植物雌激素大豆黃酮對小鼠乳腺上皮細胞乳成分合成和細胞增殖的影響及機制

摘 要： 本試驗旨在研究植物雌激素大豆黃酮（daidzein， DZ）對小鼠乳腺上皮細胞EpH4-Ev乳糖、乳蛋白、乳脂肪合成及細胞增殖的影響，探討相關的調節(jié)作用。首先用不同濃度DZ（0～1 000 μmol·L^-1）處理EpH4-Ev細胞6、12、24、48 h，通過檢測細胞活力確定DZ作用濃度及時間；試驗分為對照組（0 μmol·L^-1 DZ處理）、低濃度組（10 μmol·L^-1 DZ處理）、中濃度組（20 μmol·L^-1 DZ處理）、高濃度組（40 μmol·L^-1 DZ處理），并以生理劑量的雌二醇（E2）作為陽性對照，37 ℃、5%CO 2培養(yǎng)12 h后，進行如下試驗：1）測定細胞及分泌上清中甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）含量及脂滴染色變化；2）檢測細胞增殖與凋亡相關蛋白、乳成分合成相關蛋白的表達變化；3）檢測PI3K/AKT-mTOR信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平；4）流式細胞技術分析細胞凋亡率與細胞周期分布情況。結果顯示：1）與對照組相比，2.5～80.0 μmol·L^-1 "DZ處理后，細胞活力極顯著提高（Plt;0.01），其中20 μmol·L^-1 DZ處理提高效果最為顯著，結合實驗室前期結果，選擇DZ作用的低、中和高濃度分別為10、20和40 μmol·L^- 作用時間為12 h。2）與對照組相比，中濃度及高濃度組DZ及E2處理后極顯著提高了EpH4-Ev細胞及分泌上清中TG和GLU的含量，促進了脂滴的合成（P＜0.01）。3）與對照組相比，不同濃度DZ處理后葡萄糖轉運載體1（GLUT1）和β-酪蛋白（β-casein）的表達均極顯著升高（P＜0.01）；同時DZ及E2處理后均提高脂肪酸合成酶（FASN）、膽固醇調節(jié)元件結合蛋白1（SREBP1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的表達。4）與對照組相比，不同濃度DZ及E2處理后均增加了G2/M期和S期的細胞占比，上調了增殖細胞核抗原（PCNA）、細胞周期蛋白D1、D3、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量，同時中濃度DZ組極顯著增加了Bcl-2/Bax比值（P＜0.01），細胞凋亡率降低。5）三個濃度DZ及E2處理后均上調了PI3K/AKT-mTOR信號通路中p-PI3K、p-mTOR、p-AKT的磷酸化水平。結果表明：DZ處理可促進乳腺上皮細胞的增殖及乳成分的合成。其機制與上調細胞增殖蛋白的表達、降低細胞凋亡率，激活PI3K/AKT-mTOR通路有關。

關鍵詞： 植物雌激素；大豆黃酮；小鼠乳腺上皮細胞；乳成分合成；乳腺上皮細胞的增殖

中圖分類號： S857.26"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0417-13

收稿日期：2024-02-22

基金項目：國家自然科學基金（31972640）

作者簡介：黃心河（1999-），女，浙江常山人，碩士，主要從事動物機能生物化學研究，E-mail： 2021107033@stu.njau.edu.cn

*通信作者：張源淑，主要從事動物機能生物化學研究，E-mail： zhangyuanshu@njau.edu.cn

Effects and Mechanism on the Synthesis of Milk Components and Cell Proliferation in Mouse

Mammary Epithelial Cells by Phytoestrogen Daidzein

HUANG" Xinhe， LI" Haonan， ZHOU" Xiao， XU" Jiajing， ZHANG" Yuanshu*， HAN" Zhengkang

（Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry of Ministry of Agriculture and

