鹽脅迫下外源褪黑素對苜蓿生理特性及細胞超微結構的影響

摘要：為探究不同濃度外源褪黑素（Melatonin，MT）對NaCl脅迫下紫花苜蓿生理特性及細胞超微結構的影響，本試驗以耐鹽品種‘中苜3號’紫花苜蓿（Medicago sativa L.‘Zhongmu No.3’）和敏鹽品種‘公農1號’紫花苜蓿（Medicago sativa L.‘Gongnong No.1’）為材料進行水培試驗。結果顯示，外施不同濃度MT均可有效減輕鹽脅迫給苜蓿幼苗帶來的一系列生理損傷。其中，150 μmol·L-1MT處理可顯著增加幼苗體內抗氧化酶活性、滲透調節(jié)物質和羥自由基清除效率，同時在此濃度下，可有效降低鹽脅迫下丙二醛、相對電導率、過氧化氫含量。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MT通過維持紫花苜蓿幼苗葉肉細胞膜的完整性，從而減輕鹽脅迫對紫花苜蓿葉肉細胞超微結構的鹽害。這些結果表明，MT通過在鹽脅迫條件下增強抗氧化防御活性來減少細胞膜損傷和活性氧（Reactive oxygen species，ROS）積累。

關鍵詞：紫花苜蓿；褪黑素；生理特性；超微結構；鹽脅迫

中圖分類號：S541""" 文獻標識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）12-3743-09

收稿日期：2024-04-01;修回日期：2024-06-23

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)重點研發(fā)專項（2023B02031）；國家牧草產業(yè)技術體系（CARS-34）資助

作者簡介：

劉沂欣（1999-），女，漢族，河南鶴壁人，碩士研究生，主要從事牧草栽培與種子生產研究，E-mail：liuyixin202203@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：sxq303@163.com

Effects of Exogenous Melatonin on the Physiological Characteristics and Cellular

Ultrastructure of Alfalfa Under Salt Stress

LIU Yi-xin1， WANG Xin-yao1， SUI Xiao-qing1*， LI Pei-ying1， ZHANG Qian-bing2， XU Bo3

（1.College of Grassland， Xinjiang Agricultural University， Key Laboratory of Grassland Resources and Ecology， Ministry of Education，

Western Arid Desert Region， Xinjiang Key Laboratory of Grassland Resources and Ecology， Urumqi， Xinjiang 830052， China;

2.School of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832000， China; 3.School of Forestry and Grass Science，

Jilin Agricultural University， Changchun， Jilin Province 130118， China）

Abstract：Using the salt tolerant cultivar Medicago sativa L. ‘Zhongmu No.3’ and the sensitive salt cultivar Medicago sativa L.‘Gongnong No.1’ as test materials，theeffects of different concentrations of exogenous MT on the physiological characteristics and cellular ultrastructure of alfalfa under salt stress were explored by hydroponic test. The results showed that the external application of different concentrations of MT effectively reduced the physiological damage caused by salt stress on alfalfa seedlings. Among them，150 μmol·L-1MT treatment significantly increased the activity of antioxidant enzymes，osmoregulatory substances and hydroxyl radical clearance efficiency in seedlings，and effectively reduced the content of Malondialdehyde，relative conductivity，hydrogen peroxide under salt stress. Further studies revealed that MT alleviated the salt damage to the ultrastructure of alfalfa mesophyll cells by maintaining the integrity of the mesophyll cell membrane in alfalfa seedlings. This study showed that MT reduced cell membrane damage and reactive oxygen species accumulation by enhancing antioxidant defense activity under salt stress conditions.

Key words：Alfalfa;Melatonin;Physiological characteristics;Salt stress;Ultrastructure

鹽脅迫俗稱鹽害，是指當植物生長在鹽分過高的環(huán)境中危害自身正常生長的現(xiàn)象［1］，鹽脅迫下植物的各種生命活動都受到不同程度的影響，主要表現(xiàn)為抑制植物的生長發(fā)育、破壞植物細胞結構以及影響維持植物正常生理代謝所需生物分子的合成等方面。通常，土壤中鹽分過高會對植物造成滲透脅迫、離子毒害以及破壞細胞正常代謝［2］。為適應鹽分脅迫，植物自身形成了一系列生理調節(jié)機制，包括酶、非酶和滲透調節(jié)等系統(tǒng)。酶系統(tǒng)由一系列抗氧化酶組成，如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶等；非酶系統(tǒng)包括還原型谷胱甘肽和微量元素銅、鋅、硒等［3］；滲透調節(jié)系統(tǒng)包括可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等。其中，酶系統(tǒng)在活性氧清除中起主要作用［4］。植物耐鹽堿性研究已成為關乎農業(yè)持續(xù)發(fā)展及鹽堿地改良的研究熱點［5］。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）為多年生豆科（Fabaceae）牧草，在我國栽培歷史悠久且種植面積廣泛，具有較高的營養(yǎng)價值，被譽為“牧草之王”［6］。紫花苜蓿葉片具有排鹽機制，其葉片細胞中的各類細胞器是進行生理活動的重要場所，與其他牧草相比，紫花苜蓿具較高的耐鹽性和改良土壤鹽漬化的作用［7-8］，是修復和利用鹽漬化土壤的首選植物。但不同苜蓿品種間耐鹽性差異較大，鹽脅迫條件下植物自身形態(tài)結構變化較為復雜，明確植物在鹽脅迫下的變化有利于認識植物的耐鹽響應。

