基于宏基因組的西藏拉魯濕地原生生物多樣性研究

摘要：探究拉魯濕地原生生物群落結(jié)構(gòu)特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系，為生物資源保護(hù)及水環(huán)境保護(hù)提供資料。2020年8—9月在拉魯濕地10個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行環(huán)境DNA樣品采集和水環(huán)境因子的測(cè)定，并基于宏基因組技術(shù)，鑒定了拉魯濕地原生生物的種類和群落結(jié)構(gòu)，考察了影響拉魯濕地原生生物多樣性的環(huán)境因素。主要結(jié)果如下：（1）拉魯濕地原生生物共鑒定421個(gè)OTUs，隸屬于21門(mén)35綱84目105科140屬，其中裸藻門(mén)、纖毛門(mén)和絲足蟲(chóng)門(mén)種類最多，絲足蟲(chóng)門(mén)、硅藻門(mén)和纖毛門(mén)豐度最高；（2）拉魯濕地不同區(qū)域原生生物多樣性存在顯著差異，源頭處生物多樣性高，各類群分布較均勻；濕地內(nèi)部生物多樣性也處于較高水平，主要為絲足蟲(chóng)門(mén)和硅藻門(mén)；下游生物多樣性較低，主要為絲足蟲(chóng)門(mén)和纖毛門(mén)；（3）拉魯濕地原生生物多樣性受到多種水環(huán)境因子的影響，水體富營(yíng)養(yǎng)化程度高的區(qū)域原生生物多樣性相對(duì)低。不同類群原生生物與環(huán)境因子呈以下相關(guān)性：裸藻門(mén)與總磷、總氮和濁度呈正相關(guān)，硅藻則與總磷和總氮呈負(fù)相關(guān)，纖毛門(mén)與總磷和酸堿度呈正相關(guān)，絲足蟲(chóng)門(mén)與水中溶氧和酸堿度呈明顯負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：原生生物；生物多樣性；宏基因組測(cè)序；拉魯濕地

中圖分類號(hào)：Q178" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " 文章編號(hào)：1674-3075（2025）01-0081-09

原生生物（Protist）是一大類單細(xì)胞真核生物，其生命周期短、繁殖快，對(duì)水環(huán)境的變化極為敏感，是水環(huán)境變化重要的指示生物之一（沈韞芬，1999）。原生生物包括真核藻類和原生動(dòng)物，既有生產(chǎn)者，也有消費(fèi)者和分解者，在水生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈（網(wǎng)）中占有重要地位，在物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中發(fā)揮著極其重要的作用（Pokarzhevskii et al，2003；Jiao et al，2010）。而且，部分原生生物以水體中的碎屑或腐殖質(zhì)為食，具有凈化水體的重要功能，是生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的一環(huán)（沈韞芬，1990；沈韞芬等，1997）。但是由于其個(gè)體小、種類多，因此形態(tài)學(xué)鑒定容易忽視和錯(cuò)漏這部分類群，導(dǎo)致原生生物多樣性被低估（Fenchel amp; J?rgensen，1977；Keeling amp; Campo，2017）。

高通量測(cè)序具有數(shù)據(jù)量大，準(zhǔn)確度高，對(duì)物種識(shí)別靈敏等特點(diǎn)（Jiang et al，2021；Zhang et al，2022），應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)原生生物群落進(jìn)行系統(tǒng)研究越來(lái)越普遍（Boscaro et al，2017；Forster et al，2019；Schroeder et al，2020；姜傳奇等，2021；羅帥等，2022）。高通量測(cè)序技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于生物多樣性研究，主要方法為宏基因組和擴(kuò)增子測(cè)序，但是擴(kuò)增子測(cè)序過(guò)程中存在明顯擴(kuò)增偏好性，甚至可能存在擴(kuò)增錯(cuò)誤，因此，宏基因組技術(shù)對(duì)生物多樣性進(jìn)行研究有著較好的優(yōu)勢(shì)。宏基因組技術(shù)通過(guò)對(duì)樣品中的全部基因進(jìn)行提取和測(cè)序，能夠全面地、廣泛地獲取樣品中絕大多數(shù)種類原生生物的序列。基于宏基因組測(cè)序，研究原生生物群落特征，能夠探明原生生物之間群落結(jié)構(gòu)，了解不同類群的相互作用，對(duì)探究原生生物的環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制及對(duì)水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)具有重要意義（熊杰等，2019；劉斌等，2022）。

