一種農桿菌介導的糜子高效遺傳轉化方法

摘""要：糜子（Panicum"miliaceum"L.）是我國傳統的糧食作物，截至目前，針對糜子遺傳轉化方法的研究仍較少，本研究旨在建立農桿菌介導的糜子高效遺傳轉化方法。以糜子品種冀黍5號的成熟種子為外植體，在CIM和MSD誘導培養基上分別誘導糜子的胚性愈傷，以其作為轉化受體材料，用含植物表達載體的農桿菌侵染60"min并共培養6"d，轉接至含0.025"g/L潮霉素的篩選培養基上篩選出抗性愈傷，接著在含0.015"g/L潮霉素的分化培養基上分化，最后在含0.015"g/L潮霉素的生根培養基上生根成苗，用載體特異性引物對再生植株進行PCR檢測，鑒定其是否為陽性轉基因植株。根據多個批次的轉化實驗統計糜子的抗性再生植株的篩選效率和轉化效率。結果表明：CIM和MSD誘導培養基均能誘導出糜子胚性愈傷，但CIM培養基誘導的糜子胚性愈傷效果更好；糜子胚性愈傷在被農桿菌侵染及與農桿菌共培養后，經在含潮霉素的培養基上篩選、分化和生根后獲得多株抗性再生糜子植株，3次試驗獲得的糜子抗性再生植株的PCR鑒定陽性率為100%，平均轉化效率為30%以上。本研究成功建立了農桿菌介導的糜子遺傳轉化方法，操作簡單，轉化效率高，成本低廉，且轉化不受季節限制，能規模化開展，為糜子的遺傳改良提供有效的技術手段。

關鍵詞：糜子；農桿菌；遺傳轉化；轉化效率中圖分類號：S516""""""文獻標志碼：A

An"Efficient"Genetic"Transformation"Method"for"Broomcorn"Millet"Mediated"by"Agrobacterium"tumefaciens

XIA"Qiyu1，"XIANG"Yanmiao2*，"LIU"Yanan2，"LI"Haiquan2，"CHENG"Ruhong2，"GUO"Anping1，"LIU"Guoqing2**，"ZHAO"Hui1**

1."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Hainan"Key"Laboratory"for"Biosafety"Monitoring"and"Molecular"Breeding"in"Off-Season"Reproduction"Regions，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"2."Institute"of"Millet"Crops，"Hebei"Academy"of"Agriculture"and"Forestry"Sciences，"Shijiazhuang，"Hebei"050035，"China

Abstract："Broomcorn"millet"（Panicum"miliaceum"L.）"is"a"traditional"grain"crop"in"China."Currently，"there"is"still"limited"research"on"the"genetic"transformation"methods"for"P."miliaceum."This"study"aimed"to"establish"an"efficient"genetic"transformation"method"for"P."miliaceum"mediated"by"Agrobacterium."Mature"seeds"of"the"millet"variety"Jishu"5"were"used"as"the"explants"to"induce"embryogenic"callus"of"millet"on"CIM"and"MSD"induction"media，"respectively."They"were"used"as"the"transformation"receptor"materials"and"infected"with"Agrobacterium"containing"plant"expression"vectors"for"60"minutes"and"co-cultured"for"6"days."The"calli"were"then"transferred"to"a"screening"medium"containing"0.025"g/L"of"hygromycin"to"screen"for"resistant"calli."Then，"they"differentiated"on"a"differentiation"medium"containing"0.015"g/L"of"hygromycin."Finally，"they"rooted"into"seedlings"on"a"rooting"medium"containing"0.015"g/L"of"hygromycin."PCR"detection"was"performed"on"the"regenerated"plants"using"vector"specific"primers"to"identify"whether"they"were"positive"transgenic"plants."Based"on"the"multiple"batches"of"transformation"experiments，"the"screening"efficiency"and"transformation"efficiency"of"resistant"regenerated"plants"of"broomcorn"millet"were"statistically"analyzed."The"results"showed"that"both"CIM"and"MSD"media"could"induce"embryogenic"callus"of"broomcorn"millet，"but"CIM"medium"had"a"better"effect"on"inducing"embryogenic"callus"of"broomcorn"millet."After"being"infected"by"Agrobacterium"and"co-cultured"with"Agrobacterium，"the"multiple"resistant"regenerated"plants"were"obtained"through"screening，"differentiation，"and"rooting"on"a"medium"containing"hygromycin."The"PCR"identification"positive"rate"of"the"resistant"regenerated"plants"obtained"from"three"experiments"was"100%，"and"the"average"transformation"efficiency"was"over"30%."This"study"successfully"established"an"Agrobacterium"mediated"genetic"transformation"method"for"broomcorn"millet，"which"is"simple"to"operate，"efficient，"cost-effective，"and"not"limited"by"seasons."It"could"be"carried"out"on"a"large"scale，"providing"an"effective"technical"means"for"genetic"improvement"of"broomcorn"millet.

