毛葉芋蘭不同組織qRT-PCR內參基因選擇與驗證

摘""要：毛葉芋蘭（Nervilia"plicata）是一種珍稀南藥，目前對其有效成分及其分子調控機理鮮有報道。實時熒光定量PCR（real-time"quantitative"PCR，"qRT-PCR）在植物基因表達分析中得到了廣泛應用，但在毛葉芋蘭中缺少研究，限制了相關工作的開展。在前期工作基礎上，本研究從毛葉芋蘭轉錄組數據庫中篩選出Actin、GAPDH、TUA、UBC、UBQ、EF-1α、EF-1β、CYP、RPL"共9個常見管家基因，以毛葉芋蘭葉片、葉柄和球莖3個組織部位為材料，開展qRT-PCR內參基因的篩選工作。經過9個基因在不同組織的表達水平、穩定性和綜合分析，篩選出最適合的內參基因，并選擇毛葉芋蘭花青素合成途徑關鍵基因NpDFR、Np3GT進行驗證。結果發現：EF-1α和CYP的表達穩定性相近，整體穩定性最好。2個內參基因單獨或共同使用時，NpDFR、Np3GT在不同組織的表達情況與轉錄組測序結果基本一致，表明其均可用作qRT-PCR的內參基因。本研究結果為進一步開展毛葉芋蘭藥效相關基因的分子作用機理研究提供依據。

關鍵詞：毛葉芋蘭；內參基因；實時熒光定量PCR；表達穩定性中圖分類號：S567.2""""""文獻標志碼：A

Selection"and"Validation"of"qRT-PCR"Reference"Genes"in"Different"Tissues"of"Nervilia"plicata

CHI"Jiayi，"LIU"Shuxuan，"XIANG"Sishi，"ZHAN"Ruoting，"HE"Rui*

Research"Center"of"Chinese"Herbal"Resource"Science"and"Engineering，"Guangzhou"University"of"Chinese"Medicine"/"Key"Laboratory"of"Chinese"Medicinalnbsp;Resource"from"Lingnan，"Ministry"of"Education，"Guangzhou"University"of"Chinese"Medicine"/"School"of"Pharmaceutical"Sciences，"Guangzhou"University"of"Chinese"Medicine，"Guangzhou，"Guangdong"510006，"China

Abstract："Nervilia"plicata"is"a"rare"southern"Chinese"herb."The"study"on"the"plant"at"molecular"level"is"hardly"seen."Real-time"quantitative"PCR"（qRT-PCR）"has"been"widely"used"innbsp;plant"gene"expression"analysis，"but"there"is"a"lack"of"research"on"it"in"N."plicata，"which"limits"the"progress"of"related"work."Based"on"the"previous"researches，"nine"candidate"reference"genes，"including"Actin，"GAPDH，"TUA，"UBC，"UBQ，"EF-1α，"EF-1β，"CYP"and"RPL，"were"screened"out"from"the"transcriptomic"sequencing"data."In"order"to"select"suitable"reference"gene"in"N."plicata，"qRT-PCR"technique"was"employed"to"detect"the"expression"levels"of"the"candidate"reference"genes"in"leaf，"petiole"and"corm"tissues"of"the"plant."After"analyzing"the"expression"levels，"the"stability"and"comprehensive"analysis"of"nine"genes"in"different"tissues，"the"most"suitable"reference"gene"was"obtained."Finally，"the"most"suitable"reference"gene"was"validated"using"NpDFR，"Np3GT"that"related"to"anthocyanin"synthesis."Results"showed"that"the"expression"stability"of"EF-1"α"and"CYP"was"similar，"with"the"best"overall"stability."When"using"either"EF-1α"or"CYP，"or"the"combination"of"them，"as"reference，"the"expression"patterns"of"NpDFR"and"Np3GT"in"different"tissues"were"consistent"with"the"transcriptome"sequencing"results."This"indicates"that"both"EF-1"α"and"CYP"can"be"used"as"reference"genes"in"N."plicata"for"qRT-PCR."This"study"would"provide"a"basis"for"further"research"on"the"molecular"mechanism"of"genes"related"to"the"pharmacological"effects"of"N."plicata.

