低劑量氚水基于Nrf2通路誘導肺癌細胞的輻射適應性反應

關鍵詞：氚水;電離輻射;適應性反應;Nrf2通路

中圖分類號：Q691 文獻標志碼：A

隨著核能事業的不斷發展，核反應堆的建立日益增多，氚向環境中排放量不斷增加，對人類健康的影響越來越重要[1-2] 。氚是氫三種同位素（氕、氘、氚）之一，具有放射性，可以發生β 衰變釋放β 粒子。氚可以通過呼吸、消化道和皮膚進入人體，當氚進入人體時其釋放的低能β 粒子所產生的損傷非常嚴重，其原因是氚屬于持續性的內照射[3-4] 。有研究表明，氚釋放的低能電子具有較高的電離密度，在與胞內分子相互作用過程中可以降低超氧化物歧化酶的活性，使胞內自由基增多[5-8] ，攻擊胞內DNA、蛋白質等生物分子，產生更多DNA 鏈斷裂[7，9-10] 和染色體畸變[11-12] ，最終促使細胞凋亡[13-16] 。

早期研究中，Olivieri 等[17]用氚作為低劑量輻射源和1. 5Gy X 射線先后處理人淋巴細胞，提出輻射適應性的概念。隨后，其他學者發現適應性反應不僅存在于如人外周血細胞等正常細胞[18]中也存在于如非小細胞肺癌A549和淋巴瘤EL-4等癌細胞[19-21] 中，

在輻射適應性反應的機制研究方面，Sanderson[22] 、Ikushima [23] 等學者發現氚誘導適應性反應與多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶介導的DNA堿基切除修復途徑有關。隨著對輻射適應性反應機制研究的深入，他們使用了X 射線等其他輻射證實免疫途徑和抗氧化途徑也在輻射適應性反應中發揮作用[24] ，尤其是抗氧化途徑被證明在輻射適應性反應中起了關鍵作用[21] ，然而抗氧化途徑是否在氚水誘導適應性反應中起作用有待進一步探究。

抗氧化途徑以核轉錄因子E2 相關因子2（Nrf2）途徑為主，是機體在遭受氧化損傷時維持氧化平衡的重要途徑[18] 。白藜蘆醇作為Nrf2激活劑可以通過激活PI3K/Akt 途徑和MAPK 途徑誘導Nrf2活化，可顯著減少氧化應激后細胞內的活性氧（ ROS） 水平，抑制細胞凋亡，促進細胞存活[25] 。ML385 作為被高通量篩選發現的Nrf2抑制劑，能夠直接與Nrf2 蛋白相互作用，阻止Nrf2與靶基因的DNA 序列結合，從而抑制下游靶基因表達[26] 。

因此，本文選用肺癌細胞A549 為研究對象，用氚水處理探究其是否誘導癌細胞的輻射適應性反應，同時進一步探究抗氧化途徑Nrf2 通路是否在氚水誘導輻射適應性反應中起關鍵作用，以期進一步了解氚水對生物體的影響。

1材料和方法

1. 1實驗材料與儀器

1. 1. 1細胞培養

實驗中使用的人非小細胞肺癌A549 細胞購自ATCC。按照10% 胎牛血清和1% 雙抗加入1640 培養基來配制完全培養基。使用配制好的完全培養基以合適的密度將細胞接種在25 cm² 培養瓶中，培養基總量5 mL，放入5%CO₂ 、37 ℃ 細胞培養箱中培養，每隔一天傳一次代。

1. 1. 2試劑與儀器

試劑：RPMI-1640培養基（Gibco公司）、磷酸緩沖鹽溶液（即PBS，Gibco 公司）、EDTA-胰蛋白酶（Gibco 公司）、青霉素-鏈霉素溶液（ 即雙抗，Gibco 公司）、胎牛血清（Lonsera 公司）、噻唑蘭（即MTT，麥克林公司）、二甲基亞砜（即DMSO，MP 公司）、ROS 檢測試劑盒（ 索萊寶公司）、白藜蘆醇（Sigma 公司）、ML385 （ MedChemExpress 公司）。氚水（3. 5×10⁹ Bq/ L）由中國科學院合肥物質研究所核能安全技術研究所提供。

