基于雙向孟德爾隨機化的不同BMI分型非酒精性脂肪性肝病與2型糖尿病的遺傳關聯分析

摘要：目的運用雙向雙樣本孟德爾隨機化（MR）評估非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）與2型糖尿病（T2DM）的遺傳關聯，并進一步探討不同BMI的NAFLD人群與T2DM的因果關系。方法數據來源于以歐洲人群為研究對象的全基因組關聯研究，其中NAFLD的樣本量為32 941例，T2DM為312 646例，BMI為681 275例。運用單變量、多變量MR方法評估NAFLD總人群及各BMI亞型與T2DM之間的雙向因果關系。采用逆方差加權法、MR-Egger回歸、約束最大似然與模型平均法、加權中位數法進行MR分析，采用MR多效性殘差和與離群值、徑向MR、MR-Egger截距法、Cochran Q檢驗進行敏感性分析。結果單變量MR分析顯示NAFLD總人群與T2DM之間存在雙向因果關系（正向OR=9.75，95%CI：2.57～37.00，Plt;0.001；反向OR=1.01，95%CI：1.00～1.01，Plt;0.01）。多變量MR分析顯示經BMI校正后，NAFLD總人群與T2DM的因果關系仍然保持顯著（OR=33.12，95%CI：7.57～144.95，Plt;0.000 1）。亞組分析顯示，NAFLD各亞組均與T2DM存在因果關系（瘦型OR=12.19，95%CI：3.35～44.40，Plt;0.001；超重型OR=4.30，95%CI：1.69～10.92，Plt;0.01；肥胖型OR=1.67，95%CI：1.14～2.44，Plt;0.01）。結論本研究從遺傳學層面揭示了NAFLD總人群及各BMI亞型與T2DM之間的因果關系。

關鍵詞：非酒精性脂肪性肝病；糖尿病，2型；身體質量指數；孟德爾隨機化分析

基金項目：北京市高層次公共衛生技術人才建設項目培養計劃（學科帶頭人-03-04）；首都衛生科研發展專項基金（首發2020-2-2172）

The genetic association between nonalcoholic fatty liver disease and type 2 diabetes mellitus in different body mass index categories：A bidirectional Mendelian randomization study

DUAN Haoxin1，2，JIANG Yuyong2，WU Tingyu1，XIONG Feixiang1，JIANG Yandan1，ZHANG Qin1，ZHAO Saisai1，YU Hao2.（1.Graduate School，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2.Department of Integrative Medicine，Beijing Ditan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100015，China）

Corresponding author：YU Hao，yuhaodtyy@126.com（ORCID：0000-0002-2213-0725）

Abstract：Objective To investigate the genetic association between nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）and type 2 diabetes mellitus（T2DM）using bidirectional two-sample Mendelian randomization（MR），as well as the causal relationship between NAFLD and T2DM across different body mass index（BMI）categories.Methods The data were derived from genome-wide association studies conducted in European populations，with a sample size of 32 941 cases for NAFLD，312 646 cases for T2DM，and 681 275 cases for BMI.The univariate and multivariate MR methods were used to assess the bidirectional causal relationship between NAFLD and T2DM in the general population and across different BMI subtypes.The methods of inverse-variance weighting，MR-Egger regression，constrained maximum likelihood and model averaging，and weighted median were used to conduct the MR analysis，and MR-Pleiotropy Residual Sum and Outlier，radial MR，the MR-Egger intercept method，and the Cochrane Q test were used for sensitivity analysis.Results The univariate MR analysis revealed a bidirectional causal relationshipbetween NAFLD and T2DM in the general population（forward analysis：odds ratio［OR］=9.75，95%confidence interval［CI］：2.57—37.00，Plt;0.001；reverse analysis：OR=1.01，95%CI：1.00—1.01，Plt;0.01）.After adjustment for BMI，the multivariate MR analysis showed that the causal relationship between NAFLD and T2DM remained significant in the general population（OR=33.12，95%CI：7.57—144.95，Plt;0.000 1）.The subgroup analysis showed a causal relationship between NAFLD and T2DM across all BMI subtypes（lean subgroup：OR=12.19，95%CI：3.35—44.40，Plt;0.001；overweight subgroup：OR=4.30，95%CI：1.69—10.92，Plt;0.01；obese subgroup：OR=1.67，95%CI：1.14—2.44，Plt;0.01）.Conclusion This study reveals the causal relationship between NAFLD and T2DM in the general population of NAFLD and across different BMI subtypes from a genetic perspective.