Keywords："broomcorn"millet"（Panicum"miliaceum"L.）;"Agrobacterium;"genetic"transformation;"transformation"efficiency

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.005

糜子（Panicum"miliaceum"L.），屬禾本科黍屬，起源于我國的黃河流域，又名黍稷，一年生小粒禾谷類作物，是人類最早馴化的作物之一，具有生育期短、抗旱耐瘠等特點，在干旱環境中具生產優勢，主要分布在亞洲和歐洲的半干旱地區[1-3]。在中國，糜子曾是華北地區的主糧，如今僅在山區和邊遠地帶栽培，年種植面積約32萬hm2，產量約30萬t[4]。目前，全球糜子種質資源有29"000余份，我國糜子種質資源庫有9885份糜子資源[5-6]。與玉米、水稻等作物相比，糜子馴化水平低，具有許多野生性狀，這些性狀嚴重阻礙了糜子的育種進程及品種改良，成為現代糜子遺傳改良的重點。目前我國糜子育種方法落后，主要為雜交育種和誘變育種等常規育種方法，分子標記輔助選擇育種也很少[7-8]。現代基因工程技術的發展，為糜子的育種及品種改良提供了一種快速有效的途徑。但由于糜子的遺傳轉化研究發展比較緩慢，嚴重影響了糜子的轉基因育種速度。因此，建立糜子的高效遺傳轉化方法，對糜子的育種及品種改良尤為重要。

目前常見的植物遺傳轉化方法為基因槍法和農桿菌法。基因槍法是將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織中，通過細胞和組織培養技術，可再生出植株，選出其中轉基因陽性植株即為轉基因植株[9]。其主要優點是不受受體植物范圍的限制，但該儀器不易獲得，且耗材成本高昂，操作復雜，外源基因插入拷貝數高，影響了基因槍法的廣泛應用。農桿菌法是將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，借助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過組織培養技術，再生出轉基因植株，具有操作簡單，成本低，遺傳穩定，轉化效率高且外源基因插入拷貝數低等優點，目前在多種植物中廣泛應用[10-16]。本研究以糜子品種冀黍5號的成熟種子為外植體，建立農桿菌介導的糜子高效遺傳轉化方法，為糜子的遺傳改良提供了有效的技術手段。

1""材料與方法

1.1""材料

糜子品種為冀黍5號。含潮霉素抗性基因"（HPT）篩選標記的植物表達載體pRLG103_Predicted由Daniel"Voytas實驗室提供。大腸桿菌DH5α感受態和農桿菌AGL1感受態分別購自北京全式金生物技術股份有限公司和上海唯地生物技術有限公司。植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）購自天根生化科技（北京）有限公司；Taq酶MIX購自北京康為世紀生物科技有限公司；MS購自Duchefa"Biochemie公司；植物凝膠購自Caisson"Labs公司；潮霉素購自Gold"Biotechnology公司；蛋白胨和酵母粉購自Oxoid公司；瓊脂糖購自Biowest公司；硫酸軟骨素鈉（軟骨素）購自北京璞棠生物科技有限公司生產。其它試劑均為國產分析純。

