基于基因組重測(cè)序的沉香遺傳多樣性研究

摘""要：對(duì)種質(zhì)資源信息的掌握是土沉香遺傳改良的基礎(chǔ)，而基因組重測(cè)序是種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的利器，然而目前學(xué)術(shù)界缺乏利用基因組重測(cè)序?qū)ν脸料氵z傳多樣性的研究。本研究在前期收集得到的沉香種質(zhì)資源基礎(chǔ)上，采用基因組重測(cè)序，獲得60份沉香共1284"Gb重測(cè)序數(shù)據(jù)。利用沉香基因組，共檢測(cè)得到6"713"166個(gè)高質(zhì)量變異位點(diǎn)，其中SNP位點(diǎn)6"284"344個(gè)，Indel位點(diǎn)428"658個(gè)。主成分分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析均表明，沉香可分為3個(gè)顯著群體（Pop1、Pop2和Pop3），其中2個(gè)群體可分別進(jìn)一步劃分為多個(gè)亞群。在3個(gè)群體中均檢測(cè)到群體選擇信號(hào)，其中Pop3選擇信號(hào)最多，而核苷酸多態(tài)性計(jì)算結(jié)果表明，Pop3的核苷酸多態(tài)性最低。本研究為探究沉香遺傳資源多樣性提供了有價(jià)值的信息，并為基于基因組的沉香遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：沉香；基因組重測(cè)序；變異位點(diǎn)；遺傳多樣性中圖分類號(hào)：S792.99""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Genetic"Diversity"Studies"on"Aquilaria"sinensis"Based"on"Genome"Resequencing

GOU"Zhihui1，2，"CHEN"Guode1，2，"ZHEN"Yunnan3，"WANG"Xin1，2，"CHEN"Yu1，2，"TIAN"Mi1，2*

1."Hainan"Academy"of"Forestry"（Hainan"Academy"of"Mangrove），"Haikou，"Hainan"571100，"China;"2."Key"Laboratory"of"Tropical"Forestry"Resources"Monitoring"and"Application"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571100，"China;"3."Haikou"City"Wetland"Protection"and"Management"Center，"Haikou，"Hainan"571100，"China

Abstract："Knowledge"on"germplasm"resource"information"is"the"foundation"for"the"genetic"improvement"of"Aquilaria"sinensis，"and"genome"resequencing"is"a"powerful"tool"for"analyzing"the"genetic"diversity"of"germplasm"resources."However，"there"is"no"research"on"the"genetic"diversity"of"A."sinensis"using"genome"resequencing."Based"on"the"collection"of"A."sinensis"germplasm"resources"in"the"early"stages，"this"study"utilized"genome"resequencing"to"obtain"1284"Gb"of"resequencing"data"from"60"samples"of"A."sinensis."Using"the"agarwood"genome，"6"716"166"high-quality"variation"sites"were"detected，"including"6"284"344"SNP"sites"and"428"658"Indel"sites."Principal"component"analysis，"phylogenetic"analysis，"and"genetic"structure"analysis"all"indicated"that"A."sinensis"could"be"divided"into"three"distinct"groups"（Pop1，"Pop2"and"Pop3），"with"two"of"the"groups"further"subdivided"into"multiple"subgroups."Population"selection"signals"were"detected"in"all"the"groups，"with"Pop3"showing"the"highest"frequency"of"selection"signals."However，"nucleotide"polymorphism"calculations"indicated"that"Pop3"had"the"lowest"nucleotide"polymorphism."This"study"would"provide"valuable"information"for"exploring"the"genetic"resource"diversity"of"A."sinensis"and"lay"a"theoretical"foundation"for"genome-based"genetic"breeding"of"A."sinensis.