Key words：Non-alcoholic Fatty Liver Disease；Diabetes Mellitus，Type 2；Body Mass Index；Mendelian Randomization Analysis

Research funding：Beijing Municipal High Rank Public Health Researcher Training Program（Discipline Leader-03-04）；Capital Health Research and Development Project（2020-2-2172）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與代謝相關的臨床病理綜合征，其表現為gt;5%的肝細胞存在脂肪變性，且無明顯的飲酒、病毒感染及其他繼發性原因［1］。近年來其患病率逐步增加［2］，為全人類亟待解決的健康問題之一。傳統上認為NAFLD與超重或肥胖高度相關［3］，然而近年來越來越多的研究［4-6］證明瘦型NAFLD亦為一種不容忽視的臨床類型，其往往有著更加嚴重的不良結局，因此不同BMI類型的NAFLD病理生理學原理及病程轉歸的差異仍待進一步挖掘。

2型糖尿病（T2DM）作為全身慢性代謝障礙的重要表現形式，其發病機制與胰島素抵抗密切相關［7］。大量流行病學資料顯示NAFLD和T2DM是兩種經常并存的病理狀態，多達2/3的T2DM患者罹患NAFLD［8］，近1/3的NAFLD患者罹患T2DM［9］，且瘦型NAFLD亦常與T2DM共存［10］。一項樣本量約為12 000例患者的研究［11］表明，NAFLD、肥胖和胰島素抵抗均與T2DM風險增加獨立相關，當三個危險因素同時存在時，患T2DM的風險增加了14倍。當前已有許多研究證實NAFLD、T2DM、BMI互為彼此病程進展的重要獨立預測因素，存在著顯著的相關性。

由于觀察性研究極易受到潛在混雜因素的影響，難以明確因果關聯，因此本研究擬引入一種全新的病因推斷方法——孟德爾隨機化（mendelian randomization，MR），通過將遺傳變異，即單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為工具變量，從基因層面模擬隨機對照試驗，評估暴露與結局之間的因果關聯［12］，從而極大地規避觀察性研究的天然缺陷，并降低反向因果的不良影響［13］。本研究旨在運用雙向單變量及多變量MR方法，探究NAFLD全人群及其各BMI亞型與T2DM之間的因果效應，更加深入地探討各亞型共病的異同及潛在機理，從而更好地指導臨床疾病管理，一定程度上減輕社會醫療負擔。

1資料與方法

1.1研究設計本研究遵循孟德爾隨機化研究報告規范（STROBE-MR指南）［14］。由于單樣本MR研究樣本重疊率較高、數據較難獲取，擬運用已發表的大型全基因組關聯研究（GWAS）匯總數據進行雙樣本MR分析，具體設計如下：首先，運用單變量MR分析探究NAFLD總人群與T2DM的因果關系，并進行反向分析；隨后，采用多變量MR分析，納入BMI新變量進行校正；最后，通過單變量MR分析進一步研究NAFLD亞組人群（瘦型：BMIlt;25 kg/m2，超重型：25 kg/m2≤BMIlt;30 kg/m2，肥胖型：BMI≥30 kg/m2）與T2DM的雙向因果關聯，并探討各組間的差異。研究流程見圖1。