褪黑素（Melatonin，MT）是一種有效的自由基清除劑和抗氧化劑，在植物生長和抵抗非生物脅迫方面發(fā)揮著多重作用，能有效減輕逆境脅迫對植物造成的損害［4，9］。在脅迫條件下，植物會產生活性氧，過量的活性氧不可避免地導致氧化損傷［10］。相關研究表明，MT在脅迫條件可以直接清除過多的活性氧，并能增強抗氧化酶系統(tǒng)的活性，控制植物中過氧化氫的爆發(fā)，保護植物免受氧化應激［11］。因此，向植物施用褪黑素被認為是緩解鹽脅迫的有效途徑。迄今為止，MT在牧草上的應用研究較少，其在不同苜蓿品種中介導鹽脅迫對生理調控的作用仍有待探索。基于此，本研究以耐鹽性不同的2種紫花苜蓿為材料，探討添加外源MT對紫花苜蓿生理特性及細胞超微結構的影響，旨在為利用MT來提高紫花苜蓿的耐鹽性以及研究其耐鹽栽培措施提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 供試材料的選擇與預處理

以耐鹽品種‘中苜3號’紫花苜蓿（Medicago sativa L.‘Zhongmu No.3’）和敏鹽品種‘公農1號’紫花苜蓿（Medicago sativa L.‘Gongnong No.1’）為試驗材料，種子分別由新疆農業(yè)大學草業(yè)學院和吉林農業(yè)大學林學與草學學院提供。選取顆粒飽滿的種子置于質量分數(shù)為8% NaClO溶液中消毒15 min，再用蒸餾水清洗4～5遍后備用。

1.2" 試驗設計

將消毒后的種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿100粒，濾紙用蒸餾水完全浸濕后，置于人工氣候箱（恒溫25℃、濕度80%）中培養(yǎng)至發(fā)芽，光周期設置為12 h/12 h（晝/夜），將10日齡幼苗用海綿包裹固定在泡沫板孔內，移苗至裝有1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液的水培盒（290 mm×130 mm×110 mm）內進行水培培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)液。四周后挑選長勢一致的苜蓿進行脅迫處理。試驗共設置6個處理（表1），CK組為空白對照，僅采用Hoagland’s營養(yǎng)液培養(yǎng)，每2 d對苜蓿葉片正反面噴施50 mL的蒸餾水；N組為未添加MT的NaCl溶液處理，每2 d對苜蓿進行根灌處理；NM組為添加MT的NaCl溶液處理，正式脅迫開始前用不同濃度的褪黑素對其進行預處理48 h，之后每2 d對苜蓿葉片正反面噴施1次50 mL的MT。上述處理脅迫時長為7 d，統(tǒng)一于傍晚進行噴施，共計噴施3次。

1.3nbsp; 指標測定

1.3.1" 紫花苜蓿植株葉片生理指標的測定" 丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定［12］；相對電導率使用電導儀（STARTER 3100C）測定；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍G-250（Coomassie Brilliant Blue G-250）染色法測定［13］；可溶性糖采用蒽酮比色法［13］。脯氨酸含量采用磺基水楊酸法［14］；超氧化物歧化酶活性采用氮藍四唑（Nitro blue tetrazolium，NBT）光還原法［15］；過氧化氫酶活性采用紫外吸收法［12］；過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法［13］；谷胱甘肽S-轉移酶活性采用紫外吸收法［14］；谷胱甘肽還原酶活性采用紫外吸收法［14］；抗壞血酸含量、還原型谷胱甘肽含量、過氧化氫含量均使用紫外吸收法測定［15-16］；羥自由基清除率采用分光光度法測定［17］。

