分析，探究花苜蓿種質資源表型性狀的遺傳多樣性，篩選優質花苜蓿種質資源，為花苜蓿新品種的培育提供理論支持和育種材料。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

供試材料為2021年9月至10月從不同種源地采集的野生花苜蓿種質資源及中國農業科學院草原研究所于2010年收集保存的種質資源，如表1所示。

1.2" 試驗地概況

試驗材料播種于內蒙古自治區包頭市土默特右旗薩拉齊試驗基地，地處東經110°34′33.69″，北緯40°35′59.70″，海拔1009 m，屬于溫帶大陸性季風氣候。夏季炎熱短暫，降雨量少；冬季寒冷漫長。年均溫7.2℃，年降水379 mm，降雨主要集中在7—8月，無霜期130～140 d。

1.3" 試驗設計

供試材料種子經砂紙打磨后，75%酒精消毒30 s，蒸餾水沖洗3次，再用2%的NaClO溶液浸泡10 min，蒸餾水沖洗3次。每份材料隨機選取50粒種子，分3次重復置于培養皿中，每皿加入5 ml蒸餾水，室溫（光照16 h，黑暗8 h）培養7天后將其種植于育苗袋，2022年7月初將幼苗移栽至各小區。每小區面積為4 m×5 m，株行距60 cm穴播種植，正常田間管理。各小區內選擇表型差異較大的3株材料，于2023年開花期-結實期測定表2中列出的19個表型指標。

1.4" 數據統計與分析

運用軟件Excel 2021整理數據，計算各表型性狀的變異系數及遺傳多樣性指數，用SPSS 26及Origin 2021對數據進行相關分析、主成分分析及聚類分析。采用Shannon-Wiener多樣性指數（H′）表示性狀的多樣性，計算公式為：

H′=-∑PilnPi

式中Pi表示某性狀第i級別內材料數占總份數的百分比［13-14］。

2" 結果與分析

2.1" 花苜蓿種質資源數量性狀遺傳多樣性分析

對113份花苜蓿種質資源的14個數量性狀進行變異分析及遺傳多樣性分析。由表3可知，14個數量性狀均存在不同程度的變異，變化范圍為6.24%～62.19%。其中，相對高度的變異系數最大，為62.19%，表明該性狀變異最豐富；株叢面積的變異系數較大，超過36%，表明該表型性狀具有較大的遺傳變異；葉長、葉寬、絕對高度、單位長度小葉數、單莢粒數、莢長、莢寬、種子長的變異系數范圍為6.36%～22.25%。113份花苜蓿種質資源的數量性狀變異豐富，可為花苜蓿新品種選育提供優異種質資源。

不同種質資源花苜蓿的遺傳多樣性指數（H′）范圍為1.77～2.09，遺傳多樣性整體較豐富；其中，葉長與莢寬最大為2.09，單位長度小葉數最小為1.77。遺傳多樣性指數由高到低排序依次為葉長=莢寬＞絕對高度＞葉寬＞相對高度=千粒重=種子長＞莢長＞株叢面積＞種子厚＞種子寬＞單莢粒數＞裂莢率＞單位長度小葉數。由表3可知，花苜蓿在種內表現出較大的差異，遺傳多樣性較豐富。

2.2" 花苜蓿種質資源質量性狀遺傳多樣性分析

由表4可知，5個質量性狀的遺傳多樣性指數在0.05～1.43之間，多樣性指數最高的為白粉病抗性，達1.43，表明白粉病抗性受環境影響較大；最低的為花色，為0.05，表明該性狀最穩定。不同種質花苜蓿的花色多為黃紫色；莖色以綠、紫色兼有為主；葉色的各個級別分布較均勻；株型以半平臥型為主，半直立、平臥型花苜蓿占比小且直立型花苜蓿占比0%；白粉病抗性按照感染白粉病的葉片數占葉片總數的比例分為高抗、抗、中抗、感病及高感，其中高抗所占比例最大，高感植株占比最小。