1.2 NAFLD、T2DM、BMI的GWAS數據來源本研究中，NAFLD數據來自一項英國生物樣本庫（UKB）的GWAS研究，其中NAFLD的診斷依據為全肝質子密度脂肪分數≥5%，且排除了患有酒精性肝病、病毒性肝炎、藥物性肝損傷等參與者，其中病例組6 623例、對照組26 318例。此外，該GWAS研究進一步根據世界衛生組織的BMI分級標準，將該隊列分為瘦型、超重型和肥胖型三組，其中病例組分別為810、3 069、2 744例，對照組分別為12 804、10 641、2 873例［15］。T2DM數據源來自于常見代謝疾病知識門戶（CMDKP）網站（https：//hugeamp.org/）上發表的一篇GWAS-Meta研究，其中病例組33 139例、對照組279 507例［16］。BMI數據來自人體測量學性狀的遺傳研究聯盟（GIANT）（https：//portals.broadinstitute.org/collaboration/giant/index.php/GIANT_consortium）中的一篇已知樣本量最大的GWAS-Meta研究［17］。暴露與結局的詳細信息見表1。

1.3工具變量選擇為了篩選出合格的遺傳工具變量，制定以下標準：（1）符合關聯性假設：以Plt;5×10?8為過濾條件，篩選出與暴露因素顯著相關的SNP位點，其中部分數據（瘦型NAFLD/肥胖型NAFLD→T2DM）因缺乏足夠數量的SNP（n≤2）而無法進行MR分析，故放寬過濾標準，改取Plt;5×10?6；（2）去除連鎖不平衡：以連鎖不平衡系數r2lt;0.001，區域寬度kbgt;10 000為過濾條件，保證SNP之間的獨立性；（3）滿足排他性假設：在上述得到的SNP中，去除與結局數據相關的SNP，P值同第一步；（4）避免反向因果：通過Steiger檢驗，清除與結局相關性比暴露相關性大的SNP［18］；（5）運用Harmonise協同處理：將工具變量的效應等位基因對齊，去除回文SNP，最終獲得能夠代表暴露因素的最佳工具變量。

1.4 MR分析采用R 4.3.1軟件，調用TwoSampleMR、MendelianRandomization等軟件包進行以下分析：單變量MR及亞組分析方面，IVW［19］是評價MR因果效力最高的方法，計算OR及95%CI，評估表型間潛在的因果關聯，另以MR-Egger回歸［20］、cML-MA［21］、WM［22］作為MR證據補充的次要方法。當IVW方法Plt;0.05時，代表存在因果關系，若在此基礎上MR-Egger、cML-MA、WM法與IVW的效應值方向相同，則進一步加強了該因果關聯的穩定性。多變量MR分析［23］方面，使用IVW方法評估多個暴露對結局的影響，當Plt;0.05時表示存在因果關系。此外對所有結果進行反向分析，探知是否存在反向因果關聯。

1.5敏感性分析水平多效性方面，首先運用MR-Egger截距法識別潛在的水平多效性，當Pgt;0.05時提示不存在多效性，遵循MR基本核心假設［24］；采用MR多效性殘差和與離群值（MR-PRESSO）檢驗［25］剔除離群值，若MR-PRESSO檢驗全局P值或MR-Egger截距法P值仍然lt;0.05，則進一步采用徑向MR方法［26］剔除離群值后再進行MR分析，以加強結果的穩健性。異質性方面，采用Cochran Q檢驗［27］量化評估，當Pgt;0.05時表示不存在異質性，提示MR結論相對可靠；當存在異質性時，則運用IVW隨機效應模型分析。此外，采用Leave-one-out檢驗［28］，計算逐一剔除各個SNP后剩余SNP的效應值，以評估每個SNP對總效應值的影響。