儀器：高壓滅菌鍋、倒置顯微鏡、恒溫水浴鍋、離心機、超凈工作臺、電動移液槍、細胞培養箱、酶標儀、熒光顯微鏡。

X射線源由中國科學院合肥腫瘤醫院提供，使用的是Elekta Infinity直線加速器，照射劑量為4～20 Gy，劑量率為560 cGy/ min。

1. 2. 2白藜蘆醇和ML385 處理

在細胞生長到彌合度70% ～80%時，用含不同濃度白藜蘆醇（0、1、5、10、20 和50 μM）培養基培養A549 細胞24 h 檢測細胞活力;用0、1、5、10、20和50 μM 白藜蘆醇預處理A549 細胞24 h，4 Gy X射線照射，48 h 后檢測細胞活力;用含不同濃度ML385（0、1、5 和10 μM）的培養基培養細胞24 h檢測細胞活力;0、1、5 和10μM ML385 預處理A549 細胞24 h，4 Gy X 射線照射，48 h 后檢測細胞活力;設置空白對照組、4 Gy X 射線照射組、白藜蘆醇預處理照射組、氚水預處理照射組和氚水+ML385 預處理照射組，其中后三組分別用1 μM 白藜蘆醇、1. 4 × 10⁴ Bq/ mL 氚水和1 μM ML385 +1. 4×10⁴ Bq/ mL 氚水預處理細胞24 h，除空白對照組外均照射4 Gy X 射線并檢測X 射線照射后48 h 時的細胞活力和2 h 后的ROS水平。

1. 2. 3細胞活力檢測

使用MTT 法對細胞活力進行檢測。從細胞培養箱取出細胞，吸去原來的培養基，加入配制好的MTT 工作液，每皿1 mL，另外再取一個新培養皿也加入1 mL MTT 工作液作為調零孔。將加了MTT 工作液的實驗組、對照組和調零孔一起放入細胞培養箱中孵育。4 h 后取出，棄去上清液，每孔加入DMSO 1 mL，靜置5 min，搖晃培養皿使細胞內結晶紫充分溶解在DMSO 中。每皿吸取200μL 加入96 孔板，設置3 個復孔。使用酶標儀在492 nm 處測量吸光度（OD）。

1. 2. 4ROS檢測

使用DCFH-DA 熒光探針檢測細胞內活性氧水平。在1. 2. 1 和1. 2. 2 節中所提分組0 或4 GyX 射線處理細胞后2 h 時給細胞裝載DCFH-DA 熒光探針，棄去培養皿中的培養基，用PBS 清洗一次，每皿加入1 mL 稀釋后的探針，放入細胞培養箱中避光孵育20 min 后，棄去培養皿中液體，用PBS 清洗三次，以充分去除未進入細胞的探針，防止檢測背景過高。清洗后每皿留有1 mL PBS，維持細胞形態。使用熒光倒置顯微鏡對細胞進行拍照，每組隨機選擇至少三個區域進行拍攝。最后使用Image J 對照片中細胞的熒光進行定量分析，檢測其平均熒光強度。

1. 3數據統計與分析

實驗中的所有數據均使用統計繪圖軟件GraphPad Prism 9 進行統計分析和繪制圖像，數據以平均值±標準差的形式表示。使用獨立樣本t檢驗對實驗數據進行顯著性差異分析，當P lt;0. 05時，說明有統計學差異;當Plt;0. 01 時，說明差異極顯著。

2結果

2. 1氚水誘導的適應性反應可以恢復X 射線照射后的A549細胞活力

為檢測低劑量氚水對肺癌細胞A549生長增殖的影響，用不同活度氚水處理A549 細胞。細胞活力結果如圖1所示。與未加氚水的對照組相比，各活度氚水組的細胞活力沒有顯著變化（P gt;0. 05）。結果表明，低劑量氚水未對細胞增殖產生影響。