1.2""方法

1.2.1""糜子的胚性愈傷誘導""選取經休眠處理的冀黍5號的干燥成熟種子，去除種皮，將約2"g種子裝入50"mL無菌離心管中，用20"mL有效濃度為3%的次氯酸鈉溶液和50"μL吐溫20溶液，消毒滅菌處理20"min，用無菌水清洗多次后將種子接種于胚性愈傷誘導培養基上。接種時注意種子芽點朝上，芽點不直接接觸培養基，每皿培養基接種子約20個，24"℃恒溫培養，濕度為55%，培養過程中先以12"h/12nbsp;h的光/暗培養模式進行光照發芽，發芽后轉為暗培養，暗培養28"d后從芽點處挑取誘導的胚性愈傷組織，繼續暗培養7"d。使用2種胚性愈傷誘導培養基CIM和MSD進行糜子胚性愈傷誘導。CIM中含有MS干粉4.4"g/L、蔗糖30.0"g/L、七水合硫酸鋅0.035"g/L、五水合硫酸銅0.0006"g/L、激動素0.0005"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.002"g/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。MSD中含有MS干粉4.4"g/L、蔗糖30.0"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.002"g/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。

1.2.2""農桿菌菌液的制備及活化""從–80"℃冰箱取出含載體pRLG103_Predicted（圖1）的AGL1農桿菌菌株，置于LB培養基（蛋白胨10.0"g/L、酵母粉5.0"g/L、氯化鈉10.0"g/L和瓊脂粉15.0"g/L）上涂板活化，24"℃暗培養3"d，長出單菌落；挑取3個以上單菌落，同時置于含0.05"g/L的羧芐青霉素和0.05"g/L卡那霉素的LB培養液中，于20"℃以200"r/min進行震蕩培養24"h，離心得到新鮮的農桿菌菌液。將新鮮的農桿菌菌液加至侵染液中，搖晃進行懸浮處理，得農桿菌菌懸液，并用侵染液將農桿菌菌懸液濃度調整到OD600值為0.6，然后于20"℃以100"r/min低速振蕩培養2～3"h進行活化，得活化的農桿菌菌液。侵染液中含有MS干粉2.2"g/L、蔗糖30"g/L、嗎啉乙磺酸1.0"g/L、乙酰丁香酮0.04"g/L和質量體積比為0.1%的泊洛沙姆，pH"5.4。

1.2.3""侵染和共培養""將糜子的胚性愈傷誘導組織加至活化農桿菌菌液中，按每30"mL活化農桿菌菌液中加入60～80塊直徑約為0.5"cm糜子的胚性愈傷誘導組織的比例添加，于20"℃以120"r/min輕搖振蕩侵染60"min（振蕩侵染采用暗培養），侵染完成后，倒掉菌液，得經侵染的糜子胚性愈傷組織。將經侵染的糜子胚性愈傷組織倒在無菌濾紙上，吸干多余的菌液，并在超凈臺上適當吹干，約30"min后轉接到放有無菌濾紙的共培養培養基上，20"℃暗培養6"d，得共培養后糜子胚性愈傷組織。共培養培養基中含有MS干粉2.2"g/L、蔗糖30.0"g/L、嗎啉乙磺酸1.0"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.002"g/L、激動素0.0005"g/L、乙酰丁香酮0.04"g/L和植物凝膠4.0"g/L，pH"5.4。

1.2.4""抗性愈傷的篩選""將共培養后糜子胚性愈傷組織轉移至愈傷篩選培養基上，每皿約20～30粒共培養后糜子胚性愈傷組織，24"℃暗培養2周，完成一次繼代，轉至光照培養2周（光照培養是于24"℃采用12"h/12"h光/暗培養），完成第二次繼代，整個共培養篩選過程繼代2次，每2周繼代1次，共培養篩選總用時1個月，得抗性愈傷組織。愈傷篩選培養基中含有MS干粉4.4"g/L、蔗糖30.0"g/L、七水合硫酸鋅0.035"g/L、五水合硫酸銅0.0006"g/L、激動素0.0005"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.002"g/L、植物凝膠9.0"g/L、特美汀0.5"g/L和潮霉素0.025"g/L，pH"5.8。