2結果

2.1 NAFLD總人群與T2DM的單變量MR分析IVW分析結果顯示，NAFLD與T2DM存在正向因果關聯（OR=9.75，95%CI：2.57～37.00，Plt;0.001）。除MR-Egger回歸以外，cML-MA、WM法的結果亦具有統計學意義，且各補充方法的效應值方向均與IVW分析結果保持一致。反向分析方面，IVW分析提示T2DM與NAFLD亦存在因果關聯（OR=1.01，95%CI：1.00～1.01，Plt;0.01）（圖2）。2.2經BMI調整的多變量MR分析IVW分析結果顯示，經BMI調整后，NAFLD與T2DM的因果關系仍然保持顯著（OR=33.12，95%CI：7.57～144.95，Plt;0.000 1）（圖3）。2.3以BMI分層的亞組分析（圖4）

2.3.1瘦型NAFLD IVW分析結果顯示，瘦型NAFLD與T2DM存在雙向因果關聯（正向OR=12.19，95%CI：3.35～44.40，Plt;0.001；反向OR=1.01，95%CI：1.00～1.01，Plt;0.01）。

2.3.2超重型NAFLD IVW分析結果顯示，超重型NAFLD與T2DM存在雙向因果關聯（正向OR=4.30，95%CI：1.69～10.92，Plt;0.01；反向OR=1.01，95%CI：1.00～1.02，Plt;0.01）。

2.3.3肥胖型NAFLD IVW分析結果顯示，肥胖型NAFLD與T2DM存在正向因果關聯（OR=1.67，95%CI：1.14～2.44，Plt;0.01）。反向IVW分析顯示，T2DM與肥胖型NAFLD未觀察到因果關聯（OR=1.01，95%CI：0.99～1.02，P=0.54）。

2.4敏感性分析水平多效性方面，亞組分析中的瘦型NAFLD與T2DM的MR-Egger截距法Plt;0.05，故而采用徑向MR方法進一步剔除離群值，調整后MR-PRESSO檢驗P值gt;0.05，不存在水平多效性；經BMI調整的多變量組MR-Egger截距法計算P=0.71，不存在水平多效性；其余各組結果亦提示不存在水平多效性。異質性方面，Cochran Q檢驗顯示除NAFLD總人群對T2DM組（P=0.02）、經BMI調整的多變量組（Plt;0.000 1）、超重型NAFLD對T2DM組（P=0.04）結果存在異質性，采用隨機效應模型，其余各組P值均gt;0.05，提示不存在異質性（表2）。Leave-one-out檢驗森林圖可見每組各SNP剔除后的效應值均位于0的同側，提示各組結果較為穩健（圖5）。

3討論

NAFLD是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝病［29］，長期臨床觀察發現NAFLD與T2DM常常共病，因此兩疾病間潛在的因果效應歷來為研究者的熱點話題。近年雖然已有兩疾病相關MR研究發表［30-31］，但鮮有探討NAFLD各BMI亞型與T2DM之間的關系。本研究基于歐洲人群GWAS數據來源，運用MR分析，一方面明確了NAFLD總人群與T2DM之間的雙向因果關系，并發現以NAFLD指向T2DM較為顯著；另一方面通過亞組分析量化了瘦型、超重型、肥胖型NAFLD與T2DM之間的因果效應，發現OR效應值與BMI呈潛在的負向線性關系，即BMI越小，NAFLD與T2DM的因果關聯越強。