為檢測不同劑量X 射線對A549 細胞活力的影響，使用不同劑量X 射線照射A549 細胞，細胞活力結果如圖2（a）所示，發現隨著劑量的增加細胞活力呈現逐漸下降的趨勢。以對照組（0 Gy）為基準，4、8、12、16 和20 Gy X 射線劑量組細胞活力數值均表現出顯著下降（P lt;0. 01），表明4 ～ 20 Gy的X 射線照射均能抑制A549 細胞的細胞活力，可以顯著降低A549 細胞的增殖水平。因4 Gy X 射線即可以有效引起A549 細胞活力下降，選取4 GyX 射線用于后續的輻射適應性反應實驗。

為探究氚水是否能誘導肺癌細胞產生輻射適應性反應以及在多少活度的氚水處理后可以誘導輻射適應性反應，用不同活度氚水預處理A549 細胞 24 h 后，用4 Gy X 射線對細胞進行照射，檢測細胞活力，結果如圖2（b）所示。氚水和X 射線共同處理后的細胞活力隨著氚水活度的升高，呈現先上升后下降的趨勢，即較低活度（7×10³ 和1. 4×10⁴ Bq/ mL） 氚水處理后可以恢復4 Gy 照射后A549 細胞的細胞活力，而較高活度（2. 8×10⁴ 和3. 5×10⁴ Bq/ mL）氚水處理后會使A549 的細胞活力進一步下降。綜上，7×10³和 1. 4×10⁴ Bq/ mL 的氚水可以誘導A549 細胞產生輻射適應性反應，其中1. 4×10⁴ Bq/ mL 恢復的細胞活力最顯著，選取該活度用于后續氚水適應性反應探究。

2. 2氚水誘導的適應性反應可降低照射后A549細胞內的氧化水平

熒光顯微鏡下細胞熒光情況如圖3（a）所示。

可見空白對照組幾乎未見綠色熒光，低活度氚水處理組細胞有少量綠色熒光，X 射線組綠色熒光明顯，氚水+X 射線組可見綠色熒光但沒有X射線組的明顯。定量檢測熒光強度情況如圖3（b） 所示，氚水和X 射線分別處理后的細胞內平均熒光強度有顯著上升（Plt;0. 05），氚水+X 射線組相較于未用氚水預處理的X 射線組，其平均熒光強度顯著下降（p=0. 000 4）。結果表明，低活度氚水和X 射線都可使胞內ROS 顯著上升，而氚水預處理可以顯著降低X 射線照射后胞內ROS 水平，說明氚水可以在氧化水平上誘導A549細胞產生輻射適應性反應，減少高劑量X 射線照射后細胞的氧化損傷。

2. 3明確白藜蘆醇和ML385的使用濃度

為探究氚水是否通過激活Nrf2通路誘導輻射適應性反應，本文使用了Nrf2激活劑白藜蘆醇和Nrf2 抑制劑ML385[26] 。

白藜蘆醇作為公認的Nrf2 激活劑，前人研究中報道它在預處理細胞后可以通過激活Nrf2 通路來減少后續輻射對細胞的損傷[27] 。不同濃度白藜蘆醇處理細胞活力結果如圖4（a） 所示。與對照組（0 μM）相比，各濃度白藜蘆醇處理后的細胞活力沒有顯著差異（P gt;0. 05），表明各濃度白藜蘆醇并未對細胞活力產生影響。隨后用這六個藥物濃度處理A549細胞24 h 后，用4 Gy X 射線照射細胞，檢測A549 細胞活力，結果如圖4（b） 所示。發現4 Gy X 射線照射后，A549 細胞活力隨著預先加入的白藜蘆醇濃度的增加，呈現先上升后下降的趨勢。與未用白藜蘆醇預處理的對照組（ 0μM）相比，較低濃度（1 μM）白藜蘆醇預處理后細胞活力顯著上升（Plt;0. 01），較高濃度（5、10、20 和50 μM）白藜蘆醇預處理后細胞活力顯著下降（P lt;0. 01）。因1 μM 白藜蘆醇可以顯著恢復4 Gy X射線照射后的細胞活力，將選用該濃度進行后續實驗。