Keywords："Nervilia"plicata;"reference"gene;"qRT-PCR;"expression"stability

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.004

實時熒光定量PCR（real-time"quantitative"PCR，"qRT-PCR）是將聚合酶鏈式反應和熒光染料相結合的檢測技術，能以較高的靈敏度和特異度實時監測模板擴增的反應進程[1]，是定量分析樣品中核酸分子的最常用的分子生物學技術之一[2]。因其快速簡便，結果準確性高，qRT-PCR技術被普遍應用于生命科學及其相關領域，具有廣泛應用價值。常用于基因表達分析、突變檢測、物種鑒定等[3]。

qRT-PCR結果的準確可靠性可能受到如RNA質量、逆轉錄、引物的特異性和實驗者操作精準性等的影響[4]。為了避免這些因素的影響，準確反映目的基因的表達水平，在qRT-PCR過程中使用一個或多個合適的基因進行標準化至關重要[5]。這種能用于標準化qRT-PCR數據的基因即為內參基因（reference"gene），一般為管家基因。管家基因如GAPDH、Actin、18S"rRNA、tubulin、EF-1α、ubiquitin等在各組織和細胞中的表達都相對穩定，可用作基因相對表達分析檢測的參考。然而，內參基因的表達水平也會因物種差異、生物生長發育階段的變化或實驗條件的不同而發生變化，因此在特定條件下，必須對所選取的內參基因進行表達穩定性的驗證[6]。geNorm、NormFinder和Bestkeeper為目前評估內參基因穩定性的3種主流軟件[7-8]。

毛葉芋蘭[Nervilia"plicata"（Andr.）"Schitr.]是蘭科芋蘭屬珍稀藥用植物。《中國植物志》[9-10]中記載該植物具利肺止咳、益腎、解毒止痛之功效，其主要藥效化學成分為黃酮類物質[10]。目前針對毛葉芋蘭的研究非常少，基本只有關于其物種鑒定和化學成分研究的報道，缺少對其有效成分及其分子調控機理的研究。qRT-PCR技術在植物基因表達分析中被廣泛應用，但在毛葉芋蘭中也缺乏相關研究，尚未見其內參基因篩選的報道，這限制了相關工作的進一步開展。

本研究以毛葉芋蘭的葉、葉柄、球莖3個部位為材料，從前期獲得的轉錄組數據庫中選取9個常見管家基因（Actin、GAPDH、TUA、UBC、UBQ、EF-1α、EF-1β、CYP、RPL）作為候選內參基因，利用qRT-PCR檢測它們在3個不同部位的表達情況，結合?Ct法分析，采用geNorm、NormFinder和Bestkeeper軟件以及RefFinder程序分析并篩選出毛葉芋蘭不同組織部位表達最穩定的內參基因，為進一步采用分子生物學技術研究毛葉芋蘭及其他蘭科植物奠定基礎。

1""材料與方法

1.1""材料

本研究所用植物材料種植于廣州中醫藥大學中藥學院資源中心植物培養室，經相關參考文獻并結合《中國植物志》[9-11]中形態描述及其來源地等鑒定為毛葉芋蘭（Nervilia"plicata）。選擇葉片完全伸展的3株毛葉芋蘭植株，于2023年8月采集葉片、葉柄和球莖，用DEPC水將采摘的樣本清洗干凈，立即液氮速凍，轉移并保存于–80"℃備用。

1.2""方法

1.2.1""RNA提取以及cDNA合成""使用RNA提取試劑盒（CW2598S，CWBIO）按說明書提取毛葉芋蘭的RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所獲RNA的完整性；使用反轉錄試劑盒（R223，Vazyme）將檢驗合格的RNA樣品反轉錄成"cDNA，儲存于–20"℃冰箱備用。

1.2.2""內參基因的篩選及其引物設計""參考已發表的近緣物種內參基因序列，對已完成測序的毛葉芋蘭不同組織部位的轉錄組數據（未發表）進行本地蛋白序列blast，結合從數據庫中篩選出的注釋為9個基因的所有轉錄本，進一步以每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片（FPKM值）gt;100且變異系數（coefficient"of"variation，"CV）最小為篩選標準，獲得9個候選內參基因，根據其各自核苷酸序列采用Primer"Premier"5.0軟件設計對應引物（表1）。