1.2.5""分化和生根""先從愈傷篩選培養基中將抗性愈傷組織轉移至第一階段分化培養基中，于24"℃采用12"h/12"h的光/暗培養方式進行光培養2周，再轉接至第二階段分化培養基中，24"℃采用12"h/12"h的光/暗培養方式進行光培養2周，得苗高約2"cm的分化幼苗。將分化幼苗接入生根培養基中，于24"℃采用12"h/12"h的光/暗培養方式進行生根培養1～2周得糜子的抗性再生植株。第一階段分化培養基中含有MS干粉4.4"g/L、蔗糖30.0"g/L、MS微量元素母液（1000′）1.0"mL/L、MS維生素（1000′）1.0"mL/L、6-芐氨基嘌呤0.003"g/L、激動素0.003"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.001"g/L、椰子水5%（V/V）、特美汀0.5"g/L、潮霉素0.015"g/L、稀釋5000倍的軟骨素1.0"mL/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。第二階段分化培養基中含有MS干粉4.4nbsp;g/L、蔗糖20.0"g/L、MS微量元素母液（1000′）1nbsp;mL/L、MS維生素（1000′）1"mL/L、6-芐氨基嘌呤0.001"g/L、激動素（KT）0.001"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.0005"g/L、椰子水5%（V/V）、特美汀0.5"g/L、潮霉素0.015"g/L、稀釋5000倍的軟骨素1.0"mL/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。生根培養基中含有MS干粉2.2"g/L、蔗糖15.0"g/L、MS微量元素母液（1000′）1.0"mL/L、MS維生素（1000′）1.0"mL/L、3-吲哚丁酸0.0005"g/L、特美汀0.5"g/L、潮霉素0.015"g/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。

1.2.6""抗性再生植株的PCR鑒定""糜子的抗性再生植株用水洗掉培養基，移栽到植物培養箱中利用營養土進行栽培，栽培過程中待轉基因植株長到20"cm高后，剪取葉片提取其基因組DNA。以上述DNA為模板，對抗性再生植株進行了潮霉素抗性基因HPT和載體特異序列M1的PCR檢測，使用的檢測引物見表1。PCR檢測使用的酶為Taq"Mix，反應體系為：無菌水9.5"μL、引物（10"μmol/L）各1.0"μL、Taq"Mix"12.5"μL、DNA模板1.0"μL。PCR擴增程序為：95"℃預變性5"min；95"℃變性30"s，60"℃退火30"s，72"℃延伸30"s，35個循環；72"℃延伸7"min。PCR擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。根據不同批次的糜子轉化實驗統計糜子的抗性再生植株的篩選效率和轉化效率。其中，篩選效率=PCR陽性的抗性再生植株數量/抗性再生植株數量×100%；轉化效率=PCR陽性的抗性再生植株數量/胚性愈傷誘導組織數量×100%。

2""結果與分析

2.1""糜子的胚性愈傷誘導

為考察添加細胞分裂素和生長素對愈傷組織形成的影響，在愈傷誘導階段設置了2種培養基CIM和MSD。結果表明，CIM和MSD培養基均能誘導糜子胚性愈傷，但CIM誘導效率更高（圖2），表明KT的添加對糜子愈傷的誘導有促進作用。糜子的胚性愈傷組織致密，非水漬狀，其在CIM培養基上誘導的不同階段的狀態見圖3。

2.2""抗性愈傷的篩選、分化和生根

糜子胚性愈傷在篩選培養基上暗培養2周后，糜子胚性愈傷會發生褐化，將糜子愈傷轉至光培養2周，期間會有抗性愈傷的生長，抗性愈傷會分化出綠色的組織（圖4A），轉至分化培養基上繼續培養會分化出糜子再生苗。將糜子再生苗幼苗接入生根培養基中進行生根培養1～2周，即為抗性苗（圖4B）。具體生根培養時間根據幼苗大小決定，待生根完成后，得糜子的抗性再生植株，整個轉化周期約為12～16周。

2.3""糜子再生苗的PCR檢測

將糜子的抗性再生植株移栽到植物培養箱培養至約20"cm高時進行PCR檢測，HPT和M1的檢測結果為陽性，即為抗性轉基因苗。多個糜子抗性再生植株的HPT和M1的PCR檢測結果如圖5所示，糜子的抗性再生植株都能擴增出目的基因HPT和M1，而野生型對照（CK-）、DNA提取對照（CK1）和空白對照（CK2）均未擴增出目的條帶，說明這些抗性再生植株均為轉基因陽性植株，目的載體已經成功導入到糜子基因組中。根據3個批次的糜子轉化實驗結果統計糜子的抗性再生植株的篩選效率和轉化效率（表2），結果表明，本方法獲得的糜子抗性再生植株的篩選效率為100%，平均轉化效率約為30.4%。

