基于mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路探討抗纖抑癌方對肝癌前病變大鼠模型的調控作用

摘要：目的研究抗纖抑癌方對肝癌前病變大鼠模型mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路的影響。方法40只雄性Wistar大鼠，分為正常組、模型組、抗纖抑癌組和鱉甲軟肝組，每組各10只。正常組大鼠腹腔注射生理鹽水，劑量為0.4 mL/100 g，其他3組大鼠以50 mg/kg劑量腹腔注射二乙基亞硝胺，制備肝癌前病變大鼠模型。通過免疫組化和Western Blot法檢測GST-Pi的表達，實時熒光定量PCR和Western Blot法檢測mTOR、HIF-1α、VEGF、M2型丙酮酸激酶（PKM2）、葡萄糖載體蛋白1（GLUT-1）mRNA及蛋白的表達。計量資料多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H秩和檢驗，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果與正常組比較，模型組大鼠肝組織GST-Pi蛋白表達顯著升高（Plt;0.01）；與模型組比較，抗纖抑癌組GST-Pi蛋白表達水平顯著降低（Plt;0.05）。與正常組比較，模型組大鼠肝組織GLUT1及PKM2 mRNA的表達均顯著升高（P值均lt;0.01）；與模型組比較，鱉甲軟肝組及抗纖抑癌組GLUT1 mRNA的表達均顯著降低（P值均lt;0.05）。與正常組比較，模型組大鼠肝組織GLUT1及PKM2的蛋白表達均顯著升高（P值均lt;0.01）。與正常組比較，模型組大鼠肝組織mTOR、HIF-1α及VEGF的mRNA表達均顯著升高（P值均lt;0.01）；與模型組比較，鱉甲軟肝組mTOR及VEGF的mRNA的表達均顯著降低（P值均lt;0.05），抗纖抑癌組mTOR及VEGF mRNA的表達亦顯著降低（P值均lt;0.01）。與正常組比較，模型組大鼠肝組織mTOR、HIF-1α、VEGF的蛋白表達均顯著升高（P值均lt;0.01）；與模型組相比，鱉甲軟肝組只有mTOR的蛋白表達顯著降低（Plt;0.01），抗纖抑癌組mTOR、HIF-1α、VEGF的蛋白表達均顯著降低（P值均lt;0.05）；與鱉甲軟肝組相比，抗纖抑癌組mTOR的蛋白表達較高（Plt;0.01）。結論抗纖抑癌方可通過調控mTOR/HIF-1α/VEGF信號抑制肝癌前病變。

關鍵詞：肝腫瘤；信號傳導；抗纖抑癌方；大鼠，Wistar

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（81603555）；北京市自然科學基金青年科學基金項目（7174319）；北京市豐臺中西醫結合醫院院自然基金（YS2022-01）

Regulatory effect of Kangxian Yiai Prescription in a rat model of precancerous lesions of liver cancer：A study based on the mTOR/HIF-1α/VEGF signaling pathway

LI Zhiguo1，MA Xun2，YE Yongan3，YANG Xianzhao3.（1.Department of Gastroenterology，Fengtai Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Beijing 100072，China；2.Department of Traditional Chinese Medicine，Beijing Xing Yuan Jin Fang Clinic of Chinese Medicine，Beijing 101300，China；3.Institute of Liver Diseases，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China）

Corresponding author：LI Zhiguo，lizhiguo1888@163.com（ORCID：0000-0003-3533-2542）

Abstract：Objective To investigate the effect of Kangxian Yiai Prescription（KXYA）on the mTOR/HIF-1α/VEGF signaling pathway in a rat model of precancerous lesions of liver cancer.Methods A total of 40 male Wistar rats were divided into normal group，model group，KXYA group，and Biejia Rangan Tablets（BJRG）group，with 10 rats in each group.The rats in the normal group were given intraperitoneal injection of normal saline at a dose of 0.4 mL/100 g，and those in the other three groups were given intraperitoneal injection of diethylnitrosamineat a dose of 50 mg/kg to establish arat model of the precancerous lesions of liver cancer.Immunohistochemistry and Western Blot were used to measure the expression level of GST-Pi，and quantitative real-time PCR and Western Blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of mTOR，HIF-1α，VEGF，PKM2，and GLUT1.A one-way analysis of variance or the Kruskal-Wallis H test was used for comparison of continuous data between multiple groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups.Results Compared with the normal group，the model group had a significant increase in the protein expression level of GST-Pi in liver tissue（Plt;0.01），and compared with the model group，the KXYA group had a significant reduction in the protein expression level of GST-Pi（Plt;0.05）.Compared with the normal group，the model group had significant increases in the mRNA expression levels of GLUT1 and PKM2 in liver tissue（Plt;0.01），and compared with the model group，the BJRG group and the KXYA group had a significant reduction in the mRNA expression level of GLUT1（Plt;0.05）.Compared with the normal group，the model group had significant increases in the protein expression levels of GLUT1 and PKM2 in liver tissue（Plt;0.01）.Compared with the normal group，the model group had significant increases in the mRNA expression levels of mTOR，HIF-1α，and VEGF in liver tissue（Plt;0.01）；compared with the model group，the BJRG group had significant reductions in the mRNA expression levels of mTOR and VEGF（Plt;0.05），and the KXYA group also had significant reductions in the mRNA expression levels of mTOR and VEGF（Plt;0.01）.Compared with the normal group，the model group had significant increases in the protein expression levels of mTOR，HIF-1α，and VEGF in liver tissue（Plt;0.01）；compared with the model group，the BJRG group had a significant reduction in the protein expression level of mTOR（Plt;0.01），and the KXYA group had significant reductions in the protein expression levels of mTOR，HIF-1α，and VEGF（Plt;0.05）；compared with the BJRG group，the KXYA group had a significantly higher protein expression level of mTOR（Plt;0.01）.Conclusion KXYA can inhibit the precancerous lesions of liver cancer by regulating themTOR/HIF-1α/VEGF signaling pathway.