同樣檢測不同濃度ML385 處理A549 細胞后的細胞活力，結果如圖5（a） 所示。與對照組（0μM）相比，各濃度ML385 處理后的細胞活力沒有顯著差異（Pgt;0. 05），表明各濃度ML385 并未對細胞活力產生影響。隨后，使用這三個藥物濃度對A549 細胞進行預處理，24 h 后4 Gy X 射線照射，結果如圖5（b）所示。ML385 預處理下4 Gy X 射線照射后的A549 細胞活力隨著ML385 濃度的升高逐漸下降。與未用ML385 預處理的對照組（0μM）相比，1 μM 的ML385 就可以顯著抑制4 Gy照射后的A549 細胞活力，選取1 μM ML385 進行后續實驗。

2. 4氚水可以通過激活Nrf2 通路誘導A549 細胞的適應性反應

為探究氚水是否通過激活Nrf2 通路誘導肺癌細胞A549 產生輻射適應性反應，本文對各處理組處理后的A549 細胞的細胞活力以及氧化水平進行了檢測。細胞活力結果如圖 6 所示。氚水預處理和白藜蘆醇預處理后的細胞活力有相同的趨勢，與空白對照組的細胞活力相比，4 Gy X 射線照射使得A549 細胞活力顯著下降，白藜蘆醇和氚水的預處理都顯著恢復了4 Gy X 射線照射后的細胞活力，而氚水+ML385 預處理后的細胞活力相較于氚水預處理組顯著下降。結果表明，氚水可能與白藜蘆醇一樣通過預先激活Nrf2 通路保護了細胞免受后續大劑量X 射線引起的細胞活力降低，一旦被ML385 抑制了Nrf2 通路，其誘導的適應性反應便消失了。

熒光顯微鏡下的A549 細胞ROS 水平結果如圖7（a）所示。相對于空白對照組，4 Gy 空白組熒光明顯增強，氚水和白藜蘆醇預處理組的熒光相對4 Gy 空白組熒光強度減弱，而氚水+ML385 預處理組的熒光增強。定量檢測熒光強度結果如圖7（b）所示，氚水預處理和白藜蘆醇預處理都使得4 Gy X 射線照射后的平均熒光強度顯著下降（P lt;0. 01），氚水+ML385 預處理組相對氚水預處理組平均熒光強度顯著上升（P lt;0. 05）。結果表明，氚水和白藜蘆醇都可以顯著降低X 射線照射引起的胞內ROS 水平升高，加入ML385 則氚水預處理不再能降低后續X 射線照射后的胞內氧化水平，ROS 水平顯著升高，氚水誘導的適應性反應消失。

綜上，氚水能夠通過激活Nrf2 通路誘導適應性反應，降低高劑量輻射后的胞內氧化水平，促進細胞存活。

3討論

本文以A549細胞為研究對象，選用不同活度氚水作為適應劑量探究其對后續4 Gy X 射線的適應性反應，并探究了抗氧化途徑Nrf2 通路在其中的所起的作用。針對本實驗的結果討論如下：

（1）A549細胞存在適應性反應，不僅與射線類型相關，而且與照射方式相關。本研究發現低劑量氚水預處理肺癌細胞A549 可以顯著改變高劑量X 射線造成的細胞活力下降和胞內氧化水平升高，證明了低劑量輻射能夠誘導肺癌細胞的輻射適應性反應。對α 粒子而言，CHEN 等[21] 發現50 mGy α 粒子可誘導A549 細胞對后續的750mGy α 粒子輻照產生放射抗性，具有適應性反應。對于X 射線， WANG 等[19] 發現50 mGy 或200mGy X 射線預處理A549 細胞后，可以誘導其對后續20 Gy X射線產生適應性反應。由此可見，適應性反應與射線類型密切相關。

