施氮量對云煙121上部煙葉代謝及品質的影響

關鍵詞：云煙121；上部葉；施氮量；烤后煙質量；代謝組學；超微結構；農藝性狀

烤煙上部葉產量約占煙葉總產量的40%[1]，優(yōu)質上部葉比中、下部葉香氣更濃郁，在葉組配方中起著主導作用[2]。目前，多家卷煙企業(yè)面臨著原料品種單一、品質下降等問題，多數新品種煙草在卷煙配方中未得到大規(guī)模應用，因此拓展和豐富卷煙工業(yè)煙葉原料采購空間、滿足工業(yè)維持卷煙風格穩(wěn)定的任務亟待解決。這就需要對新品種煙株進行綜合評價，確定適宜的培育條件，并提高上部葉的質量與可用性。通過分析不同品種云煙之間的外觀性狀、物理特性、化學成分及感官質量差異發(fā)現，在云南煙區(qū)生態(tài)條件下，云煙121表現出較好的環(huán)境適應性，且烤后煙葉質量相對較好，更能滿足特定卷煙品牌（例如“利群”品牌）對優(yōu)質原料的需求[34]。而目前適宜云煙121生長的培育條件鮮有報道，為促進優(yōu)質原料生產的持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展，有必要對云煙121生長的適宜條件進行探究和挖掘。氮素作為烤煙必需的營養(yǎng)元素之一，與相關物質的合成和積累密不可分[56]。氮肥不足，煙株營養(yǎng)不良，產量降低；氮肥過量，導致上部葉煙堿含量高、糖堿比低，化學成分不協(xié)調，工業(yè)利用價值降低[7]。因此，研究煙草適宜的氮肥施用量，對生產優(yōu)質上部煙葉、提升品種經濟效益具有重要意義。本研究針對云南曲靖煙區(qū)，從農藝性狀、烤后煙質量、超微結構與代謝組學角度確定云煙121的適宜施氮量，探明施氮水平對上部葉超微結構、關鍵代謝物積累的影響，明確氮肥與煙葉品質的內在聯(lián)系，為進一步提高云煙121上部葉可用性和生產優(yōu)質上部煙葉提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為云煙121，由云南省煙草農業(yè)科學研究院提供。

1.2 試驗設計

大田試驗于云南省曲靖市陸良縣龍海試驗基地（25°03′N、103°66′E）進行，試驗田土壤質地為紅土。土壤pH 6.28，有機質含量32.45 g·kg-1，堿解氮含量146.86 mg·kg-1，速效磷含量38.92 mg·kg-1，速效鉀含量158.51 mg·kg-1。根據當地土壤肥力和常規(guī)施氮水平設置3個氮肥梯度，分別為施用純氮82.5（LF）、105.0（MF）和127.5 kg·hm-2（HF）。小區(qū)面積667 m2，重復3次。按適合該品種的配套設施進行管理。

1.3 指標測定與方法

1.3.1 農藝性狀、株型與發(fā)病率調查 于上部葉采烤前7 d，統(tǒng)一從各處理中選擇具有代表性的5株煙株，參照YC/T 142—2010[8]測定從上往下數第5片葉（上部葉）的葉長、葉寬、葉面積、葉夾角及煙株的株高、徑圍、節(jié)距；參照株型劃分[9]，調查株高、葉層高、葉層寬、頂寬、底寬和葉層寬在葉層高上的位置等，計算株型。參照GB/T 23222—2008[10]，從各處理中隨機挑選100株統(tǒng)計氣候斑病與番茄斑萎病的發(fā)病率。

1.3.2 超微結構觀察 于上部葉采烤前7 d，各處理統(tǒng)一選取發(fā)育良好且長勢一致的3株煙株，對從上往下數第5 葉位的葉片進行采收，剪成1 mm×1 mm 的小組織塊。將切割好的小組織塊轉移至裝有2.5%戊二醛的EP管內固定，并用真空泵抽氣直至沉底，室溫放置2 h后4 ℃固定保存及運輸；然后用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min，后移至1%鋨酸避光室溫固定7 h；再依次加入30%-50%-70%-80%-95%-100%乙醇上行脫水，每次1 h；隨后使用無水乙醇丙酮混合物脫水（體積比，無水乙醇∶丙酮=3∶1、0.5 h；無水乙醇∶丙酮=1∶1、0.5 h；無水乙醇∶丙酮=1∶3、0.5 h；丙酮1 h），Epon812滲透包埋，60 ℃下聚合24 h后，在超薄切片機（Leica UC7，德國）上切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，于透射電鏡（hitachi-HT7800，日本）下觀察并照相。