Rural Affairs， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： "This study was to detect the effects of Daidzein （DZ） on the synthesis of lactose， milk protein， milk fat and cell proliferation of mouse mammary epithelial cells EpH4-Ev to investigate the associated regulatory roles. EpH4-Ev cells were treated with different concentrations of DZ （0 to 1 000 μmol·L^-1） for 6， 12， 24， 48 h and the concentration of DZ and time were determined by detecting cell viability; they were divided into a control group （0 μmol·L^-1 DZ treatment）， a low-concentration group （10 μmol·L^-1 DZ treatment）， a medium-concentration group （20 μmol·L^-1 DZ treatment）， and a high-concentration group （40 μmol·L^-1 DZ treatment）， and physiological dose of estradiol （E2） was used as a positive control， and the cells were incubated for 12 h at 37 ℃ and 5% CO 2 as follows experiments were performed： 1） Determination of triglyceride （TG） and glucose （GLU） content in cells and supernatants; 2） Cell proliferation and apoptosis-related proteins， milk component synthesis-related proteins and PI3K/AKT-mTOR signaling pathways were detected， and milk lipid synthesis was probed by combining with lipid droplet staining. The apoptosis rate and cell cycle distribution were analyzed by flow cytometry. The results showed that： 1） Compared with the control group， between 2.5-80.0 μmol·L^-1 DZ treatments could significantly improve the cell viability of EpH4-Ev cells （Plt;0.01）， and 20 μmol·L^-1 DZ treatment had the most significant improvement effect. Combined with the results of the pre-laboratory period， the low， medium and high concentrations of DZ action were selected to be 10， 20， and 40 μmol·L^-1. 2） Compared with the control group， medium and high concentration of DZ and E2 treatments significantly increased the content of TG and GLU in EpH4-Ev and supernatants and promoted the synthesis of lipid droplets （Plt;0.01）. 3） Compared with the control group， the expression of glucose transporter carrier 1 （GLUT1） and β-casein were both highly significantly elevated after treatment with different concentrations of DZ （Plt;0.01）; meanwhile， both DZ and E2 treatments increased the expression of fatty acid synthetase （FASN）， cholesterol regulatory element-binding protein 1 （SREBP1）， peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPAR-γ）， and acetyl coenzyme A carboxylase （ACC） expression. 4） Compared with the control group， the proportion of cells in G2/M phase and S phase， the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， cell cycle proteins D1 and D3 （CyclinD1 and D3）， and anti-apoptotic protein Bcl-2 were increased after treatment with different concentrations of DZ and E2， and the medium concentration of DZ group highly significantly increased the Bcl-2/Bax ratio （Plt;0.01） and decreased the apoptosis rate. 5） Compared with the control group， three concentrations of DZ and E2 treatment increased the phosphorylation levels of p-PI3K， p-mTOR， p-AKT and promoted the activation of the PI3K/AKT-mTOR signaling pathway. These results suggested that DZ can promote the proliferation of mammary epithelial cells and the synthesis of milk components. The mechanism is related to the up-regulation of the expression of cell proliferation proteins， the reduction of apoptosis rate， and the activation of PI3K/AKT-mTOR pathway.

Key words： phytoestrogen; daidzein; mouse mammary epithelial cells; milk component synthesis; mammary epithelial cell proliferation

*Corresponding author：" ZHANG Yuanshu， E-mail： zhangyuanshu@njau.edu.cn

乳腺是哺乳動物乳汁合成和分泌的場所，乳汁作為哺乳動物初生后代的主要營養(yǎng)來源，為后代的生長發(fā)育提供營養(yǎng)。乳腺上皮細胞（mammary epithelial cells， MECs）發(fā)揮分泌功能，使乳腺產生乳汁，其數(shù)量及分泌活性是影響乳腺泌乳量的重要因素之一。另外，乳腺上皮細胞的增殖和凋亡與泌乳和乳腺發(fā)育密切相關對乳汁生產至關重要^［1］。乳汁的主要成分為乳糖、乳脂和乳蛋白^［2］。乳糖是主要的能量來源，是影響乳產量高低的決定因素。乳脂含量是衡量乳品質的重要指標之一，其在乳汁能量分配方面也發(fā)揮著核心作用。乳蛋白包含機體大部分的必需氨基酸，同樣是衡量乳品質量的重要指標。乳成分和泌乳量作為衡量乳用動物生產性能和乳品質量的重要指標，直接影響著乳用動物的養(yǎng)殖經濟效益。乳腺是乳用動物泌乳的唯一場所，它的健康發(fā)育直接關系母畜后期泌乳的乳品質。對乳腺的泌乳及乳成分進行研究具有十分重要的意義。