Keywords："Aquilaria"sinensis;"genome"resequencing;"variant"site;"genetic"diversity

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.006

沉香（Aquilaria"sinensis）是瑞香科沉香屬植物，分布于我國(guó)海南、廣東、廣西、福建等南方地區(qū)，是一種著名的產(chǎn)香植物。沉香主要由受傷或感染的木質(zhì)部分分泌出的樹(shù)脂形成，這種獨(dú)特的樹(shù)脂在亞洲及中東文化中具有廣泛的應(yīng)用，尤其是在中醫(yī)和民族醫(yī)學(xué)中具有獨(dú)特的價(jià)值。在化學(xué)成分上，沉香包含多種復(fù)雜的成分，其中最關(guān)鍵的成分包括各類揮發(fā)性油和非揮發(fā)性樹(shù)脂[1]。沉香的主要化學(xué)成分是沉香醇、沉香烯和芳樟醇等芳香族化合物，這些成分賦予了沉香獨(dú)特的香氣和藥理特性。近年來(lái)的研究表明，沉香具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌和鎮(zhèn)靜效果，它還有抗抑郁和抗焦慮的作用，有助于緩解精神壓力和提升心情；此外，有研究表明，沉香在提高免疫系統(tǒng)功能、治療呼吸系統(tǒng)疾病等方面具有潛在效用[2]。

近年來(lái)，沉香結(jié)香方法的研究持續(xù)受到學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的關(guān)注。傳統(tǒng)上，沉香是通過(guò)樹(shù)干自然形成的樹(shù)脂積累過(guò)程產(chǎn)生的，但這一過(guò)程需要很長(zhǎng)的時(shí)間，且產(chǎn)量較低[3]。因此，科學(xué)家們一直在尋找加快沉香形成過(guò)程的有效方法，如鉆孔、切割、火燒等，以滿足市場(chǎng)對(duì)高品質(zhì)沉香的需求[4-5]。另一方面，業(yè)內(nèi)也關(guān)注沉香不同種質(zhì)資源的結(jié)香效率和產(chǎn)率的區(qū)別，以篩選出高效產(chǎn)香的沉香種質(zhì)資源[6]。因此，系統(tǒng)評(píng)價(jià)沉香種質(zhì)資源的遺傳多樣性具有極高的實(shí)際意義。然而，由于沉香為喬木植物，通過(guò)表型評(píng)價(jià)較難，且由于結(jié)香困難，通過(guò)結(jié)香效果評(píng)價(jià)沉香也存在一定的隨機(jī)性。因此，對(duì)沉香種質(zhì)資源多樣性的研究較為緩慢。

近些年，香農(nóng)在廣東省和海南省發(fā)現(xiàn)了易結(jié)香的沉香品種150余個(gè)，這些品種在種植3年后，打孔造香，2～3年后即可采收，產(chǎn)香數(shù)量較多。近年來(lái)，多個(gè)團(tuán)隊(duì)采用分子標(biāo)記的方式對(duì)沉香種質(zhì)資源進(jìn)行劃分，包括ISSR、SRAP、AFLP等[5，"7-11]。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，較高質(zhì)量的白木香基因組也得以測(cè)序并公布[12-13]。這些基因組信息為采用基因組重測(cè)序的方式研究沉香種質(zhì)資源的遺傳多樣性提供了機(jī)遇，并為挖掘沉香品質(zhì)相關(guān)基因以及研究沉香結(jié)香的分子機(jī)制提供了基因組學(xué)基礎(chǔ)[13-15]。事實(shí)上，基于基因組、轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)手段，近年來(lái)沉香中一些重要基因也得以克隆，沉香結(jié)香等相關(guān)的分子機(jī)制得到初步的闡釋[13，"16-19]。然而，雖然基于基因組重測(cè)序的植物遺傳多樣性研究手段已經(jīng)成熟，然而鮮有將該方法應(yīng)用于沉香種質(zhì)資源多樣性研究。

本團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)展了系統(tǒng)的沉香種質(zhì)資源收集工作，本研究在此基礎(chǔ)上，采用基因組重測(cè)序進(jìn)行沉香的遺傳多樣性分析，為沉香種質(zhì)資源的整理及利用提供基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

