含水量對柱花草青貯品質和微生物群落動態的影響

摘要：本試驗旨在探究含水量對‘熱研2號’柱花草（Stylosanthes guaianensis SW. ‘Reyan No. 2’）青貯品質及微生物群落動態影響。試驗設鮮貯組（F組）和萎蔫組（S組），測定柱花草青貯飼料的動態發酵品質和營養成分，并在青貯14 d和60 d測定細菌群落。結果表明：S組粗蛋白和乙酸含量顯著高于F組，丁酸含量顯著低于F組（Plt;0.05）。青貯14 d和60 d后，S組青貯飼料梭菌屬（Clostridium）豐度顯著低于F組（Plt;0.05）。微生物群落（屬水平）與發酵指標關聯性分析發現柱花草青貯發酵14 d，F組腸桿菌屬（Enterobacter）與水溶性碳水化合物含量呈顯著負相關，S組腸桿菌屬與氨態氮含量呈顯著正相關，與CP含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；發酵60 d后，S組腸桿菌屬與WSC含量呈顯著負相關（Plt;0.05）。綜合來看，降低青貯前柱花草的含水量更有利于柱花草青貯飼料營養成分的保存和提高柱花草青貯飼料發酵品質。

關鍵詞：干物質；柱花草；營養成分；微生物多樣性；青貯品質

中圖分類號：S816.5""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2648-11

Effects of Moisture Content on the Fermentation Quality and Microbial

Community Diversity of Stylo Silage

HUANG Nai-xin， LI Xue-feng， ZHAN Xiao-xia， CUI Zhi-hai， MAO Kai， CHAI Huan，

WANG Mu-sen， WANG Jian*

（College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China）

Abstract：This experiment aimed to investigate the influence of moisture content on the dynamics of quality of ‘Reyan No. 2’ stylo silage and the bacterial communities. Experimental treatments of fresh stylo （F group） and wilting （S group） were established to investigate the dynamic of fermentation quality and nutritional components. Additionally，the bacterial communities of stylo silages were analyzed on days 14 and 60. The findings revealed that both crude protein and acetic acid content of stylo silage were significantly higher in the S treatment than in the F treatment，while the butyric acid content was significantly lower in the S treatment （Plt;0.05）. At the genus level，the relative abundance of Clostridium in the S treatment silage was significantly lower than that in the F treatment silage on days 14 and 60 （Plt;0.05）. The correlation analysis of both microbial communities （at the genus level） and fermentation indicators showed that Enterobacter was negatively correlated with the water-soluble carbohydrates content in the F treatment silage after 14 days of ensiling of stylo forage. In addition，the Enterobacter of treatment silage showed a significant （Plt;0.05） positive correlation with ammonia nitrogen content and a significant negative correlation with crude protein content. The Enterobacter of the S treatment silage was negatively correlated with WSC content （Plt;0.05） after 60 days of ensiling. In conclusion，it would be a good approach for preserving nutritional components and enhancing the fermentation quality of stylo silage when reduced the moisture content of the fresh stylo material forage before ensiling.

Key words：Dry matter;Stylo silage; Nutrition composition;Microbial diversity;Silage quality

柱花草（Stylosanthes guaianensis SW. ‘Reyan No.2’）是原產于拉丁美洲的熱帶豆科牧草，其蛋白質含量高，適口性好，具有耐高溫，抗旱適應性強等優點，被廣泛種植于熱帶亞熱帶地區用作動物的飼草［1］。然而柱花草生產存在季節性，夏秋季節產量大，在冬春季節卻幾乎生長停滯，這種季節生產的不平衡導致柱花草未能夠全年被充分利用，無法發揮出優質豆科牧草用于飼養反芻動物的優勢。因此，在柱花草生物量高峰期將其刈割制作成青貯飼料既可保證柱花草能全年利用，也能使當地畜牧業可持續發展。青貯是一種用于青綠飼料長期保存的方法，是基于厭氧條件下產生的乳酸菌發酵，在這個過程中，乳酸菌將牧草中的水溶性碳水化合物轉化為有機酸，主要是乳酸，從而降低青貯體系pH值抑制有害微生物的繁殖［2］。在青貯發酵過程中，青貯原料本身的含水量會在很大程度上影響青貯發酵進程和青貯品質。Su等［3］ 研究表明降低苜蓿（Medicago sativa）原料的含水量顯著影響了苜蓿青貯飼料發酵品質和微生物群落組成，干物質含量高的苜蓿原料在青貯60 d后青貯飼料與干物質含量低的相比具有更低的pH值和更高的乳酸含量。閆興全等［4］研究發現苜蓿含水量在55%時青貯，發酵品質整體優于70%含水量，55%含水量苜蓿青貯飼料的丁酸含量顯著低于70%含水量苜蓿青貯飼料。鐘書等［5］對含水量分別為70%和60%的紫花苜蓿進行青貯，發現通過降低青貯原料含水量，能有效抑制酵母菌等有害微生物活性和植物呼吸作用，含水量為60%的紫花苜蓿青貯飼料青貯效果優于含水量為70%的紫花苜蓿青貯飼料。但亦有研究報道新鮮刈割的牧草制備的青貯飼料具有更好的發酵品質，如Ke等［6］研究表明含水量為70%的紫花苜蓿青貯發酵60 d后，pH值，氨態氮含量和干物質損失率顯著低于含水量為62%的紫花苜蓿青貯飼料；Bao等［7］研究報道在相同添加劑處理下，原料水分較高的柱花草調制的青貯飼料發酵品質優于水分含量較低的柱花草，具體表現為低pH值，低氨態氮和高乳酸含量。