1.3.2" 葉片細胞超微結構觀察" 試驗結束后，次日取植株頂端到基部第2～4葉的中間葉片葉肉組織，取樣大小為1 mm×3 mm，每個處理3次重復，取樣后立即采用質量分數(shù)為5％戊二醛溶液固定，于冰箱內4℃保存；透射電鏡超薄切片制作參考李德燕等［18］的方法。細胞超微結構采用日立H-7600 透射電子顯微鏡觀察并拍照［19］。

1.4" 數(shù)據分析

數(shù)據處理使用EXCEL 2020，采用Origin 2019和IBM SPSS 22.0軟件對數(shù)據進行分析作圖，使用Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗（Plt;0.05）。

2" 結果與分析

2.1" 鹽脅迫下外源MT對紫花苜蓿植株內滲透調節(jié)能力的影響

如圖1（A），圖1（B）和圖1（C）所示，‘公農1號’和‘中苜3號’紫花苜蓿植株葉片中游離脯氨酸（Free proline，Pro）含量和可溶性蛋白（Soluble protein，SP）含量均呈先升高后降低的趨勢。其中，NM3處理下2種苜蓿植株葉片中Pro較N處理相比分別顯著增加了20.64%和96.04%（Plt;0.05）；N處理下‘公農1號’葉片中SP較CK相比顯著上升（Plt;0.05），NM3處理下2個苜蓿品種較N處理相比分別增加了31.75%和27.43%；NM2處理下‘公農1號’葉片中可溶性糖（Soluble sugar，SS）含量較N相比顯著上升了30.19%（Plt;0.05），NM3處理下‘中苜3號’葉片中SS較N相比顯著上升了70.38%；結果表明：‘公農1號’紫花苜蓿植株葉片中Pro和SP以NM3處理效果最佳，SS以NM2處理效果最佳；‘中苜3號’紫花苜蓿植株葉片中Pro，SP和SS含量均以NM3處理效果最佳。

2.2" 鹽脅迫下外源MT對紫花苜蓿植株內抗氧化能力的影響

2.2.1" 鹽脅迫下外源MT對紫花苜蓿植株內抗氧化酶活性的影響" 超氧化物歧化酶（Super oxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、谷胱甘肽S-轉移酶（Glutathione S-transferase，GST）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）是重要的抗氧化酶，其作用是通過清除植物中重要的活性氧來保護細胞免受氧化損傷。

由圖2（A）和圖2（B）所示，應用MT處理后，‘公農1號’和‘中苜3號’SOD和CAT活性均有所上升，其中，2個苜蓿品種均以NM3處理效果最佳，并較CK相比表現(xiàn)出顯著性差異（Plt;0.05）。由圖2（C）可知，經外源MT處理后，‘公農1號’在NM4處理下的POD活性最高，較N處理顯著增加了42.90%（Plt;0.05）；‘中苜3號’在NM3處理下與N處理相比升幅最高，為20.35%。

由圖2（D）和2（E）可知，在N處理下，‘公農1號’和‘中苜3號’GST和GR活性均有所上升，與CK相比，分別增加了15.38%，5.18%；53.19%，40.33%，經外源MT處理后，2個品種GST和GR活性的NM3處理與N處理相比顯著升高（Plt;0.05），分別上升了49.07%，29.80%；60.80%，71.04%。

2.2.2" 鹽脅迫下外源MT對紫花苜蓿植株內抗氧化物含量的影響" 如圖3（A）所示，N處理下‘公農1號’和‘中苜3號’還原型谷胱甘肽（Glutathione reduced，GSH）含量與CK相比分別下降了0.46%和22.93%；經外源MT處理后，耐鹽和敏鹽苜蓿的GSH含量均高于N處理且與CK相近。如圖3（B）所示，‘公農1號’和‘中苜3號’的還原型抗壞血酸（Ascorbic acid，ASA）含量總體呈波浪式先升高后降低的趨勢。在N處理下，2個品種的ASA含量與CK相比顯著上升了106.30%，107.07%（Plt;0.05）。經外源MT處理后，除‘中苜3號’的NM4處理外，2個品種的NM1，NM2，NM3處理中ASA含量與N處理相比均有所升高，其中，2個品種均以NM3處理效果最佳。

2.2.3" 鹽脅迫下外源MT對紫花苜蓿植株氧化傷害和細胞膜穩(wěn)定性的影響" 如圖4（A）所示，2個苜蓿品種的羥自由基清除率總體呈先升后降的趨勢。在N處理下，‘公農1號’和‘中苜3號’的羥自由基清除率與CK相比分別升高了25.89%，27.18%，且與CK處理表現(xiàn)出顯著性差異（Plt;0.05）；經外源MT處理后，2個品種的NM1，NM2，NM3，NM4處理與N處理相比均有所上升，其中，2個品種在NM3處理下的羥自由基清除率較N處理相比增幅最大，分別為20.02%，17.20%。