西藏拉魯濕地是世界上海拔最高、面積最大的高山城市天然濕地，在維持拉薩市的生態(tài)平衡、增加空氣濕度、改善城市氣候、保持生物多樣性等方面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用（王佳俊等，2020；周生靈等，2020；秦衛(wèi)華等，2022），它同時(shí)還扮演著天然牧場(chǎng)的角色，滿足周邊社區(qū)群眾牧業(yè)發(fā)展的需求。然而隨著拉薩市城市建設(shè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，拉魯濕地面積逐漸縮小，嚴(yán)重影響了拉魯濕地生態(tài)功能（黃薇和陳敘圖，2008；李佳伶等，2012）。依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，拉魯濕地原生動(dòng)物共255種，隸屬于3亞門(mén)8綱28目79科113屬（巴桑等，2012；巴桑，2013），但是，這些研究中原生生物多樣性仍舊被低估（Fu et al，2020；Jiang et al，2021）。為探究拉魯濕地原生生物群落結(jié)構(gòu)特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系，本研究基于宏基因組測(cè)序，對(duì)拉魯濕地原生生物物種多樣性、群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測(cè)，并系統(tǒng)分析了其與水環(huán)境因子的相關(guān)性，旨在為該區(qū)域生物資源保護(hù)及水環(huán)境保護(hù)提供資料，進(jìn)而為該區(qū)域生物多樣性的保護(hù)提供依據(jù)。

1" "材料與方法

1.1" "研究區(qū)域概況

拉魯濕地位于我國(guó)西藏自治區(qū)拉薩市的西北部，地理坐標(biāo)東經(jīng)91°03′41″～91°06′48″，北緯29°39′25″～29°42′08″，是世界上海拔最高、面積最大的城市天然濕地。拉魯濕地總體呈東西帶狀分布，地勢(shì)東北高西南低，水流整體以東北—西南的方向穿過(guò)濕地系統(tǒng)，從西南方向流出。濕地平均海拔高度為3 645 m，早期面積為12.2 km2，由于城市建設(shè)、沙石和泥炭采集、過(guò)度放牧等原因造成濕地面積縮小至6.2 km2（巴桑，2013）。拉魯濕地屬于高原溫帶半干旱季風(fēng)氣候，是典型的高寒草甸沼澤濕地。奪底溝和娘熱溝兩大水系、天然降水以及納金電站的尾水為濕地主要補(bǔ)給水源。濕地以沼澤和草甸為主，其次是荒漠。土壤類型以腐泥濕地土、泥炭濕地土和泥炭土為主，屬蘆葦泥炭濕地（孫晶，2022）。

1.2" "采樣點(diǎn)設(shè)置

根據(jù)濕地的地勢(shì)、水文特點(diǎn)及其水系分布情況，在拉魯濕地共設(shè)置10個(gè)采樣點(diǎn)（S1～S10），濕地上游源頭2個(gè)采樣點(diǎn)（S1、S2），濕地內(nèi)部6個(gè)采樣點(diǎn)（S3～S8），濕地下游2個(gè)采樣點(diǎn)（S9、S10）（圖1）。其中，S3為濕地北干渠入水口，S6為濕地中干渠出水口。

1.3" "樣品采集

2020年8—9月進(jìn)行環(huán)境DNA樣品采集，步驟為：（1）采集采樣點(diǎn)表層（約10～20 cm水深）原位水約5 L，先用200 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾以去除水體中不可溶性雜質(zhì)及其他大型生物個(gè)體，包括水生植物（組織）和其他碎屑等，然后將過(guò)濾后的原位水收集至5 L的水袋中，當(dāng)天進(jìn)行抽濾處理；（2）取1 L經(jīng)過(guò)處理的原位水，通過(guò)真空抽濾裝置，將水樣中DNA抽濾至4張0.22 μm PC膜（Millipore，USA）上，折疊后放置于錫箔紙中，并立即置于干燥劑中干燥保存（王月等，2022），用于下一步DNA提取，重復(fù)3次作為平行；（3）DNA樣品濾膜冷鏈運(yùn)輸至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序。