目前，關于柱花草的青貯研究多集中于不同添加劑對其青貯發酵品質及其營養成分的影響［8-10］，對不同含水量柱花草青貯過程中發酵品質及微生物多樣性變化報道還較少。因此，本試驗對不同含水量的柱花草進行青貯，分析其動態青貯發酵品質，營養成分以及微生物群落的變化，為柱花草調制青貯飼料生產提供理論參考和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為‘熱研2號’柱花草（Stylosanthes guaianensis ‘Renyan No.2’）種植于海南大學農科試驗地（20°06′N，110°32′E），原料采集時間為 2021 年7月12 日，此時柱花草為營養生長期，使用清潔消毒后的鐮刀刈割材料，采樣時盡量避免植株葉片的脫落，保持莖葉完整。

1.2 試驗設計

使用消毒后的手動鍘刀將柱花草鮮草切短至2～3 cm，混勻后，隨機分為2組，一組為鮮草直接青貯（鮮貯組，簡稱F組，含水量80% 左右），另一組萎蔫4小時后青貯（萎蔫組，簡稱S組，含水量69% 左右）。按照試驗設計每袋稱取250 g柱花草原料分裝至聚乙烯塑料袋（22×33 cm）中，每處理3重復，共42袋，使用真空封口機抽真空并密封室溫保存，分別在青貯1，3，5，7，14，30 和60 d后進行開袋，取樣測定分析其青貯指標及化學成分。

1.3 測定項目及分析方法

1.3.1 柱花草青貯發酵品質測定方法 分別稱取不同發酵天數的青貯飼料20 g，放入清潔滅菌后的250 mL廣口三角瓶中，加入70 g去離子水，在4℃冰箱浸提24 h后，經4層紗布和定性濾紙過濾后得到的浸提液用于測定pH值，有機酸［乳酸（Lactic acid，LA）；乙酸（Acetic acid，AA）；丙酸（Propionic acid，PA）；丁酸（Butyric acid，BA）和氨態氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）］含量。pH值通過CT-6021A型pH計對青貯飼料浸提液直接測定；有機酸采用高效液相色譜儀（日本島津SHIMADZU-LC 20A） 測定，測定條件：色譜柱為Carbomix H-NP；檢測器為SPD-M10AVP；流動相為0.2 mmol·L-1硫酸溶液，流速0.8 mL·min-1，柱溫60℃，紫外檢測波長 210 nm，進樣量10 μL；苯酚-次氯酸鈉比色法［11］測定氨態氮含量。

1.3.2 柱花草營養品質測定方法 取適量柱花草鮮草和柱花草青貯飼料用信封裝好后置于65℃烘箱干燥 72 h測定干物質（Dry matter，DM）；水溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrate，WSC）采用蒽酮-硫酸比色法測定［12］；粗蛋白質（Crude protein，CP）含量采用全自動凱氏定氮儀（K9860，山東海能科學儀器有限公司）進行測定；中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）含量按照范氏纖維分析法［13］測定樣品中的中性和酸性洗滌纖維含量。

1.3.3 微生物計數 采用平板計數法［14］測定乳酸菌，腸桿菌，酵母菌和梭菌的數量。每個樣品取10 g與100 mL無菌生理鹽水（8.5 g·L-1）充分混合均勻后，將其放入37℃，140 r·min-1的搖床里均質15 min，進行連續梯度稀釋（10-2 至10-8），進行涂布后計算微生物菌落數目。乳酸菌在MRS瓊脂上 37℃厭氧培養24 h后計數；酵母菌在玫瑰紅鈉瓊脂培養基上 28℃有氧培養 48 h后計數；腸桿菌在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂上 37℃有氧培養72 h后計數；丁酸梭菌在RCM培養基上37℃厭氧培養48 h后計數；以上培養基均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3.4 微生物總DNA提取和細菌菌落分析 參考Long等［15］方法提取青貯14 d和60 d的柱花草青貯飼料樣品的DNA，將提取的DNA送至上海派森諾生物科技有限公司進行測序，PCR擴增選用細菌 16S rRNA V3-V4區特異性引物338F（5′-+ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′），806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。使用Illumina NovaSeq機器上利用NovaSeq 6000 SP Reagent Kit （500 cycles）進行 2×250 bp雙端測序，再用QIIME2 2019.4 版本進行修改和完善的流程對微生物組生物學信息進行分析原始序列數據。使用demux插件進行解碼處理，cutadapt插件進行引物切除，然后使用DADA2插件對序列進行質量過濾，去噪，拼接和嵌合體去除等數據處理。對上述獲得的序列按100% 的序列相似度進行歸并，生成特征性序列ASVs以及豐度數據表格。使用QIIME2軟件計算分析alpha多樣性指數（Chao1指數和Simpson指數等），并繪制箱線圖，比較不同樣品之間ASV的豐富度和均勻度。