如圖4（B）所示，與CK相比，N處理下‘公農1號’和‘中苜3號’的丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量均呈大幅上升，且與CK表現(xiàn)出顯著性差異（Plt;0.05）。經外源MT處理后，2個品種的MDA含量較N處理相比均有所下降，其中，在NM3處理的MDA含量下降幅度最大，分別下降了28.88%和30.10%，但隨著MT濃度的增加，2個苜蓿品種植株中葉片的MDA含量反而增多，這表明MDA含量的降低與外源MT濃度的增多并不完全成正比關系。

由圖4（C）可知，‘公農1號’和‘中苜3號’的相對電導率（Relative conductivity，RC）均呈先升高后降低而后升高的趨勢。在N處理下，2個品種的RC與CK相比分別增加了199.00%，169.48%，且表現(xiàn)出顯著差異性（Plt;0.05）；經葉面噴施MT后，2個品種的NM1，NM2，NM3，NM4處理與N處理下的RC相比均有所降低，其中，2個品種的NM3處理下降幅度最大，分別降低了36.17%和37.37%，與N處理相比表現(xiàn)出顯著差異性（Plt;0.05）。

如圖4（D）所示，2個品種的過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）含量總體表現(xiàn)出先升高后降低而后升高的趨勢。在N處理下，2個品種的H2O2含量與CK相比均表現(xiàn)出顯著性差異，且呈大幅度升高；在外源MT處理后，2個品種的NM1，NM2，NM3，NM4處理與N處理下的H2O2含量相比呈波動式降低，其中，‘公農1號’和‘中苜3號’在NM3處理下的H2O2含量最低，與N相比分別下降了45.62%和39.31%，且與N處理相比表現(xiàn)出顯著性差異（Plt;0.05）。

2.3" 鹽脅迫下不同濃度MT對紫花苜蓿葉片細胞超微結構的影響

‘公農1號’和‘中苜3號’紫花苜蓿葉片細胞超微結構如圖5（A）和圖5（B）所示，2個品種的CK組（圖1-1，1-2，1-3）中葉綠體呈橢圓形，排列整體，緊密附著在細胞壁上，被膜界限清晰可見，基質片層結構完整有序，線粒體呈橢球體，與葉綠體毗鄰分布。當給予150 mmol·L-1鹽脅迫時（圖2-1，2-2，2-3），‘公農1號’葉片細胞被膜界限遭到破壞，葉綠體發(fā)生形變，長度減小、寬度增加，縱橫比降低；葉綠體基粒數(shù)量減少，層狀結構無序，線粒體形狀不規(guī)則且發(fā)生分解；而耐鹽苜蓿‘中苜3號’被膜界限清晰，基質片層清晰可見，葉綠體結構完整但其存在質壁分離現(xiàn)象。

當噴施50 μmol·L-1MT時（圖3-1，3-2，3-3），‘公農1號’葉綠體體積較N縮小且出現(xiàn)質壁分離現(xiàn)象，但內部結構較完整，基粒類囊體堆疊整齊；‘中苜3號’葉綠體發(fā)生腫脹，內部結構完整，基質類囊體與N相比數(shù)量較多。當噴施100 μmol·L-1MT（圖4-1，4-2，4-3）時，‘公農1號’部分葉綠體結構發(fā)生腫脹，葉綠體膜遭到輕微破壞，內部基質片層清晰可見，線粒體呈橢球形。當噴施150 μmol·L-1MT時（圖5-1，5-2，5-3），2個品種的葉綠體與CK相比發(fā)生形變，但與N相比被膜界限清晰可見，內部結構較為完整且不存在質壁分離現(xiàn)象。當噴施200 μmol·L-1MT時（圖6-1，6-2，6-3），‘公農1號’葉綠體呈不規(guī)則形，內部結構空隙增大，出現(xiàn)輕微質壁分離現(xiàn)象，基粒片層松散；‘中苜3號’葉綠體形狀接近CK，內部結構完整，被膜界限遭到輕微破壞，線粒體形狀規(guī)則。

2.4" 主成分分析

對紫花苜蓿的14個生理指標進行主成分分析，獲得因子載荷和貢獻率（表1）。3個主成分累計貢獻率高達73.87%，可有效反映供試材料耐鹽性的絕大部分信息。在第1個主成分中（PC1），GR具有較高的因子載荷，為0.90；在第2個主成分中（PC2），H2O2具有較高的因子載荷，為0.91；在第3個主成分中（PC3），Pro具有較高的因子載荷，為0.79。因此，GR，H2O2和Pro可作為篩選紫花苜蓿耐鹽性的關鍵指標。