1.2.3""引物特異性檢測""以反轉錄后得到的總cDNA原液為模板，使用Premix"Taq"（TaKaRa"Taq?"version"2.0"plus"dye）（RR902Q）進行普通PCR擴增，反應體系：Premix"Taq"（TaKaRa"Taq?"version"2.0"plus"dye）"12.5"μL，上游引物"0.5"μL，下游引物"0.5"μL，添加ddH2O至25"μL，PCR反應程序參照試劑盒說明書設置。所設計的引物其特異性通過3.0"%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測，并在qRT-PCR后觀察熔解曲線進一步確認。

1.2.4""qRT-PCR以及引物擴增效率檢測""使用伯樂CFX96"real-time"PCR"定量分析儀和Biosharp"universal"SYBR"qPCR"Master"Mix"（BL697A）試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測。參照說明書配制反應體系：cDNA模板1"μL（以cDNA原液5倍稀釋液為模板），上游引物"0.4"μL，下游引物0.4"μL，2×universal"SYBR"green"master"mix"10"μL，ddH2O"8.2"μL。參照說明書設置2步法qRT-PCR"反應程序。

將毛葉芋蘭的葉、葉柄、球莖的cDNA等量混勻成1份總cDNA模板，依次稀釋50、51、52、53、54倍共5個濃度梯度，進行qRT-PCR檢測。使用Excel軟件，以5個稀釋倍數的對數為橫坐標、其對應的Ct值為縱坐標進行線性擬合，得到標準曲線及其斜率（K），利用公式E=（10–1/K–1）×100%計算[12]，得到各內參引物的擴增效率（E）。

1.2.5""內參基因的qRT-PCR及其數據分析""以毛葉芋蘭各樣品cDNA的5倍稀釋液為模板，對各候選內參基因進行qRT-PCR檢測，反應體系和程序同1.2.4，每個樣品進行3次技術重復。

首先對各候選內參基因的表達水平進行分析，將每組qRT-PCR獲得的各部位所有Ct值繪制成箱線圖。穩定性分析是使用?Ct法對原始數據進行計算，同時將原始數據輸入到BestKeeper軟件進行分析。各內參基因的相對表達量通過2–ΔΔCt法計算獲得，將數據轉化后，再分別輸入到geNorm和NormFinder軟件進行分析，最后使用RefFinder在線程序對所有結果進行綜合評估，篩選出在毛葉芋蘭不同組織中表達最穩定的內參基因。

1.2.6""內參基因穩定性驗證""通過綜合評估篩選的最優的2個基因被選作為內參基因。利用qRT-PCR檢測毛葉芋蘭葉片與球莖中（轉錄組未測葉柄）花青素代謝途徑關鍵酶基因NpDFR、Np3GT的表達情況，結合轉錄組數據，驗證這2個最優內參基因的表達穩定性。

2""結果與分析

2.1""RNA質量檢測

使用超微量分光光度計（型號：Nanodrop"Lite）檢測提取獲得的RNA的濃度和純度，各樣品濃度為69.0～133.7"ng/μL，A260/A280值均在"2.0～2.2范圍，說明其純度較好，電泳檢測均具有"28S"RNA、18S"RNA"2個條帶，且未出現彌散現象，滿足后續試驗的要求。

2.2""內參基因引物特異性檢測及擴增效率分析

按照1.2.2方法，從毛葉芋蘭轉錄組數據庫中篩選出9個候選內參基因Actin、GAPDH、TUA、UBC、UBQ、EF-1α、EF-1β、CYP、RPL，其普通PCR產物經電泳檢測，結果顯示清晰單一的條帶，各內參基因擴增出"116～291"bp符合預期大小的特異性片段（圖1），表明設計的引物可用于后續"qRT-PCR"分析。

進一步驗證所設計引物的特異性并分析其擴增效率，9個候選內參基因的熔解曲線均呈現出清晰的單一峰值特征，說明無引物二聚體形成或非特異性擴增，熔解曲線的Tm值均在80～85"℃之間（圖2）；按1.2.4方法在Excel中計算得到標準曲線的相關系數（R2）介于0.9906～0.9969之間，線性關系良好，擴增效率（E）介于91.21%～120.60%之間（表2），9個內參基因的引物均符合后續分析要求。