1.3.5 數據處理與統計 在Excel 2010 中做數據的基本處理，使用SPSS 26.0 軟件對各處理的營養指標和發酵指標進行方差分析，Duncan’s法對數據進行多重比較和顯著性分析（Plt;0.05）。

2 結果與分析

2.1 柱花草青貯前的特性

柱花草鮮草化學成分及微生物組成見表1。S組的DM含量為314.12 g·kg-1 FM，CP，ADF，NDF和WSC含量均高于F組。S組的乳酸菌數量為7.33 lg cfu·g-1，高于F組的5.83 lg cfu·g-1，萎蔫后酵母菌，霉菌和腸桿菌數量均低于F組，F組和S組柱花草中均未檢測到梭菌。

2.2 柱花草青貯過程中營養成分動態變化

由表2可知，含水量對柱花草青貯飼料的NDF，WSC含量有顯著影響（Plt;0.05），隨著柱花草含水量的下降，NDF，WSC含量顯著上升（Plt;0.05）。青貯時間對青貯飼料的DM，CP，WSC含量亦有顯著影響（Plt;0.05），隨著青貯天數的增加F組和S組青貯飼料的DM含量呈下降趨勢，與青貯第1 d相比，青貯60 d后F組青貯飼料的DM含量顯著下降了28.74 g·kg-1 FM（Plt;0.05），S組青貯飼料的DM含量顯著下降了21.04 g·kg-1 FM（Plt;0.05）；F組青貯飼料的CP含量顯著下降了51.00 g·kg-1DM（Plt;0.05），S組青貯飼料的CP含量顯著下降了40.41 g·kg-1DM（Plt;0.05）；S組青貯飼料的WSC含量顯著下降了13.65 g·kg-1DM（Plt;0.05）。含水量×青貯時間對青貯飼料的CP，NDF和WSC含量存在交互作用。

2.3 柱花草青貯過程中發酵品質動態變化

不同含水量柱花草青貯發酵品質變化見表3，含水量對青貯飼料的pH值、氨態氮、乳酸、丙酸和丁酸含量均有顯著影響（Plt;0.05）。隨著含水量的降低，青貯第30 d F組青貯飼料的pH值顯著低于S組青貯飼料（5.06vs 5.38，Plt;0.05）；S組青貯飼料的氨態氮在所有的青貯時間點均極顯著低于F組青貯飼料（Plt;0.01）；青貯第60 d F組青貯飼料乳酸和丁酸含量顯著高于S組，F組的乳酸和丁酸的含量分別為6.57 g·kg-1 DM和7.67 g·kg-1 DM，S組的乳酸和丁酸的含量分別為2.47 g·kg-1 DM和3.03 g·kg-1 DM（Plt;0.05）。青貯天數對柱花草青貯飼料pH值，氨態氮，乳酸，乙酸，丙酸和丁酸含量均有顯著影響（Plt;0.05）。隨著青貯天數的增加，F組青貯飼料的pH值在青貯第30 d后顯著下降至5.06（Plt;0.05），S組青貯飼料的pH值在青貯第60 d后顯著下降至5.27（Plt;0.05）。F組青貯飼料和S組青貯飼料的NH3-N含量隨著青貯時間的增加都呈極顯著上升（Plt;0.01），但S組青貯飼料的NH3-N極顯著低于F組（Plt;0.01）。在整個青貯發酵期間，F組青貯發酵至第60 d乳酸的含量最高為6.47 g·kg-1 DM；F組和S組青貯飼料的乙酸，丙酸和丁酸含量均隨著青貯天數的增多顯著增加（Plt;0.05），S組青貯發酵至第60 d乙酸含量最高為7.05 g·kg-1 DM，S組青貯飼料的丙酸含量在青貯14 d達到最大值2.14 g·kg-1 DM，F組青貯發酵至第60 d丁酸含量最高為7.67 g·kg-1 DM。青貯天數×含水量對青貯柱花草的pH值、氨態氮、乳酸、丙酸和丁酸含量存在交互作用（Plt;0.05）。

2.4 不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落變化

2.4.1 alpha多樣性 由圖1可知，青貯14 d后，F組青貯飼料的Chao 1指數與S組青貯飼料的相比變化顯著（Plt;0.05），但青貯60 d后F組青貯飼料的Chao 1指數與S組青貯飼料的相比無顯著變化。此外，青貯14 d和60 d的F組青貯飼料和S組青貯飼料的Simpson指數描述微生物群落多樣性的指標并無顯著差異。