采集水環(huán)境樣品的同時(shí)，測(cè)定一部分水環(huán)境因子，具體方法為：水溫（T）、水體酸堿度（pH）、溶解氧（DO）等用便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀（Hach，HQ40D，美國(guó)）現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定；濁度（TUR）使用透明度盤(pán)（SD30，中國(guó)）在采樣現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行測(cè)定；總氮（TN）、總磷（TP）測(cè)定參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì)，2002）于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)定完成。

1.4" "樣品檢測(cè)

環(huán)境DNA采用CTAB方法進(jìn)行提取，取適量DNA樣品加入到CTAB裂解液，然后抽提除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，最后分離出環(huán)境DNA。環(huán)境DNA純度和濃度用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格的DNA使用M220聚焦超聲儀破碎成大約300 bp的片段，構(gòu)建文庫(kù)，并基于Illumina Hiseq 4000進(jìn)行宏基因組測(cè)序。本研究原始序列數(shù)據(jù)已保存在中國(guó)國(guó)家生物信息中心/中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所（項(xiàng)目號(hào)：PRJCA013256）國(guó)家基因組數(shù)據(jù)中心，可在以下網(wǎng)址對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行公開(kāi)訪問(wèn)：https：//ngdc.cncb.ac.cn/gsa。

1.5" "數(shù)據(jù)分析

首先用fastQC（v0.11.9）對(duì)測(cè)序所得的原始序列進(jìn)行質(zhì)控，用Fastx trimmer（v0.0.14）對(duì)低質(zhì)量堿基進(jìn)行移除，后通過(guò)BLASTN（v2.6.0+）（Altschul et al，1990）將經(jīng)過(guò)質(zhì)控的數(shù)據(jù)比對(duì)至SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)設(shè)置e值閾值為1×10-5，篩選出與rDNA相關(guān)的讀段（reads）進(jìn)行后續(xù)分析。然后使用MEGAHIT（v1.1.3）（Li et al，2015）對(duì)篩選的reads進(jìn)行組裝，得到rDNA疊連群（contigs）。對(duì)組裝得到的rDNA contigs使用nhmmer（v3.1b2）（Wheeler amp; Eddy，2013）與已有的16S/18S hmmfile進(jìn)行比對(duì)，篩選出16S和18S rDNA的contigs并截取其比對(duì)上hmmfile的片段，這些片段再使用cd-HIT（v4.7）（Li amp; Godzik，2006）進(jìn)行97%相似度聚類后，將最終得到聚類后的rDNA參考序列用于物種注釋。有研究表明，只通過(guò)比對(duì)SLIVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)18S rDNA序列進(jìn)行物種注釋時(shí)，其注釋結(jié)果會(huì)存在誤差（羅帥等，2022），因此，本研究采用與SILVA（https：//www.arb-silva.de/）（Quast et al，2013；Yilmaz et al，2014；Gl?ckner et al，2017）、PR2（https：//github.com/vaulot/pr2_database）（Guillou et al，2013）和NCBI nt（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）（Benson et al，2013）等3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（以上數(shù)據(jù)分析得到中國(guó)科學(xué)院超級(jí)計(jì)算武漢分中心支持），依據(jù)序列一致性和覆蓋度進(jìn)行注釋結(jié)果的篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）依據(jù)序列一致性和覆蓋度對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選，優(yōu)先選取序列一致性較高的注釋結(jié)果，其次比較覆蓋度；（2）如3個(gè)庫(kù)注釋結(jié)果不一致，而序列一致性與覆蓋度均相近，則選取多庫(kù)注釋支持的結(jié)果；（3）如比對(duì)SILVA庫(kù)的注釋結(jié)果只注釋到了較高的階元，但未明確注釋到下一級(jí)階元的，而與其他庫(kù)的比對(duì)結(jié)果在與其較高階元注釋結(jié)果相同時(shí)，選取注釋到最低階元的注釋結(jié)果。使用Bwa（v0.7.17-r1188）將rDNA reads比對(duì)至rDNA參考序列，比對(duì)結(jié)果使用featureCounts（v1.6.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，去除reads數(shù)目低于10的OTUs（operational taxonomic units），并用RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）的方式對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到OTUs豐度表。