有研究指出，雌激素可以通過刺激垂體前葉合成并釋放PRL，共同調控乳成分的合成^［3］。Chu等^［4］研究發(fā)現(xiàn)，17-β-雌二醇（17-β-estradiol， E2）通過調節(jié)脂質合成酶促進乳腺上皮細胞的脂質合成。Burgos等^［5］研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)基中添加催乳素（PRL）、雌激素（E）、胰島素和氫化可的松等能夠提高乳蛋白的合成量。Tucker等^［6］研究發(fā)現(xiàn)，一定量的雌激素可以刺激泌乳，而過量的雌激素會抑制泌乳。但是，雌激素在體內易殘留且有毒害作用，易導致乳腺發(fā)育不全，尋找雌激素的替代品是一個新的思路和方向。

植物雌激素是在各種植物來源中發(fā)現(xiàn)的類雌激素化合物，其中的大豆黃酮（daidzein， DZ）屬于異黃酮類植物雌激素，其結構與E2相似。有研究發(fā)現(xiàn)，其可以與雌激素受體相互作用，在體內發(fā)揮雌激素或抗雌激素活性^［7］。另有研究表明，DZ可與多種激素協(xié)同作用促進乳腺泌乳及酪蛋白的合成^［8］。謝娜娜等^［9］及本實驗室前期研究均發(fā)現(xiàn)DZ可促進乳腺上皮細胞的增殖和乳腺發(fā)育^［10］，顯示了DZ在調控乳腺發(fā)育方面的開發(fā)潛力。但至目前，關于DZ對乳成分合成的影響及機理方面的研究較少，所得的結果尚不一致。本試驗擬以DZ處理小鼠乳腺上皮細胞EpH4-Ev，研究DZ對EpH4-Ev乳成分合成及細胞增殖的影響，并通過PI3K/AKT-mTOR信號通路初步探討其作用機制，旨在為DZ調控乳成分合成提供理論數(shù)據(jù)資料，同時為進一步在乳用動物和奶業(yè)生產中植物雌激素大豆黃酮的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆黃酮（daidzein， DZ）由南京農業(yè)大學韓正康教授贈送（純度≥98%）；Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒購自上海陶術生化科技有限公司；細胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF均購自南京碧云天生物技術有限公司；甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）檢測試劑盒均購自南京建成科技有限公司；小鼠乳腺上皮細胞專用培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；細胞凋亡及細胞周期檢測試劑盒均購自上海翌圣生物科技公司；尼羅紅（Nile Red）染料購自MCE公司等。

細胞周期蛋白CyclinD1、CyclinD3、β-tubulin抗體均購自南京巴傲得生物科技有限公司；乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、Bax、Bcl-2、mTOR、p-mTOR抗體均購自Cell Signaling Technology公司；葡萄糖轉運載體1（GLUT1）、增殖細胞核抗原（PCNA）抗體均購自武漢三鷹公司；PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）、β-酪蛋白（β-casein）抗體均購自Immunoway公司；脂肪酸合成酶（FAS）抗體購自武漢賽維爾生物科技公司；膽固醇調節(jié)元件結合蛋白1（SREBP1）抗體、羊抗兔IgG購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。ECL顯色液、細胞凋亡與細胞周期試劑盒均購自翌圣生物科技公司等。

1.2 儀器與設備

POWER-PAC 300 電泳儀（BIO-RAD，美國）、POWER-PACHC 轉印儀（BIO-RAD，美國）、Tanon-3900 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海 Tanon 科技有限公司，中國）、Tecan Spark 多功能酶標儀（Tecan，瑞士）；EVOS M7000 倒置熒光顯微鏡（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）、BECKMAN-CytoFLEX流式細胞儀（BECKMAN，美國）等。

1.3 細胞及培養(yǎng)

小鼠乳腺上皮細胞（EpH4-Ev）來自于實驗室存種。常規(guī)法培養(yǎng)，使用專用培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO 2條件下傳代培養(yǎng)。所有細胞處理前均用未加胎牛血清的不完全培養(yǎng)基饑餓處理4 h。