2.4.2 屬水平上的微生物多樣性分析 不同含水量柱花草在青貯14 d和60 d后在微生物在屬水平上的相對豐度差異見圖2。隨著青貯天數的增加，F組青貯飼料中（D14_F，D60_F）乳球菌屬（Lactococcus）相對豐度顯著下降（D14_F，16.81%；D60_F，7.70%；Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12（Clostridium_sensu_stricto_12）相對豐度顯著增多（D14_F，5.64%；D60_F，11.51%；Plt;0.05）；芽孢乳酸桿菌屬（Sporolactobacillus）相對豐度顯著增多（D14_F，0.00%；D60_F，10.55%；Plt;0.05）。S組青貯飼料中（D14_S，D60_S），乳球菌屬相對豐度顯著減少（D14_S，21.96%；D60_S，7.89%；Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12相對豐度顯著增多（D14_S，0.18%；D60_S，6.49%；Plt;0.05）；乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度顯著增多（D14_S，4.17%；D60_S，12.64%；Plt;0.05）；魏斯氏菌屬（Weissella）對豐度顯著增多（D14_S，1.67%；D60_S，7.99%；Plt;0.05）。

F組青貯飼料和S組青貯飼料中主要微生物屬為腸桿菌屬（Enterobacter），乳球菌屬，乳桿菌屬和梭狀芽孢桿菌_12 等。F組青貯飼料與S組青貯飼料相比并未抑制青貯發酵14 d和60 d腸桿菌屬的相對豐度（D14_F，19.15%；D14_S，22.37%；D60_F，16.33%；D60_S，18.96%；Plt;0.05），但顯著抑制了梭狀芽孢桿菌_12 的相對豐度（D14_F，5.46%；D14_S，0.18%；D60_F，11.51%；D60_S，6.49%；Plt;0.05），并且在青貯發酵60 d，降低柱花草含水量顯著提升了乳桿菌屬和魏斯氏菌屬相對豐度（Plt;0.05）。在整個青貯過程中，降低含水量并未對青貯飼料中乳球菌屬，克雷伯氏菌屬（Klebsiella），腸球菌屬（Enterrococcus），克盧維拉菌屬（Kluyvera）和勞特拉菌屬（Raoultella）的相對豐度有明顯影響。

2.4.3 不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落（屬水平）與發酵指標關聯性分析 通過對不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落（屬水平）與發酵指標Pearson關聯性分析（圖3），發現F組青貯第14 d后（圖3A）腸桿菌屬與WSC含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；乳球菌屬與DM含量呈顯著負相關（Plt;0.05），與NDF含量呈極顯著負相關（Plt;0.01）；克雷伯氏菌屬與AA含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12 與AA含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；科薩科尼亞腸桿菌屬（Caproiciproducens）與BA含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；魏斯氏菌屬與pH值和CP含量呈極顯著正相關（Plt;0.01）；梭狀芽孢桿菌_1（Clostridium_sensu_stricto_1）與LA，NH3-N含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；己酸菌屬（Caproiciproducens）與LA，NH3-N含量呈顯著負相關（Plt;0.05）。

F組青貯第60 d后（圖3C）乳桿菌屬與PA含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12 與NH3-N含量呈極顯著正相關（Plt;0.01），與DM含量呈極顯著負相關（Plt;0.01）；克雷伯氏菌屬與pH值呈顯著正相關（Plt;0.05）；科薩科尼亞腸桿菌屬與BA，ADF含量呈顯著負相關，與WSC，CP含量呈極顯著正相關（Plt;0.01）；克盧維拉菌屬與LA含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；泛菌屬（Pantoea）與PA含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；明串珠菌屬（leuconostoc）與pH值呈顯著負相關（Plt;0.05）；大腸桿菌屬（Escherichia-shigella）與LA含量呈顯著負相關（Plt;0.05）。

S組青貯第14 d后（圖3B）腸桿菌屬與NH3-N含量呈顯著正相關（Plt;0.05），與CP含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；乳球菌屬與PA含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；乳桿菌屬與AA含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；科薩科尼亞腸桿菌屬與BA含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；魏斯氏菌屬與PA含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；布丘氏菌屬（Buttiauxella）與LA含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12 與PA含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_1與AA含量呈極顯著正相關（Plt;0.01）。

S組青貯第60 d后（圖3D）腸桿菌與WSC含量呈極顯著負相關（Plt;0.01），與ADF含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_12 與LA含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；克雷伯氏菌屬與NH3-N含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；明串珠菌屬與NH3-N，NDF含量呈顯著負相關（Plt;0.05）;梭狀芽孢桿菌_1與BA，WSC含量呈顯著正相關（Plt;0.05），與ADF含量呈顯著負相關（Plt;0.05）；梭狀芽孢桿菌_11 與WSC含量呈極顯著正相關（Plt;0.01），與ADF含量呈顯著負相關（Plt;0.01）；己酸菌屬與AA含量呈顯著負相關（Plt;0.01），與BA含量呈顯著正相關（Plt;0.05）；乳梭菌屬（Lachnoclostridium_5）與AA，DM含量呈顯著負相關（Plt;0.05）。