1.3.3 代謝組學檢測 于上部葉采烤前7 d，統(tǒng)一選取發(fā)育良好且長勢一致的不同施氮量煙株的3片上部葉（從上往下數第5葉位）采收，然后迅速置于液氮中冷凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存。準確稱量100 mg樣品于2 mL離心管中，加入600 μL甲醇（含2-氯-L-苯丙氨酸），渦旋振蕩30 s；再加入100 mg 玻璃珠，60 Hz 研磨90 s 后，室溫超聲15 min，12 000 r·min 離心10 min，使用0.22 μm膜過濾后，轉移到進樣小瓶，待液相色譜- 質譜（liquid chromatography mass spectrometry， LC/MS）檢測。

1.3.4 烤后煙葉質量鑒定 取各處理B2F等級的煙葉各2 kg進行煙葉質量鑒定。參照GB 2635—1992[11]進行煙葉外觀質量評價，評價項目包括葉片結構、身份、油分、色度、雜色和成熟度。采用近紅外光譜法[12]測定煙葉中的總糖、還原糖、總堿、總鉀和總氯含量。根據YC/T 530—2015[13]方法鑒定煙葉感官質量。采用三段式烘烤工藝進行調制，按烤煙42級國標進行分級，計算各小區(qū)上部煙葉（從上往下數，第1～6葉位）的產量、產值、均價及不同等級煙葉比例。

1.4 數據分析

采用R軟件包Ropls分別對樣本數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）；采用MetaboAnalyst 軟件包對差異代謝物進行功能通路富集和拓撲學分析。富集得到的通路采用KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）Mapper可視化工具進行差異代謝物與通路圖的瀏覽。采用Excel 2010繪制表格與柱狀圖。采用Adobe Illustrator CC 2018繪制代謝網絡圖。采用SPSS 26.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同施氮量煙株農藝性狀與發(fā)病率數值對比

由表1可知，LF處理煙株的葉夾角顯著小于MF與HF處理；MF與HF處理煙株的節(jié)距顯著大于LF處理；其余指標無顯著性差異。LF處理的煙株以腰鼓形為主；MF處理以腰鼓形與長筒形為主；HF處理以長筒形為主。3種施氮量水平下，結合2 種病害綜合來看，MF 處理煙株的發(fā)病率較低。

2.2 不同施氮量煙株超微結構對比

電鏡觀察柵欄細胞超微結構（圖1）顯示，LF處理下細胞內部分葉綠體與嗜鋨顆粒向細胞中部游離，葉綠體被膜破裂，淀粉粒體積較小，基粒片層較薄，結構松散，排列無序，較為模糊，嗜鋨顆粒數量較少，體積小；MF處理下細胞內葉綠體大部分沿質膜邊緣分布，被膜形狀不規(guī)則，淀粉粒體積增大，基粒片層增厚，排列有序，相對清晰，嗜鋨顆粒數量增多，體積增大；HF處理下細胞內可見細胞核，葉綠體均沿質膜邊緣分布，葉綠體結構完整，淀粉粒、基粒片層、嗜鋨顆粒被完整地包裹在葉綠體被膜中，淀粉粒體積進一步增大，基粒片層受到淀粉粒擠壓，相對較薄，但較為清晰，嗜鋨顆粒體積增大，數量有所減少。

2.3 不同施氮量煙葉代謝組學分析

2.3.1 主成分分析 由圖2可知，在正、負離子模式下，樣品均被分為3組，各組間樣本分離明顯，表明代謝物存在顯著差異，各組內樣本集中，表明樣本重復性好，數據穩(wěn)定。