2.3""內參基因的表達水平分析

Ct值代表內參基因的表達水平，基因的Ct值若較低，則通常指示其具有較高的表達水平，反之則表達水平較低。毛葉芋蘭的3個組織部位中9個候選內參基因的Ct值范圍為20.686～"26.470，其中平均Ct值最大與最小的基因分別是RPL（25.631）和EF-1α（22.342），說明RPL表達豐度最低，EF-1α最高。9個候選內參基因在表達豐度上的排序為：EF-1αgt;GAPDHgt;UBCgt;CYPgt;UBQgt;"EF-1βgt;TUAgt;Actin＞RPL。

Ct值的波動反映穩定性，波動越小表示基因表達越穩定。將Ct值繪制成箱線圖，以初步評估各候選內參基因表達水平的離散程度。其中GAPDH的箱線最長，說明其表達豐度變異性最大，穩定性最差，而EF-1β箱線最短，其Ct值為23.072～23.710，波動小（圖3）。從表達豐度來看EF-1β基因可能是毛葉芋蘭不同組織中較為穩定的內參基因。

箱體中的橫線表示中位數，箱體的上、下邊線分別表示第三四分位數、第一四分位數，箱體上、下方橫線分別表示上限、下限。

2.4""內參基因穩定性分析

2.4.1""?Ct法分析""將候選內參基因兩兩配對，計算對應的各樣本中配對的2個內參基因的?Ct值（圖4），再算出配對的2個內參基因于所有樣本間?Ct值的標準偏差（standard"deviation，"SD），最后分別得到9個候選內參基因?Ct值的平均標準偏差（SD"mean）。

將TUA和CYP分別與其他8個基因進行比較

時，它們與較小偏離量相關（SD"mean分別為0.359和0.363），因此這2個基因的變異性較小。但將GAPDH和EF-1β分別與其他8個基因進行比較時，偏差（SD"mean分別為0.725和0.744）明顯增加，表明其變異大。EF-1α、Actin、UBQ、UBC和RPL都顯示出中等水平的偏差（SD"mean分別為0.371、0.372、0.419、0.564和0.593）。SD"mean越小預示著基因越穩定，由此可見最穩定的基因為TUA，最不穩定的基因為EF-1β。

2.4.2""geNorm分析""結果顯示9個候選內參基因表達穩定M值均在1.5以下，說明它們的穩定性均較好，9個候選基因都可以用作毛葉芋蘭的內參基因（圖5）。9個候選內參基因的穩定性由geNorm軟件分析排序依次為EF-1α=CYP（0.092）gt;TUA（0.120）gt;Actin（0.141）gt;UBQ（0.189）gt;UBC（0.279）gt;RPL（0.360）gt;GAPDH（0.432）gt;EF-1β（0.501）。

geNorm軟件對輸入的數據進行二次自動分析，分析內參基因平均穩定性的變化水平，通過計算配對變異值（Vn/Vn+1）來預測最佳內參基因的個數。在本研究中，配對變異分析結果顯示（圖6），所有配對變異值均小于0.15，即從圖中最穩定的2個基因（最左邊）開始，V2/V3lt;0.15，表明在毛葉芋蘭各組織樣品中使用2個內參基因可以達到理想的校正效果，綜合第一次分析結果，geNorm軟件的結論是可選擇EF-1α和CYP"2個基因作為毛葉芋蘭的內參基因。

2.4.3""NormFinder分析""NormFinder軟件的分析與geNorm相似，其分析所得結果穩定值（stability"value，"SV）越低的候選基因，則表示擁有更高的內參基因穩定性。

在該軟件分析中，候選內參基因穩定性依次為TUA（0.181）gt;CYP（0.208）gt;EF-1α（0.220）gt;"UBQ（0.255）gt;UBC（0.278）gt;Actin（0.285）gt;GAPDH（0.762）gt;RPL（0.786）gt;EF-1β（1.999），與geNorm"軟件分析的結果排名趨勢相似（圖5）。其中TUA、CYP、EF-1α的SV最小，說明這3個基因穩定性最高，TUA被NormFinder軟件選為最優內參基因。