2.3" 花苜蓿種質資源表型性狀的相關分析

對113份花苜蓿的19個表型性狀進行了相關分析（表5），發現19個表型性狀間存在不同程度的相關性。呈極顯著相關關系（Plt;0.01）的性狀有48對，29個性狀間存在極顯著正相關關系（Plt;0.01），分別為株叢面積與相對高度、絕對高度、莢長、莢寬、種子厚、千粒重；葉長與相對高度；葉寬與單莢粒數、白粉病抗性；相對高度與絕對高度、千粒重；絕對高度與莢長、莢寬、種子長；單位長度小葉數與株型；單莢粒數與莢長；莢長與莢寬、千粒重；莢寬與種子長、種子寬、千粒重；種子長與種子寬、種子厚、千粒重；種子寬與種子厚、千粒重；種子厚與千粒重、莖色；花色與莖色。19個性狀間存在極顯著負相關關系（Plt;0.01），分別為株叢面積與單位長度小葉數、花色；葉長與株型；葉寬與種子長、千粒重；相對高度與單位長度小葉數、株型；絕對高度與單位長度小葉數；單位長度小葉數與莢長、莢寬、種子長、種子厚、千粒重；單莢粒數與種子長、種子寬、千粒重；白粉病抗性與種子長、種子寬、千粒重。結果表明，株叢面積、葉長、葉寬、相對高度、絕對高度及單莢粒數等性狀與多項性狀具有正相關性，白粉病抗性與種子產量相關性狀間存在負相關關系，因此可作為篩選花苜蓿優異種質的指標。

2.4" 花苜蓿種質資源表型性狀的主成分分析

采用極差法對113份花苜蓿種質資源的19個表型性狀的原始數據進行標準化處理，同時進行主成分分析，結果表明，前7個主成分的累積貢獻率達72.73%（表6），可較大程度地反映不同種質花苜蓿的表型特征。

第一主成分的特征值為4.31，貢獻率為22.68%，株叢面積、單位長度小葉數、千粒重、絕對高度、相對高度、種子長與種子寬的載荷量絕對值較高，說明第一主成分主要由株叢大小、種子產量及質量決定。第二主成分與第三主成分的特征值及貢獻率分別為2.74，14.43%與1.81，9.50%，且其葉寬與葉長的載荷量最高，可概括為葉形性狀。第四主成分、第五主成分及第六主成分主要反映了花苜蓿的外部形態特征，第四主成分的特征值為1.63，貢獻率為8.56%，花色載荷量最高。第五主成分的特征值為1.17，貢獻率為6.18%，莖色的載荷量最高。第六主成分的特征值為1.11，貢獻率為5.85%，葉色的載荷量最高，達0.83。第七主成分的特征值為1.05，貢獻率為5.53%，裂莢率、白粉病抗性的載荷量絕對值較高。

用表6中各主成分的載荷值除以其對應的特征值的算術平方根，得到各主成分表達式，同時計算7個主成分的權重系數，其分別為0.31，0.20，0.13，0.12，0.09，0.08，0.08。將極差標準化后的19個表型性狀X1-X20代入7個主成分表達式中，以每個公因子所對應的方差貢獻率占累積貢獻率的比例為權重系數，構建綜合評價模型：

Y=0.05X1+0.10X2-0.14X3+0.15X4+0.15X5+0.17X6+0.05X7+0.12X8+0.09X9+0.11X10+0.09X11-0.03X12-0.02X13+0.06X14+0.00X15+0.07X16+0.64X17+0.07X18+0.14X19。將綜合得分與19個表型性狀分別作為自變量及因變量，利用逐步回歸分析構建最優回歸方程：Y=0.12+0.11X9+0.15X4+0.15X10+0.14X19+0.13X8+0.08X17-0.11X3+0.07X14+0.08X2+0.14X5+0.16X6。該方程的相關系數r=0.98，決定系數R2=0.964，表明X9（莢寬）、X4（相對高度）、X10（種子長）、X19（白粉病抗性）、X8（莢長）、X17（莖色）、X3（葉寬）、X14（裂莢率）、X2（葉長）、X5（絕對高度）、X6（單位長度小葉數）共11個表型性狀能夠代表總變異的96.4%，可作為評價花苜蓿種質資源表型性狀的綜合指標。

2.5" 花苜蓿種質資源表型性狀的聚類分析

對113份花苜蓿材料的19個表型進行聚類分析，如圖1、圖2所示，材料被分為3大類群。類群I的108份種質資源來源于內蒙古、山西及河北，占種源總數的95.58%；第II類群包括3份種質資源，分別為MrS64，MrS65，MrS97，均來源于內蒙古地區，占種源總數的2.65%；第III類群包括2份種質資源MrS18，MrS19，均來自河北，占種源總數的1.77%。