3" 討論

隨著生態(tài)環(huán)境的不斷變化，世界鹽堿地面積逐年增加，土壤鹽堿化已成為農業(yè)發(fā)展的主要障礙，MT是一種環(huán)保的生物活性分子，在緩解植物鹽脅迫中起著重要作用［20］。植物在逆境脅迫下會增加滲透調節(jié)物質的合成和積累［21］。本試驗中，NaCl處理下紫花苜蓿葉片中Pro，Sp，SS含量持續(xù)增加，噴施外源MT后，Pro，Sp，SS等滲透調節(jié)物質顯著增加，值得注意的是，‘公農1號’在100 μmol·L-1MT處理下的SS含量最高，‘中苜3號’在150 μmol·L-1MT處理下的SS含量最高。類似的研究已經證實［22-25］，該化合物通過增加滲透調節(jié)物質的含量來增強植物的耐鹽性，且MT與增強效果之間隨著植物物種和品種不同而存在劑量關系［26-28］。

在鹽脅迫條件下，褪黑激素在增強抗氧化酶活性和清除活性氧方面發(fā)揮積極的作用。植物在受到鹽脅迫時自身抗氧化酶的高活性是植物抵御ROS損傷所必需的，抗氧化活性越高，其氧化耐受性就越強。在本研究中，應用外源MT處理可顯著增加紫花苜蓿葉片中CAT，POD，GST，GR等抗氧化物酶活性和ASA，GSH等非酶物質的含量，在150 μmol·L-1MT處理下顯著清除了鹽脅迫下紫花苜蓿葉片中的羥基自由基。這與Jiang［26］、趙東豪［29］、吳華鑫［30］、張婷［31］的研究結果一致。RC和MDA是衡量細胞膜透性的重要指標，其值越大，表示電解質的滲漏量越多，細胞膜受害程度越重［32］。本研究中，當外施MT濃度為150 μmol·L-1時，在鹽脅迫下無論是耐鹽苜蓿還是敏鹽苜蓿的RC和MDA含量均最低。這與王文靜［33］、王小山［34］、崔雪雯［25］的研究結果相符。在正常和鹽脅迫條件下，MT處理導致H2O2清除以增強植物的抗氧化能力［35］。本試驗中，鹽脅迫處理下‘公農1號’和‘中苜3號’的H2O2含量在外施MT濃度為150 μmol·L-1時達到最低，這與田卜伊［36］、寇江濤［37］的研究結果一致。

葉綠體是植物進行光合作用的地方，也是植物細胞產生ROS的主要場所，對非生物脅迫最敏感［38-39］。線粒體是細胞進行呼吸的主要場所，也是植物對外部環(huán)境最敏感的細胞器之一。外界環(huán)境的變化會導致線粒體功能障礙，從而增加ROS，影響抗氧化酶的活性［40］。先前研究表明，MT在不利條件下可使番茄（Solanum lycopersicum L.）［41］、玉米（Zea mays L.）［42-43］、小麥（Triticum aestivum L.）［44］和葡萄（Vitis vinifera L.）［45］的葉綠體損傷得到改善，進而緩解其生長發(fā)育。本研究結果顯示，鹽脅迫下耐鹽和敏鹽苜蓿葉片中的葉綠體外部均發(fā)生形變，層狀結構排列紊亂，線粒體遭到分解。施加50～150 μmol·L-1MT處理可緩解鹽脅迫造成的損傷，結合滲透調節(jié)系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的增加消除過量的ROS，減少植物細胞膜系統(tǒng)的損害。

4" 結論

綜上所述，采用150 μmol·L-1外源褪黑素處理對緩解紫花苜蓿植株鹽害效果最佳。外源褪黑素可顯著增強鹽脅迫下紫花苜蓿體內游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等滲透調節(jié)物質的積累和過氧化氫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽S-轉移酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶活性及還原型抗壞血酸、還原型谷胱甘肽等抗氧化非酶物質的含量，減少羥基自由基和相對電導率、丙二醛、過氧化氫的過度積累，從而減輕NaCI脅迫并維持細胞膜的完整性。主成分分析發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽還原酶、過氧化氫和脯氨酸可作為篩選紫花苜蓿耐鹽性的關鍵指標。目前的研究主要致力于應用外源MT以增強各種非生物和生物脅迫，今后可通過對MT生物合成途徑中基因的鑒定，篩選操縱其生物合成途徑中的基因表達，揭示MT在植物中的調控機制。

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（責任編輯" 付" 宸）