在廣東省和海南省收集沉香優(yōu)異種質(zhì)資源，選取生長(zhǎng)健壯且具有代表性的沉香單株（表1），開(kāi)展沉香遺傳多樣性研究。

1.2""方法

1.2.1""DNA提取、測(cè)序和質(zhì)控""采集沉香葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA質(zhì)量，采用NanoDrop測(cè)定基因組DNA的濃度和純度。使用DNBSEQ-T7測(cè)序儀將檢測(cè)合格的DNA上樣進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)，共得到1284"Gb的

clean"data數(shù)據(jù)（paired-end"reads），平均測(cè)序深度為44.32"X。對(duì)clean"data的fastq文件進(jìn)行質(zhì)控，clean"data的重測(cè)序reads多數(shù)位置quality"score均高于35，表明clean"data的reads有較高的質(zhì)量，滿足后續(xù)分析重測(cè)序分析的要求。采用fastp對(duì)通過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控的重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步過(guò)濾和校正，主要目的如下：去重復(fù)、去接頭、過(guò)濾掉堿基質(zhì)量值低于Q20的比例達(dá)到20%以上的read，切掉序列上游的10個(gè)堿基，去除N堿基大于5的一對(duì)reads。同時(shí)進(jìn)行overlap對(duì)堿基進(jìn)行校正。重復(fù)reads檢測(cè)結(jié)果表明，有0.19%的reads重復(fù)[19]。在此步驟，刪除所有重復(fù)的reads，以保證每個(gè)樣本中所有reads僅為1個(gè)拷貝。此外，有1.28%的數(shù)據(jù)得到校正，2.01%的低質(zhì)量數(shù)據(jù)得到刪除。

1.2.2""變異位點(diǎn)檢測(cè)和篩選""將質(zhì)控、過(guò)濾、校正后的reads比對(duì)到沉香基因組上。采用deepvariant進(jìn)行變異檢測(cè)，過(guò)濾低質(zhì)量的變異位點(diǎn)，保留的變異位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)如下：缺失率小于20%、DP在5～100范圍內(nèi)、QD大于40、位點(diǎn)質(zhì)量值Qual值大于40[20]。在此基礎(chǔ)上，過(guò)濾掉MAF小于0.05、位點(diǎn)缺失率大于20%、哈-溫平衡檢驗(yàn)P值小于0.001的位點(diǎn)，并且只保留二等位位點(diǎn)，最終篩選得到高質(zhì)量變異位點(diǎn)。

1.2.3""遺傳多樣性分析""對(duì)二次過(guò)濾之后的標(biāo)記進(jìn)行連鎖不平衡（linkage"disequilibrium，"LD）分析，輸出R2表示LD的程度。依據(jù)LD分析結(jié)果，對(duì)vcf文件中所有標(biāo)記進(jìn)行篩選，以50個(gè)標(biāo)記的窗口大小，10為步長(zhǎng)，R2為0.2作為閾值進(jìn)行篩選（根據(jù)LD衰減圖認(rèn)為此時(shí)兩兩位點(diǎn)間的連鎖程度比較低）。利用這些篩選后的標(biāo)記進(jìn)行后續(xù)的群體結(jié)構(gòu)的分析。利用篩選后的位點(diǎn)，基于樣本的SNP信息進(jìn)行PCA分析[21]。采用Admixture軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)的分析，分別運(yùn)行K從2到6的運(yùn)算，最終對(duì)每個(gè)K值分析中的交叉驗(yàn)證誤差（cross-"validation"error）進(jìn)行分析[22]。

1.2.4"""群體選擇信號(hào)檢測(cè)""復(fù)合似然比檢驗(yàn)（composite"likelihood"ratio，CLR）主要用來(lái)檢測(cè)群體內(nèi)的選擇信號(hào)。本研究基于多位點(diǎn)頻率的檢測(cè)方法即SFS（site"frequency"spectrum），使用SweeD軟件（4.0.0）計(jì)算CLR（composite"likelihood"ratio）[23]。以20"Kb為窗口劃分窗格，計(jì)算CLR，篩選前5%的選擇信號(hào)。