2.4.4""Bestkeeper分析""BestKeeper通過計算CV與SD，來反映內參基因的穩定性。當CV與SD的值都較低時，則說明該基因具有更高的穩定性。其中SD的默認閾值為1.0，當SD低于1.0時則認為該基因表達穩定。分析結果顯示，在毛葉芋蘭不同組織中，GAPDH的SD（1.14）高于默認閾值，提示不宜作為此物種的內參基因，其余8個基因的SD均小于默認閾值，說明它們的表達也均較為穩定；其中EF-1β的CV與SD都最低，穩定性最好（圖7）。

2.4.5""RefFinder分析""使用RefFinder在線分析網站進行綜合評估。結果顯示（圖8），各內參基因在不同組織中的表達穩定性綜合排序由高到低依次為EF-1α、CYP、TUA、UBQ、UBC、Actin、EF-1β、RPL、GAPDH。其中EF-1α和"CYP"的表達穩定性相近，整體穩定性最好，適合作為毛葉芋蘭的內參基因；而穩定性最差的是"GAPDH，提示該基因不適合作為毛葉芋蘭熒光定量PCR的內參基因。

2.5""內參基因穩定性驗證單獨使用和組合使用綜合排名最靠前的2個內參基因EF-1α和CYP，對毛葉芋蘭的葉片和球莖2個組織部位中花青素代謝途徑關鍵基因NpDFR、Np3GT的表達差異進行分析，并與轉錄組數據進行比較，驗證所選的這2個內參基因的穩定性。結果顯示，單獨或者組合使用EF-1α和CYP作為內參基因時，同一目的基因在不同器官中的表達情況相同，即2個目的基因在毛葉芋蘭葉片中的相對表達均高于在球莖中的表達，這與轉錄組所測得的這2個目的基因在2個器官中FPKM值的大小是一致的（圖9）。說明單獨或者組合使用EF-1α和CYP作為qRT-PCR的內參基因都能夠較準確得出毛葉芋蘭各部位中各基因的相對表達量。

3""討論

合適的內參基因對于分析目標基因表達情況的準確性和可靠性非常重要。β-tubulin可作為毛唇芋蘭（Nervilia"plicata）qRT-PCR的校正內參基因[13]。適于鐵皮石斛（Dendrobium"officinale）不同組織的內參基因為EF-1α或18S"rRNA[14]，其中前者在鐵皮石斛葉色突變體中被驗證為穩定且可靠[15]；而在其原球莖時期的所有樣本中，傳統的管家基因表達穩定性均較差，研究篩選得到的內參基因組合不是常用的管家基因，而是ASS+APH1L[15-16]；蕙蘭（Cymbidium"faberi）中可以選用ACT、UBQ3或GAPDH作為其所有時期所有器官的內參基因使用，但單獨分析某器官或者某生長期的目標基因表達情況時，采用其中2個內參基因進行歸一化處理能得到更為準確的數據[17]；蝴蝶蘭（Phalaenopsis"spp.）的整個發育階段各組織的最適內參基因是ACT[18]，而低溫脅迫條件下，PhPP2Aa基因最適合作為目的基因轉錄水平研究的內參基因[19]。內參基因的穩定性因物種及其組織部位、生長發育階段和脅迫條件的不同而有所變化，因此應該為研究的特定的物種或新的試驗條件選擇最穩定的參考基因[20]。

球莖是毛葉芋蘭的繁殖器官，其主要為圓球或橢圓形，球莖上長有細弱的匍匐莖或根狀莖，每個球莖上每年只長1～2片葉，極少見開花。且芋蘭屬植物即便開花也多為先開花，花落后才長"出葉子，僅有個別物種可以同時見到花和葉子[21]。本研究所種植的毛葉芋蘭均未能觀察到開花者，且植物材料個體少而小、根和根莖細小，也無法獲得足夠質量的根和根莖，故選取葉片、葉柄和球莖作為研究材料。前期研究發現β-tubulin（TUB）可用作近源物種毛唇芋蘭的qRT-PCR研究中的內參基因[13]，但本研究前期發現該基因在毛葉芋蘭中表達水平較低（以51倍總cDNA稀釋液作為模板時Ct值最小值為27.820），制作標準曲線試驗中以53倍總cDNA稀釋液作為模板時已無法檢測到相應Ct值，因此未選擇該內參基因進行后續分析。