2.3.2 差異代謝物篩選 以Plt;0.05、VIPgt;1 為條件篩選差異代謝物。以LF為對照，MF相比LF代謝物含量上調的差異代謝物數量為107個，含量下調的差異代謝物為66個；HF相比LF上調的差異代謝物為186個，下調的差異代謝物為219個。由此表明，隨著施氮量的增加，上調的差異代謝物數、下調的差異代謝物數和總差異代謝物數均呈不斷增加趨勢（圖3）。

2.3.3 不同施氮量下煙葉差異代謝物富集通路篩選 為了挖掘受施氮量影響較大的代謝通路，根據差異代謝物的篩選條件，篩選出差異代謝物共352 種，對差異代謝物進行代謝通路富集分析。最終篩選出3條具有代表性的KEGG富集通路，分別是亞油酸代謝、酪氨酸代謝和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路（表2）。

2.3.4 不同施氮量下煙葉中差異代謝物富集通路分析 由表3可知，在亞油酸代謝途徑中，HF處理下的差異代謝物含量與LF和MF處理存在顯著差異，其中9-氧代十八烷-10，12-二烯酸和9，10-二羥基-12，13-環(huán)氧十八烷酸酯含量在HF處理下達到最高，其余差異代謝物含量隨氮水平的升高呈先增加后減少的趨勢，在HF處理下含量最低。

由表4 可知，在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑中，隨著氮水平的增加，苯基丙酮酸、3-脫氫莽草酸、L-天冬氨酸半醛含量呈降低趨勢； L-酪氨酸和莽草酸含量呈先增加后降低趨勢；而3-羥基苯甲酸含量呈先降低后升高趨勢。

由表5可知，在酪氨酸代謝途徑中，隨著氮水平的升高，琥珀酸、3，4-二羥基苯乙酸、4-羥基苯基乙醛、香草乙二醇和酪醇含量呈下降趨勢；酪胺含量呈升高趨勢；而均龍膽酸、4-香豆酸和香葉扁桃酸含量呈先升高后降低趨勢。LF和MF處理間的代謝物含量差異較小，而HF處理與LF和MF處理間代謝物含量差異較大，除酪胺外，其余差異代謝物含量均在HF處理下最低。

2.3.5 不同施氮量處理下煙草代謝網絡結構分析 參照KEGG通路繪制煙草代謝網絡結構，并以HF處理為對照，標記差異代謝物含量變化，紅色表示上調，藍色表示下調，結果（圖4）表明，在該通路中，通過莽草酸途徑合成的莽草酸轉變?yōu)榉种帷㈩A苯酸與苯基丙酮酸后，最終合成為苯丙氨酸，隨后進入苯丙烷代謝途徑，生成L-酪氨酸、4-香豆酸、4-羥基苯乙醛、芥子醇、香豆醇等物質。3個處理中，LF和MF處理除酪胺含量顯示下調外，其余差異代謝物含量均上調，而HF 處理則相反。

2.4 不同施氮量煙株烤后煙質量分析

2.4.1 外觀質量分析 由表6可知，不同氮水平烤后煙葉的外觀質量整體差異較小。在LF處理下，煙葉結構疏松、身份中等、油分略少，色度中至強、無雜色、成熟度好；在MF處理下，煙葉結構疏松、身份中等、油分足、色度強、無雜色、成熟度好；在HF處理下，煙葉油分足、成熟度好、無雜色，但葉片結構尚疏松，身份稍厚，色度中至強。整體而言，MF 處理下煙葉的外觀質量略高于LF 和HF處理。

2.4.2 感官質量分析 由表7可知， MF處理烤后煙葉的感官質量總分最高；LF處理煙葉的香氣質較MF處理低1分，香氣量、透發(fā)性、細膩程度、刺激性、干燥感均低0.5分，其煙香透發(fā)略弱，尚圓潤，口腔舒適度尚好；HF處理煙葉的香氣質較MF處理低1分，香氣量、雜氣、細膩程度、柔和程度、刺激性、干燥感、余味均低0.5分，其煙香尚厚實，略帶焦香，喉部刺激稍顯，甜感偏弱。綜上，MF處理煙葉的整體感官質量較好。