Key words：Liver Neoplasms；Signal Transduction；Kangxian-Yiai Formula；Rats，Wistar

Research funding：National Natural Science Foundation of China Youth Science Fund Project（81603555）；Beijing Natural Science Foundation Youth Science Fund Project（7174319）；Beijing Fengtai Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital Natural Science Foundation（YS2022-01）

肝癌作為全球范圍內發病率和死亡率較高的惡性腫瘤，其發病機制涉及病毒感染、酒精濫用、肥胖以及不潔飲食等［1-2］。肝癌前病變與肝癌的發生密切關聯［3］。肝癌前病變缺氧微環境的形成與能量代謝異常密切相關。糖酵解在缺氧條件下發揮著關鍵作用，與腫瘤的發生和發展密切相關［4-5］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor1α，HIF-1α）/血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路作為細胞適應缺氧環境的重要調控網絡，近年引起廣泛關注。

mTOR參與細胞生長、增殖和代謝的調控［6］。在低氧環境中，mTOR與HIF-1α協同作用，共同參與調控細胞對缺氧的適應性反應［7-8］。HIF-1α通過調控多個基因的表達，包括VEGF，參與調節血管生成、細胞存活和炎癥反應等生物學過程［9-10］。VEGF作為一個重要的促血管生成因子，在包括肝癌在內的多種腫瘤的血管生成中發揮關鍵作用［11-12］。

抗纖抑癌方是葉永安教授治療肝癌及其癌前病變的經驗方，臨床療效顯著［13-14］。然而，其在分子水平上對肝癌前病變的調控機制仍然不清楚。因此，本研究探討抗纖抑癌方對mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路的調控作用，深入研究其對肝癌前病變的影響，以期為肝癌前病變的預防和治療提供新的理論與實驗基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物40只健康雄性Wistar大鼠（SPF級），體質量（175±20）g，由北京維通利華公司購得［實驗動物生產許可證：SCXK（京）2016-0006］。在東直門醫院動物房（SPF級）進行常規飼養（恒溫、恒濕、自由飲食飲水），實驗動物使用許可證：SYXK（京）2015-0001。

1.2實驗藥品抗纖抑癌方顆粒劑成分包括柴胡、山藥、白芥子、黃芪等，由南寧培力藥業供應，通過質控鑒定確保為同一批次。復方鱉甲軟肝片（批準文號：Z19991011，中國內蒙古福瑞中蒙藥科技公司生產）；二乙基亞硝胺（N0756，美國Sigma公司）。

1.3主要試劑與儀器Anti-HIF1α（ab1，英國abcam公司），Anti-PKM2（3198S，美國CST公司），Anti-mTOR（2972S，美國CST公司），Anti-VEGF（ab53465，英國abcam公司），Anti-GLUT1（1293S，美國CST公司），Anti-GSTPi（ab53943，英國abcam公司），GAPDH（ab8245，英國abcam公司），Trizol（R401-1，南京諾唯贊生物科技有限公司），M-MLV反轉錄試劑盒（A2791，美國Promega公司），Real-time PCR擴增試劑盒（Q121-02，南京諾唯贊限公司），DAB顯色試劑盒（DA1010，北京索萊寶公司）。Western Blot電泳系統（美國Bio-rad公司），CFX96 Q-PCR儀（美國Bio-rad公司），NanoDrop分光光度計（美國Malcom公司），PCR引物由美國life technology公司代工合成。