經穩定性分析，發現Bestkeeper篩選出排行第一位的基因為EF-1β，而使用其他3種方法所得結果中EF-1β排在最后一位，Bestkeeper與其他分析方法所得結果不一樣的情況在其他植物的內參基因篩選研究中也報道過[22-23]。不同軟件的統計學算法不同，結果亦不同：Bestkeeper是將測得的所有Ct值直接輸入軟件中，計算目的基因的組內差異，比較不同基因的CV與SD并進行穩定性排序，穩定性與其在各樣品中Ct值的離散程度密切相關，Ct值的變化范圍越小，則基因的穩定性通常越高。?Ct法也是對原始數據直接計算，比較每個樣本中“成對基因”的相對表達量，若ΔCt有波動，說明其中1個或2個基因都是可變的，可引入更多的基因繼續比較，綜合比較哪個基因的變異性更小[24]。從圖4可見若引入EF-1β，其他與之匹配的組合?Ct值的波動幅度增大。geNorm和NormFinder與前2個方法不同的是，首先都要將Ct值轉化成相對定量數據，再輸入到各軟件自動尋找各候選基因在不同樣本中的最高Ct值，再將所有測得的各基因的Ct值減去所找到的最高Ct值，最后計算表達水平比率，結合組內和組間的差異進行分析。可見對所有軟件得出的結果需要進行綜合評估，結合并驗證，才能篩選到最適合的內參基因。

4""結論

本研究利用qRT-PCR技術，使用?Ct法初步分析，并結合3種常用軟件geNorm、NormFinder、Bestkeeper與RefFinder程序，綜合評估能用于標準化qRT-PCR數據的9個候選內參基因（Actin、GAPDH、TUA、UBC、UBQ、EF-1α、EF-1β、CYP、RPL）在毛葉芋蘭不同組織部位的穩定性，結果表明9個內參基因綜合排序為EF-1αgt;CYPgt;"TUAgt;UBQgt;UBCgt;Actingt;EF-1βgt;RPLgt;GAPDH。其中單獨或聯合使用EF-1α和CYP作為內參基因，NpDFR與Np3GT在不同組織的表達情況與轉錄組測序結果基本一致。EF-1α和CYP皆可作為毛葉芋蘭qRT-PCR的內參基因，用于不同組織間基因表達的差異性分析試驗。

參考文獻

[1]"CHEN"Z，"HALFORD"N"G，"LIU"C."Real-time"quantitative"PCR："primer"design，"reference"gene"selection，"calculations"and"statistics[J]."Metabolites，"2023，"13（7）："806.

[2]"TAYLOR"S"C，"NADEAU"K，"ABBASI"M，"LACHANCE"C，"NGUYEN"M，"FENRICH"J."The"ultimate"qPCR"experiment："producing"publication"quality，"reproducible"data"the"first"time[J]."Trends"in"Biotechnology，"2019，"37（7）："761-774.

[3]"ARTIKA"I"M，"DEWI"Y"P，"NAINGGOLAN"I"M，"SIREGAR"J"E，"ANTONJAYA"U."Real-time"polymerase"chain"reaction："current"techniques，"applications，"and"role"in"COVID-19"diagnosis[J]."Genes，"2022，"13（12）："2387.

[4]"ZHANG"P"L，"CHEN"S"Y，"CHEN"S"Y，"ZHU"Y"M，"LIN"Y"Q，"XU"X"Y，"LIU"Z"J，"ZOU"S"Q."Selection"and"validation"of"qRT-PCR"internal"reference"genes"to"study"flower"color"formation"in"Camellia"impressinervis[J]."International"Journal"of"Molcular"Sciences，"2024，"25（5）："3029.

[5]"KOZERA"B，"RAPACZ"M."Reference"genes"in"real-time"PCR[J]."Journal"of"Applied"Genetics，"2013，"54（4）："391-406.

[6]"CHEN"C"B，"WU"J"Y，"HUA"Q"Z，"TEL-ZUR"N，"XIE"F"F，"ZHANG"Z"K，"CHEN"J"Y，"ZHANG"R，"HU"G"B，"ZHAO"J"T，"QIN"Y"H."Identification"of"reliable"reference"genes"for"quantitative"real-time"PCR"normalization"in"pitaya[J]."Plant"Methods，"2019，"15："1-12.