2.4.4 不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落（屬水平）的LEfSe差異物種分析 通過對不同含水量柱花草青貯14 d和60 d微生物群落進行LEfSe（LDA閾值為2）分析，由圖4可知，有1個門，3個綱，6個目，11 個科，16 個屬在組間豐度存在差異顯著（Plt;0.05）。由圖4可知，降低柱花草含水量明顯會減少富集的青貯微生物種類，D14_F組在綱水平顯著富集的物種為陰性菌綱（Negativicutes），在目水平上顯著富集的物種為單胞菌目（Selenomonadales），在科水平上顯著富集的物種為拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae），毛螺旋菌科（Lachnospiraceae），韋榮球菌科（Veillonellaceae），在屬水平上顯著富集的物種為梭狀芽孢桿菌屬_11（Clostridium_sensu_stricto_11），甲基桿菌屬（Methylobacterium），假結核桿菌屬 （Pseudocitrobacter），梳狀菌屬（Pectinatus），乳梭菌屬_5（Lachnoclostridium_5）。D14_S組在目水平上顯著富集的物種為乳酸桿菌目（Lactobacillales）。在科水平上顯著富集的物種為鏈球菌科（Streptococcaceae），莫拉菌科（Moraxellaceae），在屬水平上顯著富集的物種為乳球菌屬，克雷伯氏菌，不動桿菌屬（Acinetobacter）。D60_F組在門水平上顯著富集的物種為（Actinobacteria）在綱水平上顯著富集的物種為梭菌綱（Clostridia），放線菌綱（Actinobacteria），在目水平上顯著富集的物種為梭菌目（Clostridiales），疣微菌目（Verrucomicrobiales），雙歧桿菌目（Bifidobacteriales），在科水平上顯著富集的物種為梭菌科_1（Clostridiaceae_1），瘤胃菌科（Ruminococcaceae），克曼菌科（Akkermansiaceae），雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae），在屬水平上顯著富集的物種為梭狀芽孢桿菌屬_12，己酸菌屬，梭狀芽孢桿菌屬_1，阿克曼氏菌屬（Akkermansia），雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）。D60_S組在目水平上顯著富集的物種為丙酸桿菌目（Propionibacteriales）；在科水平上顯著富集的物種為乳桿菌科（Lactobacillaceae），丙酸桿菌科（Propionibacteriaceae）；在屬水平上顯著富集的物種為乳桿菌屬，嗜酸丙酸桿菌屬（Acidipropionibacterium），明串珠菌屬。

3 討論

3.1 柱花草原料特點

在本試驗中F組與S組柱花草原料的干物質含量分別為194.55 g·kg-1 FM和314.12 g·kg-1 FM，S組干物質含量與Bao等［7］報道的適宜柱花草青貯的DM含量接近。本試驗柱花草CP含量高于Liu等［16］報道的104.1 g·kg-1 DM，NDF和ADF含量均低于鄒璇等［17］的報道，相同原料中的營養成分含量有差別，可能是因為品種，生長地域，氣候等不同所造成的［18］。本試驗柱花草附著乳酸菌的數量已達到良好青貯飼料標準（＞5.0 lg cfu·g-1 FW），但因水溶性碳水化合物含量低，緩沖能高等原因，酵母菌和霉菌以及其他有害微生物的附著等原因可能會降低柱花草的青貯品質［19］。

3.2 含水量對柱花草青貯營養品質和發酵特性的影響

青貯飼料營養成分含量會隨著青貯時間變化而變化［20］，而原料特性會直接影響青貯飼料的發酵品質［21］。本試驗結果表明含水量對青貯飼料的DM，NDF，ADF，WSC，pH值，氨態氮，乳酸和丁酸含量均有顯著影響，青貯時間對柱花草青貯飼料的DM，CP，NDF，WSC，pH值，氨態氮，乳酸，乙酸，丙酸和丁酸含量有顯著影響。在本試驗中，兩組柱花草青貯飼料的DM，CP和WSC含量都隨著青貯時間的增加而下降，在青貯過程中蛋白降解是不可避免的，主要是原料中的梭菌，腸桿菌等有害微生物活動以及植物所含的蛋白水解酶所引起［22］。蛋白質被分解后，會使青貯飼料品質下降，影響反芻動物對蛋白質的吸收和利用［23］。隨著青貯時間的增加，本試驗中兩組青貯柱花草的蛋白質含量都極顯著下降，氨態氮含量極顯著上升，可能是因為原料中WSC含量遠低于良好青貯所需的水溶性碳水化合物含量，乳酸菌等沒有充足的發酵底物，無法使青貯飼料快速酸化降低pH值抑制梭菌，腸桿菌等有害微生物對粗蛋白的分解。但通過降低青貯前柱花草含水量有效的抑制了柱花草青貯飼料的粗蛋白的分解，提高柱花草青貯飼料營養成分的保存率。S組柱花草青貯飼料的氨態氮含量顯著低于F組柱花草青貯飼料的氨態氮含量，可能是低含水量抑制了如梭菌等微生物活性，而梭菌被認為是引起蛋白分解產生氨態氮的主要微生物［24］，本試驗中16s rRNA測序數據結果S組梭菌屬相對豐度顯著低于F組也印證了該推測。本試驗S組的NDF和ADF含量顯著高于F組，其原因可能是隨著植物的含水量下降，其他溶解性化合物的濃度可能會增加，包括礦物質和一些有機物，這些物質不會被纖維測定過程所提取，因此在相對濃縮的狀態下，NDF和ADF含量可能會升高，這與郭香等［25］的研究結果相一致。青貯飼料NDF和ADF含量隨青貯天數的增加呈下降趨勢，與郝俊峰等［26-27］研究結果一致，這可能是因為青貯發酵過程中乳酸菌等微生物分泌特殊的胞外酶會使植物細胞壁中的纖維素，半纖維素等物質降解［28］。