1.4實驗方法

1.4.1分組與模型制備采用隨機數字表法，分為正常組、模型組、抗纖抑癌方組和鱉甲軟肝組，每組10只。制備基于肝硬化基礎上的肝癌前病變動物模型［15］。正常組大鼠腹腔注射生理鹽水，劑量為0.4 mL/100 g，其他3組大鼠以50 mg/kg劑量腹腔注射二乙基亞硝胺，每周1次，連續14周后成功制備模型。

1.4.2給藥造模后第9周，抗纖抑癌方組和鱉甲軟肝組大鼠開始藥物灌胃，劑量分別相當于抗纖抑癌方、復方鱉甲軟肝片臨床劑量的7倍。每次用藥體積均按1 mL/100 g的劑量給藥，每天1次，連續給藥，共6周。正常組和模型組大鼠灌胃對應量的蒸餾水，每天1次，連續給藥，共6周。

1.4.3標本采集在實驗的第14周末，停止給藥24 h后，以0.33 mL/100 g的劑量給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，從腹主動脈采集大鼠血液。在距離最大葉肝臟約1 cm處，取得約1 cm×1 cm×0.3 cm的組織樣本，隨后浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定。同時，迅速將部分肝組織存放于液氮中，以備進行實時熒光定量PCR和Western Blot分析。

1.4.4免疫組化法檢測大鼠肝組織中胎盤型谷胱甘肽轉移酶（GST-Pi）表達將切片置于二甲苯中浸泡脫蠟，浸入乙醇溶液中水化；置于抗原修復液中煮沸修復；滴加3%H2O2溶液以及一抗（稀釋度1∶150），放入濕盒4℃過夜；加二抗以及DAB顯色，顯微鏡下觀察，蘇木素復染，細胞核變藍終止；按常規進行脫水、透明、封片。

1.4.5實時熒光定量PCR法檢測大鼠肝組織中GLUT1、PKM2、mTOR、HIF-1α和VEGF的mRNA表達使用Trizol提取組織中總RNA，用二步法進行mRNA表達的檢測；按試劑盒說明書進行反轉錄，合成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR反應。反應條件：預變性95℃4 min、95℃10 s、60℃10 s、72℃20 s，39個循環。以GAPDH作為內參照，采用2?ΔΔCT法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

1.4.6 Western Blot法檢測大鼠肝組織GLUT1、PKM2、mTOR、HIF-1α和VEGF的蛋白表達用蛋白裂解液于冰上裂解組織，按BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；將蛋白樣品分裝到離心管中，加上樣緩沖液，煮沸5 min；制備12%SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，上樣，電泳4～5 h，轉膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉，加入一抗4℃封閉過夜，孵育二抗1 h；ECL發光顯影，用Image J軟件對各條帶的灰度值進行分析。

1.5統計學方法采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析。計量資料多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H秩和檢驗，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1大鼠肝組織GST-Pi免疫組化及蛋白表達

2.1.1 GST-Pi免疫組化GST-Pi陽性灶為胞漿中棕黃色不規則形團塊。正常組未見明顯陽性表達，模型組則見較多陽性灶，肝小葉內及匯管區周圍均可見，染色深；抗纖抑癌及鱉甲軟肝組的陽性灶較模型組減少，染色較淺（圖1）。

2.1.2 GST-Pi蛋白表達與正常組比較，大鼠肝組織GST-Pi蛋白在模型組的表達顯著升高（Plt;0.01）；與模型組比較，抗纖抑癌組GST-Pi蛋白的表達水平顯著降低（Plt;0.05）（圖2）。結果表明抗纖抑癌方的應用顯著降低了大鼠GST-Pi的表達。

2.2抗纖抑癌方對大鼠肝組織GLUT1和PKM2的影響

2.2.1 GLUT1和PKM2 mRNA表達與正常組比較，模型組大鼠肝組織GLUT1及PKM2 mRNA的表達均顯著升高（P值均lt;0.01）；與模型組比較，鱉甲軟肝組及抗纖抑癌組GLUT1 mRNA的表達均顯著降低（P值均lt;0.05）（圖3）。

2.2.2 GLUT1和PKM2蛋白表達與正常組比較，模型組大鼠肝組織GLUT1及PKM2的蛋白表達均顯著升高（P值均lt;0.01）；與模型組比較，鱉甲軟肝組和抗纖抑癌組GLUT1及PKM2的蛋白表達無統計學差異（P值均gt;0.05）；鱉甲軟肝組與抗纖抑癌組GLUT1和PKM2的蛋白表達無顯著差異（P值均gt;0.05）（圖4）。