[7]"HELLEMANS"J，"VANDESOMPELE"J."Selection"of"reliable"reference"genes"for"RT-qPCR"analysis[J]."Methods"and"Protocols，"2014，"1160："19-26.

[8]"DE"SPIEGELAERE"W，"DERN-WIELOCH"J，"WEIGEL"R，"SCHUMACHER"V，"SCHORLE"H，"NETTERSHEIM"D，"BERGMANN"M，"BREHM"R，"KLIESCH"S，"VANDEKERCKHOVE"L，"FINK"C."Reference"gene"validation"for"RT-qPCR，"a"note"on"different"available"software"packages[J]."PLoS"One，"2015，"10（3）："e0122515.

[9]"中國科學院中國植物志編輯委員會."中國植物志："第十八卷，"被子植物門"單子葉植物綱蘭科2[M]."北京："科學出版社，"1999："27-28."""""""""""Editorial"Committee"of"Flora"of"China，"Chinese"Academy"of"Sciences."Flora"of"China："Volume"18，"Orchidae"2"in"the"class"monocotyledons"of"the"phylum"angiosperms[M]."Beijing："Science"Press，"1999："27-28."（in"Chinese）

[10]"劉主潔，"程銀平，"林朝展，"祝晨蔯."青天葵及其近緣種毛葉青天葵的HPLC指紋圖譜鑒別研究[J]."中藥材，"2015，"38（12）："2514-2517.LIU"Z"J，"CHENG"Y"P，"LIN"Z"Z，"ZHU"C"C."HPLC"fingerprints"of"Nerviliae"fordii"and"Nervilia"plicata[J]."Journal"of"Chinese"Medicinal"Materials，"2015，"38（12）："2514-2517."（in"Chinese）

[11]"文和群，"許兆然，"VILLA-LOBOS"J，"SKOG"L"E."中國南部石灰巖稀有瀕危植物名錄[J]."廣西植物，"1993，"13（2）："110-127.WEN"H"Q，"XU"Z"R，"VILLA-LOBOS"J，"SKOG"L"E."A"list"of"threatened"limestone"plants"in"south"China[J]."Guihaia，"1993，"13（2）："110-127."（in"Chinese）

[12]"王浩，"蔡啟忠，"劉露，"楊全，"周良云."何首烏實時熒光定量PCR內參基因篩選[J]."中國中藥雜志，"2021，"46（1）："80-85.WANG"H，"CAI"Q"Z，"LIU"L，"YANG"Q，"ZHOU"L"Y."Reference"gene"screening"for"real-time"quantitative"PCR"in"Polygonum"multiflorum[J]."China"Journal"of"Chinese"Materia"Medica，"2021，"46（1）："80-85."（in"Chinese）

[13]"黃瓊林，"梁凌玲，"何瑞，"詹若挺，"陳蔚文."青天葵實時熒光定量PCR內參基因的選擇[J]."中草藥，"2013，"44（14）："1979-1983.HUANG"Q"L，"LIANG"L"L，"HE"R，"ZHAN"R"T，"CHEN"W"W."Selection"of"reference"genes"for"real-time"fluorescence"quantitative"PCR"in"Nervilia"Fordii"Folium[J]."Chinese"Traditional"and"Herbal"Drugs，"2013，"44（14）："1979-1983."（in"Chinese）

[14]"張崗，"趙明明，"張大為，"郭順星."鐵皮石斛實時定量PCR"內參基因的篩選[J]."中國藥學雜志，"2013，"48（19）："1664-1668.ZHANG"G，"ZHAO"M"M，"ZHANG"D"W，"GUO"S"X."Reference"gene"selection"for"real-time"quantitative"PCR"analysis"of"Dendrobium"officinale[J]."Chinese"Pharmaceutical"Journal，"2013，"48（19）："1664-1668."（in"Chinese）

[15]"CAO"H，"LI"H，"LU"L，"JI"Y"L，"MA"L"L，"LI"S"C."Screening"and"validation"of"internal"reference"genes"for"quantitative"real-time"PCR"analysis"of"leaf"color"mutants"in"Dendrobium"officinale[J]."Genes，"2023，"14（5）："1112.