通過單變量MR分析，本研究發現NAFLD總人群與T2DM互相存在因果關系（正向OR=9.75，反向OR=1.01），且正向效應更為顯著。Mantovani等［32］在一項涉及296 439例人群的Meta分析中發現，NAFLD患者發生T2DM的風險比無NAFLD的患者高約2倍。他們在隨后的研究［33］中還指出，脂肪變性和肝纖維化越嚴重，罹患T2DM的風險越高，并且與年齡、性別和肥胖無關。NAFLD和T2DM之間存在很強的雙向關系，有大量流行病學數據［34］表明NAFLD多發生于T2DM之前，但也有少部分資料表明T2DM優先發生。從病理機制角度來看，一方面NAFLD通過脂肪沉積、炎癥、內質網應激等途徑加劇肝臟胰島素抵抗，促進血糖升高，推動T2DM進展；另一方面，T2DM還可通過胰島素抵抗、炎癥、氧化應激等加劇糖脂代謝紊亂，引發NAFLD，加速肝纖維化、肝硬化乃至肝癌的進程［35］。二者互相促進疾病的發展，大大增加不良結局的風險［36］。此外，眾所周知NAFLD的發生發展是遺傳因素、環境因素綜合作用的結果，其中patatin樣磷脂酶結構域蛋白3（PNPLA3）rs738409、跨膜蛋白6超家族成員2（TM6SF2）rs58542926基因多態性均是較強的遺傳預測因子［37］。在一項涉及30萬余人的大型GWAS研究［38］中，PNPLA3 I148M與TM6SF2 E167K的遺傳變異不僅與脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝細胞癌相關，還與較高的T2DM風險密切相關。一項動物實驗研究［30］顯示，與對照組小鼠相比，PNPLA3 I148M小鼠不僅表現出明顯的NAFLD遺傳易感性，還在糖耐量試驗中表現出了高血糖狀態和葡萄糖清除率延遲。因此，遺傳變異層面也可印證NAFLD與T2DM之間的相關性。

隨后，本研究加入BMI表型進行了多變量MR分析。眾所周知，超重/肥胖、T2DM是代謝綜合征的重要特征，NAFLD也常被認為是代謝綜合征的肝臟表現［39］。然而，盡管NAFLD、T2DM患病率的升高趨勢與超重/肥胖保持一致［3，40］，但瘦型患者中NAFLD的流行現象提示超重/肥胖并非NAFLD的唯一驅動因子，不應將超重/肥胖作為NAFLD篩查的唯一標準［41］。多變量MR分析結果表明，在校正遺傳預測的BMI后NAFLD和T2DM的因果關系仍然成立（OR=33.12），這一定程度上驗證了NAFLD對T2DM的風險并不全與超重/肥胖相關，這一結果對解釋瘦型NAFLD的存在具有重要意義。

對NAFLD進行BMI分層的亞組分析，結果顯示NAFLD各BMI亞型與T2DM均存在正向因果關系（瘦型OR=12.19，超重型OR=4.30，肥胖型OR=1.67），且OR效應值隨BMI的升高而降低。這意味著瘦型NAFLD與T2DM的因果關系更強烈，超重型NAFLD次之，肥胖型NAFLD最弱。這也預示著瘦型NAFLD與超重/肥胖型NAFLD在病理機制方面可能存在差異。首先，PNPLA3 rs738409基因多態性是瘦型NAFLD的主要危險因素之一，它通過降低甘油三酯水解酶活性、提高溶血磷脂酸酰基轉移酶活性，促使脂質分解下降而合成增加，從而增加肝臟脂肪含量［42-43］。研究［5］表明，與超重/肥胖型患者相比，瘦型NAFLD患者攜帶PNPLA3 rs738409 G等位基因的比例較高，且它是與瘦型NAFLD患者發生非酒精性脂肪性肝炎和顯著纖維化（分級≥2級）相關的唯一獨立變量。因此，該基因的遺傳易感性使得一部分瘦型人群患病風險大大增加。同時，在胰島素抵抗方面，超重/肥胖型NAFLD患者由于肝臟和肝外胰島素輸送和提取的顯著增加不足以補償胰島素敏感性的降低，從而導致葡萄糖穩態受損［44］。而瘦型NAFLD患者不僅存在隱形的內臟肥胖，其骨骼肌質量也比超重/肥胖NAFLD患者更低［45］，而骨骼肌質量的減少不僅會導致更嚴重的脂肪變性和肝纖維化［46］，還會促使葡萄糖攝取和代謝減少，加重胰島素抵抗［47］，進而更容易導致T2DM的發展。綜上所述，瘦型NAFLD以胰島素抵抗和內臟肥胖為核心，受遺傳易感性等因素的影響更強，因此可能會導致更高的T2DM風險。