對各類群性狀進行統計分析（表7、表8）。類群I表現為葉長最長、種子長最長、種子寬最寬、種子厚最大、千粒重及植株裂莢率最高。表明該類群的種子較飽滿且產量較高，但裂莢較為嚴重；花色多為黃紫色；莖色多為綠紫色；半平臥植株占比最大，半直立與平臥型植株占比小；該類群抗白粉病的能力較強。

類群II表現為株叢面積最大、葉寬最寬、絕對高度與相對高度最高、單莢粒數最多、莢長最長，但千粒重較小；花色多為黃紫色；綠色莖占比小，綠紫色莖占比較大；株型多為半平臥型，存在少部分平臥型植株。表明該類群株叢較大、單莢粒數多，但種子體積較小。

類群III表現為單位長度小葉數最多，種子長度、厚度及千粒重均最小；該類群不存在高感及感病植株；表明該類群葉量最豐富、抗白粉病的能力較強，但種子的質量與產量較差；花色全部為黃紫色，植株平臥型占比大，半平臥植株占比小。

3" 討論

花苜蓿種質資源具有豐富的遺傳多樣性，是品種改良和選育的寶貴資源庫［15］。以表型性狀為基礎進行多樣性研究，能直接反映植物的外部特征，有利于了解其進化潛力和遺傳穩定性，能為優異種質資源的篩選利用提供科學參考［16］。本研究表明，113份花苜蓿的數量性狀變異程度較高，變異系數為6.24%～62.19%。種子長、寬、千粒重的變異系數分別為8.00%，6.24%，17.00%，與李鴻雁等［17］的研究基本一致。供試材料表型性狀遺傳多樣性豐富，且數量性狀的遺傳多樣性指數比質量性狀高，與前人在冰草［18］、水稻［19］和玉米［20］中的結果相似。

主成分分析是利用降維的方法，用少數幾個主成分概括多個性狀指標的統計分析方法［21］。本研究對19個表型性狀進行主成分分析，結果表明，表型性狀的前7個主成分反應總信息量的72.73%，包括株叢大小與種子產量特性因子、葉形性狀因子、株高性狀因子。第一主成分中，株叢面積和單位長度小葉數決定了株叢大小，這些性狀可作為提高花苜蓿草產量的依據；花苜蓿由于其高裂莢率、強落粒性，導致其在生產實踐中種子損失嚴重，千粒重、種子長、種子寬、裂莢率等性狀與種子產量有關，可為選育種子高產的花苜蓿提供依據。本研究根據主成分分析結果構建綜合評價模型，并與19個表型性狀相結合構建線性回歸方程，有利于花苜蓿優異種質資源的篩選及新品種的選育。

聚類分析將113份花苜蓿種質資源分為3個類群。第I類群的花苜蓿裂莢較嚴重但抗白粉病能力強且種子粒大飽滿，綜合表現較優異，第III類群的花苜蓿葉量豐富且整體抗白粉病能力較強。因此，第Ⅰ，Ⅲ類群花苜蓿可作為選育種子高產、株叢密度大的優良材料；第II類群的花苜蓿株叢面積最大、單莢粒數最多但單位長度小葉數最少、千粒重較小，可能受到環境影響，也可能與自身的遺傳變異有關［22］，因而可作為遺傳機制的重要研究對象。本研究結果表明，地理來源相近的種源分布在不同類群，表明種質間的遺傳差異不僅與地理來源相關，還受到遺傳因子和環境因子的影響，與前人的研究結果一致［23-25］。

4" 結論

花苜蓿種質資源表型性狀差異顯著，株叢面積、相對高度、絕對高度、單位長度小葉數的變異幅度較大。19個表型性狀間存在復雜的相關性，呈極顯著相關（Plt;0.01）和顯著相關（Plt;0.05）關系的性狀分別有48對和18對；單位長度小葉數、莢長、莢寬、絕對高度、相對高度、種子長、莖色、葉長、葉寬、裂莢率和白粉病抗性等是影響花苜蓿表型的主要性狀。聚類分析將113份花苜蓿分為3類，類群I代表種子粒大飽滿、產量較高的種質；類群II代表株叢面積大、種子產量中等的種質；類群III代表葉量豐富、種子產量較差的種質。

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（責任編輯" 閔芝智）