3""討論

糜子是起源于我國的最古老農作物之一，曾經是我國北方重要栽培作物，但隨著農業生產的發展，逐漸退出主栽作物地位成為區域特色作物，主要原因是糜子產量沒有大的突破，品質沒有根本提升[9]。近年來，膳食結構多樣化成為人們追求健康生活的需求，雜糧倍受重視，糜子作為藥食同源作物展現了新的種植前景[17]。因此，改良糜子品質和提高糜子產量對糜子的產業發展具有重要意義。現代基因工程技術的發展為糜子提供了快速有效的轉基因育種的途徑。

有效的遺傳轉化對于轉基因育種至關重要，但目前針對糜子的遺傳轉化方法僅在近3年開始有少量報道。2021年，申請號為202111531566.3的中國發明專利申請公開了一種黍屬植物的遺傳轉化方法，其采用基因槍轟擊法獲得了糜子的轉基因植株[18]。但該方法可能引起突變、丟失和基因沉默等問題，不利于外源基因在糜子中穩定表達，同時還具有操作復雜、命中率低、轉化效率低、育種成本高等缺點。2024年，研究者成功利用農桿菌介導法獲得了糜子的基因編輯植株。LIU等[19]利用農桿菌介導法將基因編輯載體導入糜子品種Hongmi的基因組中，以潮霉素抗性基因為篩選標記獲得了八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）基因敲除的轉基因植株，轉基因植株出現白化癥狀。此外，LU等[20]也利用農桿菌介導法將基因編輯載體導入糜子品種Longmi4的基因組中，以潮霉素抗性基因為篩選標記獲得了Pmsd1敲除的轉基因植株，轉基因植株出現明顯的矮化癥狀。雖然上述研究已經通過基因槍法或農桿菌介導法獲得了糜子的轉基因株系，但由于農桿菌介導的轉化法受基因型的限制，不同品系的胚性愈傷誘導能力、農桿菌侵染能力、愈傷脫分化能力均不同，導致不同品系的轉化效率也存在較大差異。因此，針對不同品種的糜子的遺傳轉化方法仍需進行各項條件的摸索。

本研究以糜子品種冀黍5號的成熟種子為外植體，采用CIM培養基誘導糜子胚性愈傷，以潮霉素抗性基因為篩選標記經過抗性愈傷的篩選、分化和生根獲得了糜子的轉基因植株。本研究建立的糜子遺傳轉化方法與上述糜子遺傳轉化研究[19-20]中的方法有諸多不同：上述研究中愈傷誘導使用的激素為2，4-二氯苯氧乙酸或2，4-二氯苯氧乙酸和6-芐氨基嘌呤，而本研究中使用的激素為2，4-二氯苯氧乙酸和激動素，有較高的愈傷誘導效率；上述研究中使用的農桿菌均為EHA105，本研究使用的農桿菌為AGL1，具有良好的侵染糜子

的效果；本研究在侵染培養液中添加了嗎啉乙磺酸和泊洛沙姆，起到穩定侵染液pH的作用；LIU等[19]在糜子胚性愈傷分化時使用的激素是6-芐氨基嘌呤，而本研究經過對分化培養基中的激素種類及比例的摸索，發現在分化階段使用2種分化培養基能獲得良好的分化效率，階段一和階段二培養基均含激素2，4-二氯苯氧乙酸、激動素和6-芐氨基嘌呤，只是含量上有變化，同時在分化培養基中添加了椰子水和軟骨素，也起到促進愈傷分化的作用。LIU等[19]在糜子篩選抗性胚性愈傷時使用的潮霉素濃度為0.05"g/L，本研究中使用的潮霉素濃度為0.025"g/L，這可能是由于品種差異導致的。本研究建立的冀黍5號的遺傳轉化方法獲得的抗性再生植株PCR鑒定的陽性率為100%，平均轉化效率30%以上，而LIU等[19]建立Hongmi的遺傳轉化方法的平均轉化效率僅為16.7%。

本研究建立了糜子品種冀黍5號的農桿菌介導的高效遺傳轉化方法，轉化周期為12～16周，操作簡單，轉化效率高，成本低廉，且轉化不受季節限制，能規模化開展，為糜子品種的遺傳改良提供有效的技術手段。

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