核苷酸多態(tài)性（π）是衡量特定群體多態(tài)性高低的參數(shù)，是指在同一群體中隨機(jī)挑選的2條DNA序列在各個(gè)核苷酸位點(diǎn)上核苷酸差異的均值。π值越大，說(shuō)明其對(duì)應(yīng)的亞群多態(tài)性越高。用VCFtools軟件，以200"Kb為窗口大小，20"Kb為步長(zhǎng)進(jìn)行滑窗計(jì)算3個(gè)群體π值，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)群體的π值，采用R繪制箱線圖[24]。

2""結(jié)果與分析

2.1""多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)

采集本團(tuán)隊(duì)前期收集得到的60份沉香樣品葉片，進(jìn)行基因組重測(cè)序。測(cè)序完成數(shù)據(jù)下機(jī)后，共得到1284"Gb的clean"data數(shù)據(jù)（paired-end"reads），平均測(cè)序深度為44.32"X。去接頭后，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、過(guò)濾、校正，將reads比對(duì)到沉香基因組上，進(jìn)行變異檢測(cè)，共檢測(cè)到變異位點(diǎn)16"573"226個(gè)。對(duì)低質(zhì)量的變異位點(diǎn)進(jìn)行過(guò)濾，獲得SNP位點(diǎn)6"284"344個(gè)，Indel位點(diǎn)428"658個(gè)，SV位點(diǎn)164個(gè)。變異位點(diǎn)在各染色體的分布如表2所示。

考察SNP位點(diǎn)在染色體不同區(qū)域的分布發(fā)現(xiàn)，SNP在著絲粒區(qū)域密度較低，而SNP的分布在各染色體呈現(xiàn)順著著絲粒位置向兩側(cè)密度逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)；著絲粒外的區(qū)域中，有小片段的SNP密度較低的區(qū)域存在。其中，Scaffold_9996和Scaffold_8152兩條染色體上存在極大片段的低密度SNP位點(diǎn)（4000/1"Mb）區(qū)域（圖1）。

SNP和Indel在沉香基因組區(qū)域中的分布如圖2所示，SNP和Indel在基因組中的分布趨勢(shì)基本一致，即SNP密度高的區(qū)域Indel密度也較高，表明容易發(fā)生單核苷酸突變的基因組區(qū)域也較容易發(fā)生插入/缺失突變。

2.2""主成分分析

利用篩選后的位點(diǎn)，基于本項(xiàng)目60個(gè)群體樣本的變異信息進(jìn)行主成分分析（PCA），并對(duì)PCA結(jié)果進(jìn)行分群，結(jié)果如圖3所示。第一主成分和第二主成分分別解釋了總遺傳變異的10.78%和8.72%，表明PCA分析結(jié)果可靠。基于PCA分析，60個(gè)沉香樣本可分為3個(gè)群體。

2.3""系統(tǒng)發(fā)育分析

利用SNP信息對(duì)沉香樣本開(kāi)展系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖4所示。基于系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，60份沉香樣本可分為3個(gè)群體，該結(jié)果與PCA分析結(jié)果一致。此外，POP1至少可以進(jìn)一步分為4個(gè)亞群體，而POP2可進(jìn)一步分為3個(gè)亞群體。

2.4""遺傳成份分析

采用Admixture軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)的分析，分別運(yùn)行了K從2到6的運(yùn)算，最終對(duì)每個(gè)K值分析中的交叉驗(yàn)證誤差（cross-validation"error）進(jìn)行分析。基于分析結(jié)果，開(kāi)展STRUCTURE（遺傳結(jié)構(gòu)）分析，結(jié)果如圖5所示。

當(dāng)K=3時(shí)，樣本的分組與PCA分析和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致。因此，PCA分析、系統(tǒng)發(fā)育分析以及遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果均表明，易結(jié)香沉香資源可分為3個(gè)群體。此外，遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，POP3的遺傳背景較為單純，而POP1和POP2間存在較為頻繁的遺傳信息交流。當(dāng)K=4、5、6時(shí)，POP1和POP2可進(jìn)一步分為多個(gè)亞群體，該結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致。