青貯飼料的pH值低于4.2 以下是高品質青貯飼料的標準之一［24］，但豆科類作物具有高緩沖能力，自然青貯后的豆科牧草pH值達到4.2 以下并不是作為判斷豆科牧草青貯飼料是否為優質飼料的唯一標準［29］。S組青貯飼料pH值高于F組青貯飼料，可能是低水分含量會影響微生物活性和代謝速率，使產酸菌處于生理干旱狀態，青貯體系中的無機離子的積累受到抑制，pH值難以下降［5］。青貯發酵60 d，S組青貯飼料乙酸含量高于F組青貯飼料，原因可能是S組青貯飼料中Lactobacillus相對豐度顯著高于F組，Lactobacillus會因為發酵糖含量不足而利用乳酸產生更多乙酸［30］；S組青貯飼料丁酸含量低于F組青貯飼料，可能是因為梭菌的活性易受青貯體系中水分活度的影響，在低含水量條件下會抑制梭菌的活性，從而降低柱花草青貯飼料中的丁酸的產生［31］，亦有研究報道當青貯原料中的干物質含量大于30% 時，可以使青貯發酵過程中的梭菌發酵的風險降低［32］。在柱花草青貯發酵過程中，丁酸含量隨著青貯天數的呈上升趨勢，這與Silva等［33］的研究一致，這表明本試驗柱花草青貯飼料中存在較高的丁酸含量這也可能是造成柱花草青貯飼料整體pH值＞ 5.0 的原因之一。結合屬水平上微生物群落分析結果，在青貯發酵14 d和60 d時都可以檢測到梭菌屬的存在，這與較高的pH值和丁酸的存在一致。

3.3 含水量對柱花草青貯微生物多樣性的影響

青貯是由多種微生物共同參與的群落演替過程，涉及許多復雜微生物的相互作用，因此研究青貯飼料的微生物群落結構具有十分重要的意義［34］。本試驗分析了不同含水量柱花草青貯14 d和60 d青貯發酵微生物多樣性。在不同處理組之間，隨含水量的降低，青貯14 d微生物群落豐富度顯著下降，青貯60 d后對微生物群落豐富度無顯著影響，這與Chen等［35］的青貯發酵天數對大蒜皮混合高水分皇竹草（Pennisetum hydridum）青貯發酵品質和微生物群落影響研究結果相似，因此可以推測青貯微生物群落豐富度的變化不僅與青貯原料含水量有關聯，還與青貯時間有關聯。

屬水平的微生物豐度分析表明，柱花草青貯發酵60 d后，腸桿菌屬，乳球菌屬，乳桿菌屬和梭菌屬等是最主要的微生物屬，這與He等［36］ 的研究結果不一致，其研究發現柱花草青貯60 d后優勢微生物屬種類為乳桿菌屬，梭菌屬，腸球菌屬和魏斯氏菌屬等，相同材料青貯發酵后優勢微生物不同可能是受生長地域氣候，原料特性或栽培管理條件的不同所導致［37］。

F組與S組相比，通過降低青貯原料含水量顯著降低了青貯發酵體系中梭菌屬的相對豐度。發酵60 d后，相較于F組，S組青貯飼料的乳桿菌屬的相對豐度顯著提升，這與Fang等［24］的研究結果一致，表明降低柱花草含水量可以顯著降低有害菌梭菌屬相對豐度，提高有益菌乳桿菌屬相對豐度。隨著青貯時間的增加，F組和S組乳球菌屬相對豐度均顯著下降，這與McDonald等［38］的研究結果一致，這可能是因為乳球菌屬主要在青貯前期參與青貯發酵進程，產生乳酸，降低青貯飼料pH值［39］；F組和S組梭菌屬相對豐度顯著上升，可能是梭菌屬于嚴格厭氧芽孢菌，在青貯前期植物纖維空隙中殘留的氧氣對梭菌活性具有抑制作用，隨著青貯時間的增加，青貯體系內的氧氣被好氧微生物消耗殆盡，梭菌芽孢恢復活性［40］。