1.4 試驗分組及細胞處理

1.4.1 CCK-8法檢測不同濃度DZ對乳腺上皮細胞活力的影響

參照謝娜娜等^［9］的方法，采用CCK-8法檢測乳腺上皮細胞活力。當96孔細胞培養(yǎng)板細胞長至80%左右，分別加入終濃度為0、2.5、5、10、20、40、80、160、1 000 μmol·L^-1的DZ處理細胞6、12、24、48 h，更換基礎培養(yǎng)基。每孔加入10 μL CCK-8試劑并置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標儀上測定各孔450 nm波長下的吸光度（OD）值，按以下公式計算：

細胞活力=（樣品孔吸光度-空白孔吸光度）÷（對照孔吸光度-空白孔吸光度）。

1.4.2 試驗分組

正常消化細胞制成懸液，均勻接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞長至80%左右，根據(jù)CCK-8試驗確定的作用條件，如表1進行分組與處理，37℃、5%CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。陽性對照組以E2處理，每組均設3個重復。

1.5 指標測定

1.5.1 細胞甘油三酯和葡萄糖含量的測定

6孔板細胞處理12 h后終止培養(yǎng)，收集細胞上清后，使用裂解液刮下細胞并超聲破碎。按甘油三酯和葡萄糖試劑盒說明書操作，分別在500及505 nm波長處測定OD值，按照說明書分別計算細胞上清及細胞內甘油三酯和葡萄糖的含量。

1.5.2 脂滴觀察與含量的測定

免疫熒光法檢測。具體取長至80%左右的細胞正常消化，制成細胞懸液，均勻鋪至96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長至70%左右，高、中、低三個濃度DZ處理12 h，每個濃度6個重復孔，處理結束后，每孔加入10 μL的尼羅紅染料，37℃，孵育10 min。孵育結束后，用PBS洗滌，之后熒光顯微鏡下觀察脂滴含量并結合Image J分析。

1.5.3 細胞增殖與凋亡、乳成分合成及PI3K/AKT-mTOR信號通路相關蛋白表達及磷酸化水平檢測

采用Western blot法測定。具體操作如下：6孔板細胞處理12 h后終止培養(yǎng)，加入預冷的蛋白裂解液，并用細胞刮刀刮取細胞。4 ℃ 12 000 g離心10 min，收集細胞上清，BCA法測定蛋白濃度，統(tǒng)一濃度后加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min制樣。每孔上樣10 μL，進行SDS-PAGE，然后濕轉法將目的蛋白轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗CyclinD1、CyclinD3、ACC、mTOR、p-mTOR、β-casein、GLUT1、PCNA、FASN、SREBP1、PPAR-γ、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（皆為1∶1 000稀釋）及β-tubulin（1∶10 000稀釋），抗體與蛋白條帶在4 ℃孵育過夜。次日TBST漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的1∶10 000羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h。洗滌后加入ECL發(fā)光液，全自動化學發(fā)光分析儀中檢測，Image J軟件分析各條帶灰度值。以β-tubulin為內參比較并計算各目的條帶相對灰度值。

1.5.4 流式細胞術檢測DZ對乳腺細胞凋亡的影響

參照Kumar和Chauhan^［11］的方法，流式細胞儀檢測各處理細胞中凋亡水平的變化。具體步驟如下：細胞消化后，4℃ 300 g離心5 min，收集細胞；用預冷的PBS洗滌細胞兩次，離心后收集細胞，用緩沖液重懸細胞。之后在每管細胞中加入染色工作液，室溫避光孵育15 min，再次用緩沖液重懸細胞后上機檢測。使用流式細胞儀和FlowJo_V10.0軟件檢測并分析細胞凋亡率和壞死率。

1.5.5 流式細胞術檢測細胞周期分布情況

細胞處理結束后，消化并收集細胞，用預冷PBS洗滌細胞兩次；棄去PBS，加入70%的預冷乙醇，4 ℃固定過夜；次日離心收集細胞，用PBS洗滌細胞后，加入PBS重懸細胞。之后加入2 μL的RNase A，37℃水浴30 min；再加入50 μL的碘化丙啶（PI）染色液，室溫避光孵育20 min后上機檢測，采用Modfit 5.0軟件分析細胞周期分布。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 21.0軟件進行方差分析（ANOVA），GraphPad Prism 8.0軟件作圖，試驗結果均以“平均值±標準誤（x-±s x-）”表示，Plt;0.05 表示差異顯著，Plt;0.01 表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 DZ對小鼠乳腺上皮細胞活力的影響