2.5""群體選擇信號(hào)篩選

采用復(fù)合似然比檢驗(yàn)檢測(cè)沉香3個(gè)群體內(nèi)的選擇信號(hào)。以20"Kb為窗口劃分窗格，獲得前5%的選擇信號(hào)，如圖6所示。POP1中共檢測(cè)到3個(gè)信號(hào)，其中在Scaffold_10796中檢測(cè)得到2個(gè)信號(hào)，在Scaffold_10546中檢測(cè)到1個(gè)信號(hào)。在POP2中，也檢測(cè)到3個(gè)信號(hào)，分別分布于Scaffold_15334、Scaffold_10796和Scaffold_3585中。在Pop3中共檢測(cè)到53個(gè)選擇信號(hào)，且在各染色體上均有分布，表明POP3群體受到到強(qiáng)烈的選擇。分別計(jì)算3個(gè)沉香群體的π值，以200"Kb為窗口大小，20"Kb為步長(zhǎng)進(jìn)行滑窗，獲得統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明POP3的核苷酸多態(tài)性最低。

3""討論

近年來(lái)，基因組重測(cè)序技術(shù)在種質(zhì)資源多樣性研究中具有廣泛應(yīng)用。該技術(shù)可以用于分析種群的遺傳結(jié)構(gòu)和基因流動(dòng)情況，了解種群內(nèi)部的遺傳變異和遺傳分化情況。這對(duì)于保護(hù)和利用種質(zhì)資源、制定合理的保護(hù)策略具有重要意義[25-26]。通過(guò)比較具有不同表型的個(gè)體基因組，可以找到與抗病性、產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀相關(guān)的基因，為種質(zhì)資源的改良提供分子標(biāo)記[24-25]。基于重測(cè)序數(shù)據(jù)的遺傳多樣性分析結(jié)果可以用于基因組選擇和分子標(biāo)記輔助育種，通過(guò)標(biāo)記與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因，提升育種效率，加速育種進(jìn)程[26]。因此，基因組重測(cè)序能夠提供沉香高分辨率的遺傳信息，為沉香種質(zhì)資源的保護(hù)、利用和改良提供科學(xué)依據(jù)。

本研究從PCA、系統(tǒng)發(fā)育分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析等多個(gè)角度，分析沉香的遺傳多樣性。各種分析結(jié)果的一致性可說(shuō)明種質(zhì)資源間遺傳關(guān)系的信任度[27-28]。本研究分析表明，PCA、系統(tǒng)發(fā)育分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致，這一方面表明本研究分析結(jié)果可靠，另一方面沉香種質(zhì)資源可穩(wěn)定、明確地分為3個(gè)群體。因此，在雜種優(yōu)勢(shì)的利用上，可考慮在這3個(gè)群體間選擇不同的親本構(gòu)建沉香的雜交群體，從而選擇高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、易結(jié)香的沉香品種[29]。

本研究基于沉香基因組重測(cè)序以及沉香基因組序列，獲得了超過(guò)600萬(wàn)個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)，以及超過(guò)40萬(wàn)個(gè)Indel位點(diǎn)。已有多項(xiàng)研究表明，基于基因組重測(cè)序的遺傳多樣性分析更加精準(zhǔn)、全面。本研究采用豐富的SNP位點(diǎn)對(duì)沉香的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，并對(duì)群體選擇信號(hào)進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)。然而，這些多態(tài)性位點(diǎn)的價(jià)值不僅限于遺傳多樣性分析。利用這些位點(diǎn)以及相關(guān)的醇提遺傳分析結(jié)果，可以開(kāi)展沉香的基因組輔助育種，還可以鑒定影響沉香品質(zhì)、產(chǎn)量的關(guān)鍵基因，提高沉香育種效率。本研究為開(kāi)展沉香的遺傳多樣性及基于基因組的沉香育種提供理論基礎(chǔ)。

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