通過Pearson相關性分析發現，D14_F組腸桿菌屬與WSC含量呈顯著負相關（Plt;0.05），D14_S組腸桿菌屬與氨態氮含量呈顯著正相關（Plt;0.05），與CP含量呈顯著負相關（Plt;0.05），D60_S組腸桿菌屬與WSC含量呈極顯著負相關（Plt;0.01），研究發現［35］腸桿菌會利用青貯飼料中的WSC和CP，產生丁酸、氨態氮和生物胺等不良發酵產物，抑制乳酸菌繁殖和生長，影響青貯飼料的品質，Pearson相關性分析表明腸桿菌屬可能抑制了柱花草的青貯發酵進程，與乳酸菌等有益微生物爭奪青貯原料中的發酵底物，代謝產生不良產物。乳酸菌被認為是決定青貯飼料品質的最關鍵的微生物，本試驗研究發現D60_F組乳桿菌屬與柱花草青貯飼料丙酸含量呈顯著正相關（Plt;0.05），這與Zeng等［41］ 的研究結果不一致，其作用還需進一步研究。

4 結論

降低青貯前柱花草含水量提高了柱花草青貯飼料的粗蛋白含量，降低氨態氮和丁酸含量。此外，降低含水量顯著影響柱花草青貯屬水平上的細菌群落結構，萎蔫后柱花草青貯飼料中的不良微生物梭菌屬相對豐度顯著低于高含水量柱花草青貯飼料，有益微生物魏斯氏菌屬和乳桿菌屬相對豐度顯著高于高含水量柱花草青貯飼料。綜上所述，降低青貯前柱花草的含水量更有利于改善柱花草青貯飼料發酵品質和營養成分的保存。

參考文獻

［1］ 韓建成，吳群，藺紅玲，等. ‘熱研2號’柱花草和‘熱研4號’王草混合青貯對其營養成分及發酵品質的影響［J］. 熱帶作物學報，2023，44（4）：809-815

［2］ KUNG JR L，SHAVER R，GRANT R，et al. Silage review：Interpretation of chemical，microbial，and organoleptic components of silages［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（5）：4020-4033

［3］ SU R，KE W，USMAN S，et al. Dry matter content and inoculant alter the metabolome and bacterial community of alfalfa ensiled at high temperature［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2023，107（11）：3443-3457

［4］ 閆星全，賈玉山，格根圖，等. 原料含水量及添加劑種類對青貯苜蓿品質的影響［J］. 草地學報，2023，31（6）：1861-1866

［5］ 鐘書，張曉娜，楊云貴，等. 乳酸菌和纖維素酶對不同含水量紫花苜蓿青貯品質的影響［J］. 動物營養學報，2017，29（5）：1821-1830

［6］ KE W，DING Z，LI F，et al. Effects of malic or citric acid on the fermentation quality，proteolysis and lipolysis of alfalfa silage ensiled at two dry matter contents［J］. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2022，106（5）：988-994

［7］ BAO J，WANG L，YU Z，et al. Effects of different moisture levels and additives on the ensiling characteristics and in vitro digestibility of stylosanthes silage［J］. Animals，2022，12（12）：1555

［8］ HE L，LI S，WANG C，et al. Effects of vanillic acid on dynamic fermentation parameter，nitrogen distribution，bacterial community，and enzymatic hydrolysis of stylo silage［J］. Frontier in Microbiology，2021（12）：690801

［9］ 黃佩珊，張超，陳丹丹，等. 辣木葉提取物對柱花草和象草青貯品質的影響［J］. 草地學報，2023，31（7）：2194-2202

［10］王堅，李雪楓，王學梅，等. 添加劑對柱花草青貯過程中蛋白降解及營養成分影響［J］. 飼料研究，2020，43（10）：84-89

［11］WEATHERBURN M W. Phenol-hypochlorite reaction for determinations of ammonia［J］. Annual of Chemistry，1967，39 （8）：971-974

［12］OWENS V N，ALBRECHT K A，MUCK R E，et al. Protein degradation and fermentation characteristics of clover and alfalfa silage harvested with varying levels of total nonstructural carbohydrate［J］. Crop Science，1999，9 （6）：1873-1880

［13］VAN SOEST P J，ROBERTSON J B，LEWIS B A. Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］. Journal of Dairy Science，1991，74 （10）：3583-3597

［14］FU Z，SUN L，HOU M，et al. Effects of different harvest frequencies on microbial community and metabolomic properties of annual ryegrass silage［J］. Frontiers in Microbiology，2022（13）：971449

［15］LONG S，LI X，YUAN X，et al. The effect of early and delayed harvest on dynamics of fermentation profile，chemical composition，and bacterial community of king grass silage［J］. Frontiers in Microbiology，2022（13）：864649

［16］LIU Q，ZHANG J，SHI S，et al. The effects of wilting and storage temperatures on the fermentation quality and aerobic stability of stylo silage［J］. Animal Science Journal，2011，82（4）：549-553