2.4.3 化學成分分析 由表8可知，隨著施氮水平的提高，煙葉的總糖、還原糖含量逐漸降低，總堿含量逐漸增多，鉀、氯含量也逐漸提高，兩糖比有所升高，糖堿比和鉀氯比有所降低，這與余小芬等[14]的研究結果一致。

2.4.4 經濟性狀分析 由表9可知，HF處理的產量較LF和MF處理分別顯著提高10.1%和4.6%；MF 處理的均價較LF 和HF 處理分別顯著提高3.1%與9.9%，產值分別顯著提高10.2%和5.2%，上等煙比例分別顯著提高3.4% 和5.9%，由此表明，MF處理煙葉的經濟性狀最好。

3 討論

3.1 施氮量對云煙121 農藝性狀及發(fā)病率的影響

氮肥施用量是影響煙草農藝性狀與病害發(fā)生率的重要因素。氮供應不足，煙株營養(yǎng)不良，抗病性降低；氮肥過量供應，會使葉片細胞壁變薄，更易遭受病害侵染，導致煙草病情加重；適量氮素供給，煙株營養(yǎng)良好，生長健壯，抗病能力強[15]。通過比較不同施氮量下云煙121的農藝性狀發(fā)現，各處理煙株的主要農藝性狀無明顯差異，面對2022年曲靖煙區(qū)連續(xù)的低溫寡照氣候和嚴重的病害情況，MF處理煙株表現出較低的發(fā)病率。

3.2 施氮量對云煙121 煙葉超微結構的影響

葉綠體是烤煙細胞中合成糖類、色素和有機酸等化合物的主要場所，而葉綠體內積累的嗜鋨顆粒是構成煙葉香氣、油分的重要原料[16]，因此煙葉最終的產量和質量與葉綠體的發(fā)育情況密不可分。本研究通過觀察不同施氮量下煙葉的葉綠體發(fā)育情況發(fā)現，LF處理煙葉的葉綠體結構降解嚴重，淀粉粒和嗜鋨顆粒積累不足，含糖量較少；MF處理煙葉的葉綠體結構出現降解，淀粉粒與嗜鋨顆粒體積大，煙葉內含物質豐富；HF處理下煙葉葉綠體結構完整，淀粉粒與嗜鋨顆粒體積最大，但嗜鋨顆粒數量較少。葉綠體結構發(fā)生降解是煙葉成熟的特征[17]，說明隨著施氮量的增加，煙葉成熟度逐漸降低，這與智磊等[18]的研究結果一致。

3.3 施氮量對云煙121 上部葉代謝的影響

3.3.1 施氮量對亞油酸代謝的影響 亞油酸代謝途徑中的差異代謝物主要為高級脂肪酸，可賦予煙葉特殊的香氣，對煙葉品質和風味有重要影響，并且在煙草對各類逆境脅迫的適應過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[1920]。在該通路下，高級脂肪酸含量多在MF處理下達到最高，在HF處理下含量最低，因此MF處理的煙葉具有更好的香氣質量，且煙葉內較高的高級脂肪酸含量也是其發(fā)病率較低的原因之一。

3.3.2 施氮量對苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成的影響 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑中的差異代謝物主要為有機酸、醛類和氨基酸。L-酪氨酸在煙葉內能參與棕色化反應，對煙葉香氣量有著重要影響[21]；3-脫氫莽草酸、苯基丙酮酸、莽草酸、3-羥基苯甲酸作為有機酸在抽吸過程中能中和煙氣堿性，調節(jié)pH，使吸味醇和，間接影響煙葉香氣；L-天冬氨酸-乙醛具有羰基，是重要的致香物質。這些差異代謝物均在LF和MF處理下含量較高，而在HF處理下含量明顯降低，即LF和MF處理煙葉的香氣物質含量豐富。由此表明，適量氮肥有利于提高煙葉的抽吸品質。