結果如圖1 所示，與對照組相比，2.5～160 μmol·L^-1的DZ處理EpH4-Ev細胞6、12、24 h均未引起細胞活力的顯著下降，表明此條件DZ對小鼠EpH4-Ev細胞的無毒副作用；同時在2.5～80 μmol·L^-1不同濃度DZ處理后，細胞活力均極顯著提高（Plt;0.01），而處理48 h各濃度DZ處理均極顯著降低了細胞活力（Plt;0.01）。綜合實驗室前期結果，本試驗選擇10、20及40 μmol·L^-1 DZ濃度分別作為低、中、高濃度用于后續(xù)試驗，處理時間選擇12 h。

2.2 DZ處理對小鼠乳腺上皮細胞甘油三酯含量的影響

結果如圖2所示，與對照組相比，DZ及E2處理后，EpH4-Ev分泌上清（圖2A）及細胞（圖2B）中的甘油三酯含量均有升高，中濃度和高濃度組極顯著升高（P＜0.01），且均高于E2處理組。

2.3 DZ處理對小鼠乳腺上皮細胞葡萄糖含量的影響

結果如圖3所示，與對照組相比，DZ及E2處理后各組細胞分泌上清及細胞中葡萄糖含量均極顯著升高（P＜0.01），且隨著DZ濃度提高，細胞中葡萄糖含量呈劑量依賴性升高。

2.4 DZ處理對小鼠乳腺上皮細胞脂滴合成的影響

結果如圖4所示，根據(jù)所拍攝的熒光圖，每組分別選取10個200倍放大的視野，利用Image J軟件計算每個視野中脂滴的數(shù)量，最后結果以統(tǒng)計圖的形式表示。乳脂可以脂滴的形式貯存起來，成份包括甘油三酯和膽固醇酯等。細胞脂滴染色情況結合脂滴光密度分析結果顯示，與對照組相比，DZ及E2處理后小鼠乳腺上皮細胞中脂滴亮度明顯提高且含量升高，中、高濃度DZ組脂滴含量極顯著升高（P＜0.01）。

2.5 DZ處理對小鼠乳腺上皮細胞乳成分合成相關蛋白表達的影響

結果如圖5A所示。葡萄糖轉運載體1作為小鼠乳腺中主要的葡萄糖轉運載體，能促進葡萄糖轉運入胞，進而合成乳糖。與對照組相比，DZ及E2處理后GLUT1的表達均極顯著升高（P＜0.01），且隨著DZ濃度的升高，其表達呈劑量依賴性提高。

β-酪蛋白作為乳蛋白中含量最多的一種蛋白，其表達情況反映了乳蛋白的合成情況。與對照組相比，DZ及E2處理后β-casein表達均極顯著升高（P＜0.01），且中濃度組最為顯著，隨DZ濃度的進一步升高，其表達開始降低（圖5B）。

乳脂合成相關蛋白FASN、ACC、SREBP1、PPAR-γ的表達結果見圖5C～F，DZ及E2處理后均提高了以上蛋白的表達，中濃度組極顯著提高了FASN、SREBP1、PPAR-γ的表達（P＜0.01），高濃度組極顯著提高了FASN、ACC、SREBP1的表達（P＜0.01）。

2.6 DZ處理對小鼠乳腺上皮細胞周期分布的影響

DZ處理對乳腺上皮細胞周期分布的變化結果如圖6所示。與對照組相比，各濃度DZ處理組及E2均降低了G0/G1期細胞占比，增加了S期和G2/M期細胞比例。其中低濃度及高濃度組均極顯著降低了G0/G1期細胞占比（Plt;0.01），極顯著增加S期比例（Plt;0.01）；中濃度組顯著增加G2/M期細胞占比（Plt;0.05）。E2組與中濃度組具有相同趨勢，但對G2/M期細胞比例的增加未達到顯著水平（Pgt;0.05）。

