金黃色葡萄球菌平板計數法不確定度的評估

摘 要：目的：針對奶粉基質，評估GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》中平板計數法的測量不確定度。方法：參考修訂版RB/T 151《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》設計評估方案，分別評估技術不確定度、基質不確定度和分布不確定度，然后計算合成不確定度和擴展不確定度，最終可以根據實驗室需求選擇僅考慮技術不確定度，或者考慮全部不確定分量。結果：通過測試結果的統計分析，技術不確定度為0.0733log10CFU/g；基質不確定度為0.0518 log10CFU/g；分布不確定度需要考慮泊松不確定度和確證不確定度，根據每次檢測的結果查表或通過公式計算獲得。結論：按照修訂版RB/T 151進行不確定度評估，思路清晰，方案設計簡潔，執行順利，非常有利于實驗室開展微生物檢測方法的不確定度評估工作。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌，平板計數法，不確定度，實驗室內再現性，GB 4789.10—2016

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2025.01.039

0 引 言

測量不確定度的評估是實驗室質量管理體系的重要組成部分[1-6]，是測試實驗室質量控制有效性的重要內容。我國實驗室認證認可文件GB/ T27025—2019和RB/T 214—2017均明確要求實驗室建立和實施評估測量不確定度的程序[7-11]。CNASCL01-A001：2022[12]也明確規定了檢測人員應掌握測量不確定度評估方法，并在標準、技術規范有要求時或客戶有需求時正確運用，有能力對定量微生物檢測方法進行不確定度評估。

近三年國內實驗室對食品微生物測量不確定度的研究文獻明顯增加，在菌落總數、大腸菌群等檢驗項目[13-14]均有關于不確定度的論文發表，但這些文獻評定不確定度的方法各異，尚未形成統一意見。國際上食品微生物測量不確定度評估的參考標準為ISO 19036，參考該標準開展的研究工作很多[15-20]。筆者承擔認證認可行業標準RB/T 151[21]的修訂工作，參考最新版ISO 19036：2019 Microbiologyof the food chain — Estimation of measurementuncertainty for quantitative determinations [22]，對原標準進行了修訂并更新為RB/T 228—2023《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》[23]。按照新標準，使用奶粉基質，對GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[24]中金黃色葡萄球菌平板計數法的測量不確定度進行評估，分別評估了技術不確定度、基質不確定度和分布不確定度，并計算了合成不確定度和擴展不確定度。為食品微生物實驗室進行微生物平板計數法的不確定評估提供了參考示例。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶粉：青島。

試劑：Baird-Parker瓊脂平板（北京陸橋技術股份有限公司）；血瓊脂平板（北京陸橋技術股份有限公司）；腦心浸出液肉湯（BHI）（北京陸橋技術股份有限公司）；兔血漿（北京陸橋技術股份有限公司）；營養瓊脂小斜面（北京陸橋技術股份有限公司）；革蘭氏染色液（北京陸橋技術股份有限公司）。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 6538（北京陸橋技術股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

MIR-H263L-PC恒溫培養箱，普和希健康醫療器械（上海）有限公司；ME2002電子天平0.01 g，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；MLS-830L高壓蒸汽滅菌鍋，普和希健康醫療器械（上海）有限公司；XT5118-OV240電熱鼓風干燥箱，杭州雪中炭恒溫技術有限公司；1374生物安全柜，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 接種液制備

金黃色葡萄球菌標準菌株加入至BHI增菌液中，36℃培養24 h，將培養后菌液梯度稀釋至大約102 CFU/mL，同時對培養后菌液進行菌落總數測定，以確定標準菌株原液濃度及實際添加量。

1.3.2 人工污染樣品的制備

無菌稱取25 g奶粉置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質袋中，加入制備好的接種液1 mL，制成1：10的樣品勻液。

1.3.3 樣品檢測

按照GB 4789.10—2016對1.3.2中的人工污染樣品進行后續檢測并報告結果。

1.3.4 技術不確定度評估條件

在實驗室內再現性條件下，分別對1個人工污染樣品的2份測試部分進行檢測（見圖1）。再現性檢測條件應盡可能不同，包含所有技術不確定度來源，包括不同檢測時間、不同人員、不同批次培養基、不同儀器設備。積累10組檢測數據進行分析。