3.3.3 施氮量對酪氨酸代謝的影響 在酪氨酸代謝途徑中，琥珀酸、均龍膽酸、3，4-二羥基苯乙酸、4-羥基苯乙醛、香草乙二醇和酪醇等有機酸和醇醛類物質的含量均在LF和MF處理下較高，且顯著高于HF處理。這些物質具有一定的香氣，在煙草中能提高煙草的香氣量。酪胺在HF處理下含量最高，其對煙草品質的影響與氨類似，抽吸時揮發(fā)進入煙氣，提高煙氣堿性，產生刺激性和辛辣味，且具有臭味，綜上表明，LF和MF處理煙葉的刺激性物質含量低，致香物質含量高，香韻豐滿；施氮量過高會導致煙葉品質下降。

3.3.4 施氮量對煙草代謝網絡的影響 莽草酸途徑與苯丙烷代謝途徑都是煙草的主要次生代謝途徑，在影響煙草主要香氣物質合成的同時又為其他次生代謝途徑提供底物[2223]。其中苯丙氨酸作為次生代謝途徑中的重要物質，不僅是香氣成分、木質素、植保素等物質的前體物，還能參與棕色化反應，對煙草品質有著重要影響[2425]。在HF處理下，莽草酸、預苯酸等前體物質以及與苯丙氨酸密切相關的苯基丙酮酸、L-酪氨酸、苯乙胺等物質含量均下調，這可能導致苯丙氨酸合成量降低。當苯丙氨酸轉化為L-酪氨酸后，又向酪胺轉化過多，使煙葉內刺激性物質含量較高，從而影響煙葉品質。在LF和MF處理下，苯丙氨酸上下游物質含量較高，推測苯丙氨酸合成量較多。L-酪氨酸向酪胺轉化少，可能轉化為4-羥基苯乙醛與4-羥基苯乙酸或向4-香豆酸轉化。4-香豆酸和5-羥基阿魏酸分別是木質素單體香豆醇和芥子醇的前體物[26]，較高的前體物含量有利于木質素的合成，從而增強煙草抗逆性。同時4-香豆酸在合成香豆醇前經肉桂酸4-羥化酶和4-香豆酰輔酶A連接酶作用生成4香豆酰輔酶A[27]，該物質除進入木質素途徑外還可進入類黃酮途徑，生成香氣物質和植保素[28]，從而提高煙草品質與抗病性。

3.4 施氮量對云煙121 烤后煙質量的影響

優(yōu)質煙葉的外觀特征通常表現為成熟度好、組織疏松、厚薄適中、無雜色、色度強、油分足[29]。色度與油分影響煙葉質量，色度足、油分多的煙葉韌性強、彈性好，手摸柔潤、滑膩，抽吸時香氣量足、香氣質好、雜氣少、刺激性小、勁頭適中。葉片結構疏松則代表細胞發(fā)育好，間隙大，填充性、彈性、燃燒性均好[30]。在LF處理下，烤后煙葉的油分和色度較MF處理略有不足；在HF處理下，烤后煙葉的組織結構較MF處理更緊密，且色度略差。因此，LF和HF處理烤后煙葉的上等煙比例降低，表現出較差的經濟性狀以及較低感官質量得分。

煙葉中的化學成分含量反映了煙葉的質量，是決定評吸和煙氣特性等質量特性的內在因素[31]。研究認為，烤煙含總糖24%～33%，還原糖18%～24%，煙堿2.5%左右，鉀≥1.5%，氯lt;0.8%，糖堿比8～10，鉀氯比4～10，兩糖比0.9時相對適宜[3233]。與優(yōu)質煙葉相比，LF處理煙葉的還原糖含量和鉀氯比過高，還原糖含量過高使得煙氣酸性增強，引起壓香現象，而過高的鉀氯比則會降低香氣物質含量，從而導致香氣量與香氣質得分降低；HF處理煙葉的煙堿含量過高，糖堿比過低，且香氣代謝物含量較低，導致烤后煙葉的香氣特性與口感特性得分較低；MF處理煙葉的各化學成分較為協(xié)調，代謝物含量豐富，感官質量最佳。

因此，在曲靖煙區(qū)云煙121的適宜施氮水平為施用純氮105.0 kg·hm-2，在此施氮水平下烤煙上部葉的品質與可用性最優(yōu)。