2.7 DZ處理對小鼠乳腺上皮細胞凋亡率的影響

DZ處理對乳腺上皮細胞凋亡率的變化結果如圖7所示。Q1區(qū)（Annexin V-FITC）-/ PI+ 此區(qū)域為壞死細胞；Q2區(qū)（Annexin V-FITC）+/PI+ 此區(qū)域為晚期凋亡細胞；Q3區(qū)（Annexin V-FITC）+/PI- 此區(qū)域為早期凋亡細胞；Q4區(qū)（Annexin V-FITC）-/PI- 此區(qū)域為活細胞。Q2區(qū)與Q3區(qū)所占百分比表示細胞凋亡水平的變化。

與對照組相比，低濃度組DZ與E2組極顯著或顯著降低了細胞凋亡率（P＜0.01或 P＜0.05），中濃度組降低了凋亡率但差異不顯著（P＞0.05），而高濃度組極顯著提高了細胞的凋亡率（P＜0.01），促進細胞的凋亡。

2.8 DZ處理對小鼠乳腺上皮細胞增殖與凋亡相關蛋白表達的影響

結果如圖8所示，與對照組相比，DZ及E2處理后均提高了增殖相關蛋白的表達，其中不同濃度DZ及E2處理后均極顯著提高了PCNA蛋白的表達（P＜0.01）；低濃度與中濃度組DZ及E2處理顯著或極顯著提高了細胞周期蛋白D1、D3的表達（P＜0.05或P＜0.01），高濃度組DZ處理后同樣上調了兩者的表達，但差異不顯著（P＞0.05）。

與對照組相比，DZ及E2處理后均提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，中濃度組DZ顯著上調（P＜0.05）；高濃度組DZ與E2處理后極顯著提高了凋亡蛋白Bax的表達（P＜0.01）；中濃度組極顯著增加了Bcl-2/Bax比值（P＜0.01），高濃度組及E2組極顯著降低了Bcl-2/Bax比值（P＜0.01）。

2.9 DZ處理對小鼠乳腺上皮細胞PI3K/AKT-mTOR信號通路相關蛋白磷酸化水平的影響

結果如圖9所示，與對照組相比，三個濃度DZ處理均極顯著增加了p-AKT的磷酸化水平（P＜0.01），不同濃度DZ及E2處理后同樣增加了p-PI3K和p-mTOR蛋白磷酸化水平，其中低濃度、中濃度組及E2處理組極顯著促進了p-PI3K蛋白的磷酸化（P＜0.01）；中、高濃度組及E2處理組極顯著促進了p-mTOR蛋白的磷酸化（P＜0.01）。以上結果表明，中濃度組DZ極顯著激活了PI3K-AKT-mTOR信號通路。

3 討 論

3.1 DZ對小鼠乳腺上皮細胞增殖與凋亡的影響

細胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎。乳腺發(fā)育過程中，細胞增殖與分化對乳腺組織的生長和泌乳均發(fā)揮了重要調控作用。乳腺上皮細胞的數(shù)量與泌乳量密切相關，促進乳腺上皮細胞的增殖可以增加泌乳量^［2］。細胞周期蛋白D1、D3（Cyclin D1、D3）和增殖細胞核抗原（PCNA）作為細胞增殖標志物，在調控細胞增殖中發(fā)揮重要作用^［12］。Cyclin D是有絲分裂的重要傳感器，可通過與細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4或CDK6結合，控制G1、G1/S期的轉換，從而啟動DNA復制^［13］。其中Cyclin D1、Cyclin D3是Cyclin D的兩個重要亞型，是調節(jié)細胞周期G1-S期進程的關鍵周期蛋白。細胞增殖抗原PCNA是一種在DNA損傷和修復中起主要作用的核蛋白。

有研究發(fā)現(xiàn)PCNA在S期表達顯著增加，可作為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，促進DNA復制^［14］。另有研究發(fā)現(xiàn)雌激素E2在哺乳動物乳腺發(fā)育過程中具有重要作用，可調節(jié)導管形態(tài)發(fā)生，促進乳腺上皮細胞增殖^［15］。DZ作為植物雌激素，具有相似的促進細胞增殖作用。劉春龍等^［10］發(fā)現(xiàn)，DZ在一定濃度范圍內顯著促進奶牛乳腺上皮細胞增殖。異黃酮類植物雌激素可通過影響細胞周期相關蛋白信號通路來影響乳腺的發(fā)育^［16］。研究發(fā)現(xiàn)DZ可通過上調Cyclin D1蛋白的表達并增加G2/M期細胞占比從而促進乳腺上皮細胞的增殖^［9，17］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，DZ處理后提高了小鼠乳腺上皮細胞中Cyclin D1、D3、PCNA蛋白的表達量，同時提高了G2/M期和S期細胞的占比，促進乳腺上皮細胞的增殖，與以往研究結果一致，提示著DZ處理可促進小鼠乳腺上皮細胞增殖。