對于適應劑量照射方式而言，氚水的照射屬于持續性照射，而X 射線的照射屬于急性照射。從YANG 等[28] 研究結果來看，所采用的75 mGy X射線預處理的A549 細胞，在后續24 h 的5Gy X射線處理中未發現誘導適應性反應，作者認為其原因可能與適應劑量和后續高劑量間的時間間隔有關。針對時間間隔問題，余小玲等[29] 研究者開展了間隔時間分別為3 h、6h、12 h、24 h 和48 h 的輻射適應性反應實驗，發現不超過24 h 時，A549細胞有適應性反應;但時間間隔延長至48 h 時，適應性反應消失。本文使用的氚水屬于持續性內照射β 射線，具有其特殊性，不存在時間間隔的問題[30] 。由此可見，適應性反應與照射方式也密切相關。

（ 2）氚在細胞中誘導適應性反應可能存在閾值，且閾值大小與細胞類型相關。本文中選用活度為7×10³ Bq/ mL 和1. 4×10⁴ Bq/ mL 的氚水預處理后可誘導適應性反應;而氚水活度為2. 1×10⁴ 、2. 8×10⁴和 3. 5×10⁴ Bq/ mL 時，適應性反應消失，表明氚誘導輻射適應性的活度可能存在閾值。從Ikushima 等[23，30] 的研究成果來看，活度為3. 7 ×10² ～1. 85×10³ Bq/ mL 的含氚胸腺嘧啶預處理下，倉鼠細胞V79 可以觀察到適應性反應;而在過低活度（37 Bq/ mL 和3. 7 Bq/ mL）或過高活度（3. 7×10³ Bq/ mL 和7. 4×10³ Bq/ mL）預處理下，則沒有適應性反應，因此研究者提出氚的輻射適應性反應存在最佳閾值的觀點。雖然研究者高活度的值與本論文的高活度值大小不一樣，猜測這與細胞類型相關，但高活度存在有閾值現象是一致的。

（3）氚水通過激活Nrf2 通路誘導適應性反應。本研究進一步探究了氚水誘導適應性反應的潛在機制，使用白藜蘆醇預處理A549 細胞，發現可以恢復后續高劑量照射引起的活力下降和減少氧化損傷，而當使用ML385 抑制細胞Nrf2 通路時，氚水誘導的輻射抗性消失，表明Nrf2 通路在氚水誘導適應性反應的過程中起了關鍵作用，這與CHEN 等[21] 發現的適應劑量可通過Nrf2 通路誘導適應性反應的研究結果一致。根據前人研究，可能原因為：氚水通過自由擴散穿過細胞膜進入細胞，或參與細胞內物質合成，或參與細胞代謝，在細胞內釋放β 粒子[3] 。低活度的氚水預處理并未對細胞狀態產生顯著影響（如圖1 所示），但可以使胞內分子隨機電離產生ROS，同時還會刺激線粒體呼吸鏈以及產生氧化應激的酶系統[33] ，使得胞內ROS 水平激增（如圖3 所示），促使細胞外信號調節激酶1/ 2（ ERK1/ 2） 磷酸化，最終激活Nrf2 通路[34] 。此外，作者推測細胞自噬也在激活Nrf2 通路中發揮重要作用，CHEN 等[21] 發現低劑量電離輻射引起的ROS 升高可以通過促進A549細胞自噬激活Nrf2 通路，使其表達上調。所以本文推測氚水預處理通過激活Nrf2 通路，使細胞在面對后續高劑量X 射線照射時，可以更快清除胞內自由基，降低ROS 水平（ 如圖7 所示），減少DNA 損傷，促進細胞存活（如圖6 所示），增強了細胞對后續高劑量照射的抗性。因此，給我們的啟示，對于受到內照射的患者而言，由于存在著輻射適應性反應，可能不適用于放射性治療。

綜上，對于持續性氚水的照射方式，本文證明了氚水誘導肺癌細胞A549 的輻射適應性反應存在活度閾值，并且通過激活抗氧化途徑Nrf2 通路，可降低后續高劑量照射的輻射損傷，這為氚水的生物效應研究提供了重要的數據支撐。