1.3.5 基質不確定度評估條件

在重復性條件下，對10個人工污染樣品進行檢測，每個樣品檢測2份測試部分得到2個測試結果（見圖2）。重復性條件為使用同一批次培養基、同一儀器設備，由同一人員在短時間內對樣品進行重復檢測，實驗條件應盡可能保持一致。

2 結果與分析

2.1 技術不確定度的評估

根據RB/T 151，實驗室內再現性標準偏差由公式1計算：

式中：SIR為實驗室內再現性標準偏差；n為樣品數量；i為樣品序號；y iA為條件A菌落數式中：數x iA的對數值，log10CFU/g；yiB為條件B菌落數xiB的對數值，log10CFU/g。

再現性條件下的檢測結果以及再現性標準偏差的計算如表1所示。

由表1可知，此即為技術不確定度u t e c h =S I R=0.0733 log10CFU/g

2.2 基質不確定度的評估

根據RB/T 151，實驗室內再現性標準偏差由公式（2）和公式（3）計算：

式中：Sr為實驗室內重復性標準偏差；n為樣品數量；i為樣品序號；j 為從實驗室樣品i中取的測試部分的分數（j =1，2，3……，pi）；x ij為樣品i 的測試部分j的結果，CFU/g；

yij為xij的對數值，log10CFU/g。

再現性條件下的檢測結果以及再現性標準偏差的計算如表2所示。

由表2可知，此即為基質不確定度u m a t r i x =s r=0.0518 log10CFU/g。

2.3 分布不確定度的評估

由于金黃色葡萄球菌平板計數法需要對疑似菌落進行確證，因此需要分別考慮泊松不確定度和確證不確定度。

根據每次檢測的結果，所選用稀釋度的平板菌落數之和ΣC，查RB/T 151中表3或使用公式（2）計算得u Po i s s o n，作為每次檢測的泊松分布不確定度。

由于GB 4789.10—2016規定從Baird-Parker瓊脂平板上至少挑選5個疑似菌落進行目標菌確證，根據確證結果查RB/T 151中表4或使用公式（3）計算得u Conf，作為每次檢測的確證不確定度。

例如，某次測試的ΣC=23，np =5，nc =5，查RB/T 151中表3得u Poisson = 0.091 log10 CFU/g，查表4得u Conf=0.0454 log10CFU/g。

2.4 合成不確定度的評估

通常可以根據實驗室規定或與客戶協商的要求，僅以技術不確定度表示合成標準不確定度，即

uc （y）= utech =SIR =0.0733 log10CFU/g （4）

如有特殊要求需要出具某次具體測試的不確定度時，如前例，按公式（5）計算合成不確定度。

根據RB/ T 151，由于比值utech/upoisson=0.0733/0.091=081，比值uconf/upoisson=0.0454/0.091=0.50，比值umatrix/upoisson=0.0518/0.091=0.57，均大于0.2，因此utech分量、uConf分量和umatrix分量均不能忽略不計；故合成標準不確定度

2.5 擴展不確定度的評估

按照RB/T 151，取置信水平P =95%，則包含因子k =2。如果僅以技術不確定度表示合成標準不確定度，其擴展不確定度為：

U =k uc=2×0.0733=0.1466 log 10CFU/g （7）

如果需要考慮全部不確定度分量，其擴展不確定度為：

U =k uc= 2×0.1356=0.2713 log10CFU/g （8）

3 結 語

本研究工作是為驗證RB/T 151修訂版的實用性而開展的，實踐證明修訂后的RB/T 151思路比較清晰，將技術不確定度、基質不確定度和分布不確定度作為三個分量獨立進行評估，實驗室可以依據其詳盡的規定方便地設計實驗方案并完成評估，而且基質不確定度允許借鑒權威實驗室的結果，這將極大地減輕實驗室的工作量；對于日常測量結果，考慮了由特定結果引入的分布不確定度，使不確定度評估在日常的應用中更加準確。因此預計在標準實施后能有效推動我國微生物測量不確定度評估工作的順利開展。

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[24]食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗：GB 4789.10—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

作者簡介

姜勇，碩士研究生，高級工程師，研究方向為食品檢測。

雷質文，通信作者，碩士研究生，研究員，研究方向為食品安全質量監控標準化。

（責任編輯：袁文靜）