細胞的增殖和凋亡是一個動態(tài)平衡的過程。Bcl-2相關蛋白是影響細胞凋亡的細胞內信號介導者，抗凋亡Bcl-2基因缺乏會加速細胞凋亡，促凋亡Bax基因缺失會延緩乳腺的退化^［18］。在細胞內Bcl-2和Bax蛋白之間是相互拮抗的，細胞凋亡由Bcl-2/Bax比率的變化調節(jié)^［19］。因此，通常用Bcl-2/Bax比值來檢測細胞凋亡效應。Kumar和Chauhan^［11］研究發(fā)現(xiàn)，DZ可通過介導細胞凋亡的內在途徑影響B(tài)ax/Bcl-2蛋白的表達。本研究結果顯示，中濃度DZ處理后顯著上調了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，降低了凋亡蛋白Bax的表達，極顯著增加了Bcl-2/Bax比值。同時經過流式細胞術檢測 Annexin V 凋亡細胞所占百分比，發(fā)現(xiàn)中濃度的DZ可降低乳腺上皮細胞的凋亡率，促進細胞存活。綜上結果表明，中濃度DZ 可有效抑制乳腺上皮細胞凋亡，促進乳腺上皮細胞增殖。

3.2 DZ對小鼠乳腺上皮細胞乳成分合成的影響

乳汁作為哺乳動物初生幼仔的主要營養(yǎng)來源，可以為幼仔提供必要的營養(yǎng)和具有生物活性的化合物，促進幼仔的生長發(fā)育，并增強機體免疫力^［20］。各種哺乳動物乳汁中都包含蛋白質、脂肪、乳糖、無機鹽和維生素等^［2］。乳汁中的蛋白質主要為酪蛋白（casein），占比高達80%，包括αS、β、γ和κ等不同表型^［21］。其中β-casein是乳中主要的酪蛋白，可通過檢測酪蛋白的表達量來判斷乳腺細胞的乳蛋白合成能力^［2］ 。Tsugami等^［22］研究發(fā)現(xiàn)異黃酮及其代謝物可以促進乳腺上皮細胞表達和分泌酪蛋白。本研究結果顯示不同濃度DZ處理后均極顯著提高了小鼠乳腺上皮細胞中β-casein蛋白的表達，其中以中濃度DZ影響效果最為顯著。

乳糖作為乳汁中重要的組成成分，是控制乳汁體積的關鍵，Shahbazkia等^［23］研究發(fā)現(xiàn)乳糖合成水平與泌乳量、乳蛋白以及總固形物產量正相關。乳糖的生物合成主要在乳腺上皮細胞中的高爾基體內進行，以葡萄糖作為乳糖合成的主要前體物，能夠為乳糖提供80%～85%的碳源^［24］。由于乳腺內缺少葡萄糖-6-磷酸酶，不能通過糖異生合成葡萄糖，乳腺內所需的葡萄糖主要從細胞外攝取。GLUT1是小鼠乳腺中主要的葡萄糖轉運載體，當GLUT1表達下調時，會導致用于合成乳糖的葡萄糖利用率降低^［25］。本研究發(fā)現(xiàn)DZ處理后極顯著提高了小鼠乳腺上皮細胞中及細胞分泌的葡萄糖的含量，同時極顯著提高了GLUT1蛋白的表達，提示：DZ對乳腺上皮細胞轉運及利用葡萄糖具有促進作用，從而促進乳糖的合成。