2.3抗纖抑癌方對大鼠肝組織mTOR、HIF-1α、VEGF的影響

2.3.1 mTOR、HIF-1α、VEGF mRNA的表達與正常組比較，模型組大鼠肝組織mTOR、HIF-1α及VEGF的mRNA表達均顯著升高（P值均lt;0.01）；與模型組比較，鱉甲軟肝組mTOR及VEGF的mRNA的表達均顯著降低（P值均lt;0.05），抗纖抑癌組mTOR及VEGF mRNA的表達亦顯著降低（P值均lt;0.01）。鱉甲軟肝組與抗纖抑癌組mTOR、HIF-1α、VEGF的mRNA的表達無顯著差異（P值均gt;0.05）（圖5）。

2.3.2 mTOR、HIF-1α、VEGF蛋白的表達與正常組比較，模型組大鼠肝組織mTOR、HIF-1α、VEGF的蛋白表達均顯著升高（P值均lt;0.01）；與模型組相比，鱉甲軟肝組只有mTOR的蛋白表達顯著降低（Plt;0.01），抗纖抑癌組mTOR、HIF-1α、VEGF的蛋白表達均顯著降低（P值均lt;0.05）；與鱉甲軟肝組相比，抗纖抑癌組mTOR的蛋白表達較高（Plt;0.01），HIF-1α、VEGF的蛋白表達無明顯差異（圖6）。

3討論

中醫藥在肝癌前病變的防治中發揮積極作用。臨床研究［16-18］表明，中藥單體及其組分發揮抗炎和抗氧化、調節免疫、抑制腫瘤血管生成、抑制細胞增殖等作用。中藥復方通過抑制上皮間質轉化、抑制血管生成，抑制細胞增殖、調節自噬、誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期和調節免疫功能等作用有效預防肝細胞癌變［16］。課題組前期研究［13-14，19］表明抗纖抑癌方可抑制肝細胞異常增生。

研究［20-22］表明，靶向mTOR/HIF-1α/VEGF是治療橫紋肌肉瘤、卵巢透明細胞腺癌和乳腺癌的有效策略。在肝癌方面，索拉非尼通過抑制mTOR相關信號通路，進而抑制HIF-1α的轉錄和蛋白表達，下調VEGF的表達［15］。本研究評估了抗纖抑癌方對mTOR/HIF-1α/VEGF途徑的影響，實時熒光定量PCR及Western Blot均證實抗纖抑癌方可抑制mTOR、HIF-1α和VEGF的表達。

mTOR/HIF-1α/VEGF通路在肝癌前病變的血管生成中發揮關鍵作用。肝癌前病變大鼠肝組織中mTOR的高表達與HIF-1α和VEGF上調提示該信號通路的活化。這一結果強調了mTOR/HIF-1α/VEGF通路在肝癌前病變血管生成中的潛在作用，為相關治療策略的制訂提供了新的見解。

此外，本研究觀察到抗纖抑癌方可明顯降低PKM2和GLUT-1及其上游mTOR/HIF-1α的蛋白表達水平，提示在缺氧環境的刺激下，mTOR/HIF-1α信號通路異常活化，上調糖酵解相關的基因，促進PKM2、GLUT-1的表達。本研究表明糖酵解是大鼠肝癌前病變缺氧微環境的代謝特征，參與肝癌前病變的進展，因此抑制糖酵解，改善局部微環境，可阻斷具有惡變潛能的癌前病變組織。

本研究的局限性：首先，抗纖抑癌方的主要生物活性成分有待進一步研究確定。其次，僅在體內實驗對抗纖抑癌方治療肝癌前病變的作用機制進行了探討，尚未進行細胞實驗對其機制進行進一步評估驗證。

綜上所述，通過探討抗纖抑癌方在肝癌前病變中的作用，揭示了其對mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路的抑制效應，進一步確認了其在阻止肝癌前病變進展方面的潛在作用。為深入研究提供了有力支持，同時也為開發更為精準的肝癌前病變干預策略奠定了基礎。有望通過深化對抗纖抑癌方機制的解析，推動更具前瞻性的治療策略的發展，為肝癌前病變的有效干預提供新的方向和可能性。

倫理學聲明：本研究方案于2017年5月經由北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物倫理委員會審批，批號：17-05，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：葉永安、楊先照對研究的思路或設計有關鍵貢獻；馬潯、李志國參與了研究數據的獲取分析解釋過程；李志國、楊先照參與起草及修改文章關鍵內容。

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收稿日期：2024-02-04；錄用日期：2024-03-07

本文編輯：林姣

引 證 本 文 ： LI ZG， MA X， YE YA， et al. Regulatory effect of Kangxian Yiai Prescription in a rat model of precancerous lesions of liver cancer： A study based on the mTOR/HIF-1α/ VEGF signaling pathway[J]. J Clin Hepatol， 2024， 40（10）： 2049-2054.

李志國， 馬潯， 葉永安， 等. 基于mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路探 討抗纖抑癌方對肝癌前病變大鼠模型的調控作用[J]. 臨床肝膽 病雜志， 2024， 40（10）： 2049-2054.