［17］鄒璇，王成，陳曉陽，等. 桉葉油和迷迭香油對柱花草青貯品質的影響［J］. 中國草地學報，2022，44（2）：89-97

［18］付東青. 南北疆兩個區域青貯玉米農藝性狀與青貯品質研究［D］. 石河子：石河子大學，2021：3-6

［19］ZANG Y C，LI D X，WANG X K，et al. Fermentation dynamics and diversity of bacterial community in four typical woody forages［J］. Annals of Microbiology，2019，69 （3）：233-240

［20］MCENIRY J，O’KIELY P，CLIPSON N J W，et al. Assessing the impact of various ensilage factors on the fermentation of grass silage using conventional culture and bacterial community analysis techniques［J］. Journal of Applied Microbiology，2010，108（5）：1584-1593

［21］GUAN H，YAN Y，LI X，et al. Microbial communities and natural fermentation of corn silages prepared with farm bunker-silo in Southwest China［J］. Bioresource Technology，2018（265）：282-290

［22］BORREANI，GTABACCOE，SCHMIDT R J，et al. Silage review：factors affecting dry matter and quality losses in silages［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（5）：3952-3979

［23］CHEN R，LI M，YANG J，et al. Exploring the effect of wilting on fermentation profiles and microbial community structure during ensiling and air exposure of king grass silage［J］. Frontiers in Microbiology，2022（13）：971426

［24］FANG D，DONG Z，WANG D，et al. Evaluating the fermentation quality and bacterial community of high-moisture whole-plant quinoa silage ensiled with different additives［J］. Journal of Applied Microbiology，2022，132（5）：3578-3589

［25］郭香，陳德奎，陳娜，等. 含水量和添加劑對黃梁木葉青貯發酵品質的影響［J］. 草業學報，2021，30（8）：199-205

［26］郝俊峰，于浩然，賈玉山，等. 青貯密度和青貯時間對紫花苜蓿發酵品質及營養成分的影響［J］. 草地學報，2022，30（9）：2492-2496

［27］胡煒東，曹曉娟，武俊英，等. 發酵時間對燕麥青貯發酵品質和微生物群落的影響［J］. 飼料研究，2022，45（17）：106-110

［28］ZHANG J，LIU Y，WANG Z，et al. Effects of different types of LAB on dynamic fermentation quality and microbial community of native grass silage during anaerobic fermentation and aerobic exposure［J］. Microorganisms，2023，11（2）：513

［29］JOBIM C C，NUSSIO L G，REIS R A，et al. Methodological advances in evaluation of preserved forage quality ［J］. Revista Brasileira de Zootecnia，2007（36）：101-119

［30］NISHINO N，LI Y，WANG C，et al. Effects of wilting and molasses addition on fermentation and bacterial community in guinea grass silage［J］. Letters in Applied Microbiology，2012，54（3）：175-181

［31］ZHENG M L，NIU D Z，JIANG D，et al. Dynamics of microbial community during ensiling direct-cut alfalfa with and without LAB inoculant and sugar［J］. Journal of Applied Microbiology，2017，122（6）：1456-1470

［32］KUNG L，STOUGH E C，MCDO NELL E E，et al. The effect of wide swathing on wilting times and nutritive value of alfalfa haylage ［J］. Journal of Dairy Science，2010，93（4）：1770-1773

［33］DA SILVA J S，RIBEIRO K G，PEREIRA O G，et al. Nutritive value and fermentation quality of palisade grass and stylo mixed silages［J］. Animal Science Journal，2018，89（1）：72-78

［34］鄭明利. 苜蓿青貯中梭菌多樣性及其誘發梭菌發酵的機理研究［D］.北京：中國農業大學，2017：11-15

［35］CHEN J，HUANG G，XIONG H，et al. Effects of mixing garlic skin on fermentation quality，microbial community of high moisture Pennisetum hydridum Silage［J］. Frontiers in Microbiology，2021（12）：770591

［36］HE L，WANG C，XING Y，et al. Ensiling characteristics，proteolysis and bacterial community of high-moisture corn stalk and stylo silage prepared with Bauhinia variegate flower［J］. Bioresource Technology，2020（296）：122336

［37］HUANG Y，QIU C，WANG Y，et al. Effect of tea polyphenols on the fermentation quality，protein preservation，antioxidant capacity and bacterial community of stylo silage［J］. Frontiers in Microbiology，2022（13）：993750

［38］MCDONALD P，HENDERSON A R，HERON S J. The biochemistry of silage （2nd Editon） ［M］. Aberystwyth：Mambrian Printers Ltd，1991：15-238

［39］GUO X，ZHENG P，ZOU X，et al. Influence of pyroligneous acid on fermentation parameters，co2 production and bacterial communities of rice straw and stylo silage［J］. Frontiers in Microbiology，2021（12）：1434

［40］徐瑩. 丁酸梭菌清液發酵工藝的研究［D］. 武漢：華中農業大學，2009：6-9

［41］ZENG T，LI X，GUAN H，et al. Dynamic microbial diversity and fermentation quality of the mixed silage of corn and soybean grown in strip intercropping system［J］. Bioresource Technology，2020（313）：123655

（責任編輯 劉婷婷）