脂類為乳中重要營養(yǎng)成分之一，其主要成分為甘油三酯（triglyceride， TG），在乳脂中質量百分比約占98%。甘油和葡萄糖代謝途徑中產生的脂肪酸合成甘油三酯，隨后在內質網中形成脂滴，在脂質包裹下釋放入腺泡腔中，乳脂主要以與膜結合的小球形式存在^［2］。甘油三酯在很大程度上決定了乳脂的合成量，因此常用作乳脂含量的指標。在乳脂合成和分泌過程中，涉及許多基因的表達調控，其中PPAR γ和SREBP1是乳脂合成相關基因網絡中關鍵的轉錄調控因子。研究表明，激活的SREBP1可通過結合脂肪酸合成酶ACC、FAS等基因的應答元件，從而激活脂肪生成基因的轉錄以及乳腺上皮細胞中脂肪酸從頭合成和三?；视头e累，促進乳脂合成^［26-27］ 。PPAR γ作為乳脂合成的正調節(jié)因子，在乳成分合成過程中，能增加乳腺上皮細胞內TG的含量^［28］，同時通過調節(jié)乳腺中生脂相關基因的表達及SREBP1的表達繼而促進乳脂的合成^［29-30］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，DZ處理后顯著提高了乳腺上皮細胞內及細胞分泌的甘油三酯的含量及脂滴含量，同時上調了乳脂合成相關蛋白ACC、FASN、SREBP1、PPAR-γ的表達，提示DZ具有促進乳脂合成的作用，且這種作用與PPAR γ和SREBP1的激活有關。

3.3 DZ對PI3K/AKT-mTOR信號通路的影響

PI3K/AKT-mTOR信號通路參與細胞存活、生長增殖和組織器官的形成等多種生命進程。AKT被PI3K激活并發(fā)生磷酸化后，可作用于mTOR信號轉導調節(jié)細胞生長；同時通過激活并磷酸化CDK的抑制劑p21和p27，進而影響細胞增殖。此外AKT是細胞存活的主要調節(jié)因子，通過直接抑制促凋亡蛋白（如Bad）或抑制轉錄因子（如FoxO1）產生促凋亡的信號實現(xiàn)調節(jié)^［31］。研究發(fā)現(xiàn)過表達 AKT可促進乳腺癌細胞的增殖^［32］。在乳腺上皮細胞中該信號通路主要調節(jié)乳腺上皮細胞的增殖與生長^［33］，此外研究發(fā)現(xiàn)該通路可調控乳蛋白合成相關基因的表達，同時參與乳脂合成的調控過程，提高乳脂合成信號通路的轉導^［34］。此外，該信號通路還涉及到乳糖合成相關基因的表達調控。研究發(fā)現(xiàn)SIRT7可調控奶牛乳腺上皮細胞中乳蛋白、乳脂和乳糖合成的關鍵基因表達，而這些調控作用可能與PI3K/AKT-mTOR信號通路有關^［28］。Yu等^［17］研究發(fā)現(xiàn)DZ可通過NFκB1激活來增強mTOR-CyclinD1-SREBP-1c信號通路，從而促進乳汁合成和奶牛乳腺上皮細胞的增殖。謝娜娜等^［9］研究發(fā)現(xiàn)，DZ可通過激活PI3K-GSK3β-AKT信號通路來促進牛乳腺上皮細胞的增殖。另有研究表明，DZ可通過激活PI3K/AKT信號通路促進細胞增殖^［35］。目前關于DZ、PI3K/AKT-mTOR信號通路及乳成分合成三者之間的研究較少，多集中于DZ與該通路在乳腺癌的防治研究中。本研究結果發(fā)現(xiàn)，不同濃度DZ及E2處理后均增加p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白磷酸化水平，激活PI3K-AKT-mTOR 信號通路，其中以中濃度（20 μmol·L^-1）DZ效果最為顯著；同時DZ處理后乳脂乳糖乳蛋白等乳成分的合成均在增加，猜測DZ可能是通過激活PI3K/AKT-mTOR通路來促進乳成分合成。

4 結 論

植物雌激素DZ可通過激活PI3K/AKT-mTOR信號通路促進小鼠EpH4-Ev乳腺上皮細胞的增殖、乳蛋白及乳脂的合成，可促進葡萄糖轉運入胞及利用，共同促進乳成分合成。以20 μmol·L^-1 DZ濃度時，效果較好。

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（編輯 白永平）