然而，在真實世界的觀察性研究中不難發現，瘦型NAFLD人群中患有T2DM的比例往往比超重/肥胖型NAFLD人群低，如一項Meta分析［6］顯示，僅有19.56%的瘦型NAFLD受試者患有T2DM，而45.70%的肥胖型NAFLD受試者患有T2DM。這可能與研究只采用了單一的BMI作為衡量肥胖的指標有關。有研究［48］發現，在正常腰圍組（男性lt;90 cm，女性lt;80 cm）中，超重型NAFLD是T2DM的獨立危險因素，而在高腰圍組（男性≥90 cm，女性≥80 cm）中，瘦型NAFLD是T2DM的獨立危險因素，并且發生T2DM的風險略高于超重/肥胖型NAFLD（HR：3.88 vs 3.30）。同樣，另一項觀察性研究［49］也表明在高腰圍組（男性≥102 cm，女性≥88 cm）中，瘦型NAFLD患者發生T2DM的風險顯著高于超重/肥胖型NAFLD患者（OR：13.0 vs 5.3）。這提示在未來的研究中，宜在以BMI分層的基礎上，加入更多中心性肥胖指標（如腰圍、腰臀比等）進一步探討二者共病的風險。

本研究首次運用MR探討以BMI分層視角下NAFLD與T2DM的關系，優勢在于采用MR研究規避了傳統觀察性研究存在的混雜、偏倚相關難題，結合多變量分析、亞組分析探討了NAFLD、T2DM和BMI之間的復雜關系，增強了因果推斷結論的可靠性。此外，本研究也存在一定的局限性：（1）本文中部分反向OR結果顯示接近于不顯著，雖然通過MR補充方法、敏感性分析確認了結果具有較好的穩健性，但仍待在未來開展更多的GWAS研究進一步驗證結果的準確性及可重復性；（2）本文觀察到部分組別存在異質性，這可能源于不同研究人群、環境因素，導致效應估計的不一致，盡管已經引入了IVW隨機效應模型進行評估，但其結果可能與臨床存在部分差異；（3）本文中部分工具變量數量較少，可能一定程度上會限制研究的統計效能和結果的可靠性，此外，在肥胖型NAFLD與T2DM的反向MR分析中，未觀察到有統計學意義的因果關聯，可能與樣本量較少有關，以上問題均提示還需待基因檢測等技術進步后確定更多的工具變量。

NAFLD與T2DM的共病作為當前的研究熱點，其因果關系、病理基礎、關聯機制等一直受到眾多研究者的關注。本文采用MR，從基因層面揭示了二者的雙向因果關系，并對以BMI分層的NAFLD亞型進行深入探究，為兩病互治互防的臨床策略提供一定參考。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：段浩鑫負責文章設計，數據處理與分析，論文撰寫；江宇泳、于浩負責思路指正，寫作指導和文章修改；吳亭彧、熊飛翔負責數據處理與分析；姜艷丹、張琴、趙賽賽負責文獻檢索，數據搜集。

致謝：感謝GWAS Catalog、代謝疾病知識門戶網站、人體測量學性狀的遺傳研究聯盟、英國生物樣本庫等公開數據集及有關工作人員的努力。

數據可用性聲明：本研究所用數據均來自公共數據庫，可從文中提到的PMID或數據鏈接進行下載。

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收稿日期：2024-06-04；錄用日期：2024-07-25

本文編輯：王瑩

引證本文：DUAN HX， JIANG YY， WU TY， et al. The genetic association between nonalcoholic fatty liver disease and type 2 diabetes mellitus in different body mass index categories： A bidirectional Mendelian randomization study[J]. J Clin Hepatol， 2024， 40（10）： 1992-1999.

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