[16]"AN"H"Q，"ZHU"Q"K，"PEI"W，"FAN"W，"LIANG"L，"CUI"Y"H，"LYU"N，"WANG"W"J."Whole-transcriptome"selection"and"evaluation"of"internal"reference"genes"for"expression"analysis"in"protocorm"development"of"Dendrobium"officinale"Kimura"et"Migo[J]."PLoS"One，"2016，"11（11）："e0163478.

[17]"田云芳."蕙蘭內參基因的篩選與A類花發育基因的表達特性研究[D]."鄭州："河南農業大學，"2013.TIAN"Y"F."Study"on"selection"of"reference"genes"and"A-class"floral"development"gene"expression"pattern"from"Cymbidium"faberi[D]."Zhengzhou："Henan"Agricultural"University，"2013."（in"Chinese）

[18]"YUAN"X"Y，"JIANG"S"H，"WANG"M"F，"MA"J，"ZHANG"X"Y，"CUI"B."Evaluation"of"internal"control"for"gene"expression"in"Phalaenopsis"by"quantitative"real-time"PCR[J]."Applied"Biochemistry"and"Biotechnology，"2014，"173（6）："1431-1445.

[19]"梁芳，"許申平，"張燕，"王默霏，"崔波."蝴蝶蘭PhPP2Aa基因作為低溫脅迫內參基因的研究[J]."熱帶作物學報，"2022，"43（7）："1338-1346.LIANG"F，"XU"S"P，"ZHANG"Y，"WANG"M"F，"CUI"B."Phpp2Aa"as"reference"gene"in"Phalaenopsis"under"low-temperature"stress[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2022，"43（7）："1338-1346."（in"Chinese）

[20]"MAROUFI"A，"VAN"BOCKSTAELE"E，"DE"LOOSE"M."Validation"of"reference"genes"for"gene"ex-pression"analysis"in"chicory"（Cichorium"intybus）"using"quantitative"real-time"PCR[J]."BMC"Molecular"Biology，"2010，"11："1-12.

[21]"GALE"S"W，"LI"J"H，"KINOSHITA"A，"YUKAWA"T."Stuides"in"Asian"Nervilia"（Orchidaceae）"V："Nervilia"futago，"a"cryptic"new"species"from"southwest"Japan"confirmed"by"morphological，"cytological，"and"molecular"analyses[J]."Systematic"Botany，"2015，"40（2）："413-425.

[22]"章楊婷，"張燕萍，"黃靜妍，"王文君，"童妍，"趙凱，"周育真."一心維納斯蝴蝶蘭花香物質合成相關基因RT-qPCR內參基因篩選[J]."熱帶作物學報，"2023，"44（11）："2188-2195.ZHANG"Y"T，"ZHANG"Y"P，"HUANG"J"Y，"WANG"W"J，"TONG"Y，"ZHAO"K，"ZHOU"Y"Z."Selection"of"suitable"RT-qPCR"reference"genes"for"floral"scent"biosynthesis"in"Phalaenopsis"I-Hsin"Venus[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2023，"44（11）："2188-2195."（in"Chinese）

[23]"曹映輝，"鄭燕，"張燕萍，"胡美娟，"童妍，"朱尾銀，"徐建球，"趙凱，"彭東輝，"周育真."建蘭花香物質合成相關基因"RT-qPCR內參基因篩選[J]."分子植物育種，"2023，"21（10）："3282-3289."CAO"Y"H，"ZHENG"Y，"ZHANG"Y"P，"HU"M"J，"TONG"Y，"ZHU"W"Y，"XU"J"Q，"ZHAO"K，"PENG"D"H，"ZHOU"Y"Z."Selection"of"suitable"RT-qPCR"reference"genes"for"floral"scent"biosynthesis"in"Cymbidium"ensifolium[J]."Molecular"Plant"Breeding，"2023，"21（10）："3282-3289."（in"Chinese）

[24]"SILVER"N，"BEST"S，"JIANG"J，"THEIN"S"L."Selection"of"housekeeping"genes"for"gene"expression"studies"in"human"reticulocytes"using"real-time"PCR[J]."BMC"Molecular"Biology，"2006，"7："1-9.