利用R軟件（4.0.3）Vegan包計(jì)算豐富度指數(shù)（Richness）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Simpson）等多樣性指數(shù)，進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）。利用R軟件的vegan、psych、microeco（Liu et al，2021）和pheatmap等軟件包進(jìn)行冗余分析和相關(guān)性分析。

2" "結(jié)果與分析

2.1" "原生生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)

對(duì)拉魯濕地10個(gè)樣點(diǎn)的水環(huán)境樣品進(jìn)行了宏基因組測(cè)序，共測(cè)得894 G數(shù)據(jù)，經(jīng)組裝分析共提取到7 444條rDNA contigs，經(jīng)過(guò)97%相似性聚類后，共生成6 109個(gè)OTUs，其中，真核生物占比11.4%，即681個(gè)OTUs被注釋為真核生物，分別為原生生物421個(gè)OTUs，其他真核生物260個(gè)OTUs。根據(jù)原生生物OTUs豐度表作了稀釋曲線（圖2），在reads數(shù)目達(dá)到5 000時(shí)，曲線基本趨于平緩，后續(xù)reads數(shù)目的增加僅能產(chǎn)生極少量新的OTU，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，能夠較好地代表拉魯濕地原生生物類群，可用于進(jìn)一步分析。421個(gè)原生生物OTUs隸屬于21門(mén)，其中OTUs數(shù)目占比大于2%的優(yōu)勢(shì)門(mén)類共有14個(gè)，前5依次為裸藻門(mén)（16%）、纖毛門(mén)（14%）、絲足蟲(chóng)門(mén)（11%）、硅藻門(mén)（9%）、綠藻門(mén)（7%），5個(gè)類群的OTUs數(shù)目合計(jì)超過(guò)全部OTUs數(shù)目的50%；OTUs豐度占比大于1%的優(yōu)勢(shì)門(mén)類有13個(gè)，前5依次為絲足蟲(chóng)門(mén)（18%）、硅藻門(mén)（15%）、纖毛門(mén)（13%）、綠藻門(mén)（11%）、裸藻門(mén)（10%），5個(gè)類群的OTUs相對(duì)豐度合計(jì)超過(guò)全部OTUs數(shù)目的50%。

為了探究拉魯濕地各個(gè)樣點(diǎn)間原生生物群落組成差異，對(duì)各個(gè)樣點(diǎn)的原生生物在門(mén)類水平的相對(duì)豐度進(jìn)行展示，結(jié)果見(jiàn)圖3，在S3、S9和S10有明顯的優(yōu)勢(shì)類群，S3和S9以絲足蟲(chóng)門(mén)為主，S10以纖毛門(mén)為主，這3個(gè)樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)類群豐度均超過(guò)25%，其他各個(gè)樣點(diǎn)物種組成相對(duì)均勻，以絲足蟲(chóng)門(mén)、硅藻門(mén)、纖毛門(mén)、綠藻門(mén)和裸藻門(mén)為主。

對(duì)拉魯濕地原生生物α多樣性指數(shù)進(jìn)行差異分析（圖4），在豐度方面，為（S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S10）gt;（S8、S9），在香農(nóng)指數(shù)方面，為（S4、S5、S6、S7）≥（S1、S2、S8）≥S10≥（S3、S9），在辛普森指數(shù)方面，為（S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8）≥S10≥（S3、S9），綜合豐度、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)，在拉魯濕地的10個(gè)樣點(diǎn)中，S3和S9物種多樣性較低，S10物種多樣性處于中等偏下水平，其他樣點(diǎn)間物種多樣性無(wú)顯著差異，均處于較高水平。

對(duì)α多樣性指數(shù)與環(huán)境因子進(jìn)行線性回歸分析（圖5），物種豐富度和溫度呈顯著負(fù)相關(guān)，香農(nóng)指數(shù)和溶氧呈顯著正相關(guān)，辛普森指數(shù)和溶氧呈顯著正相關(guān)。多樣性指數(shù)與其他環(huán)境因子無(wú)顯著相關(guān)性，表明拉魯濕地原生生物α多樣性主要受溫度和溶解氧的影響。

在本研究中，對(duì)拉魯濕地10個(gè)樣點(diǎn)的原生生物群落基于Bray-Curtis距離進(jìn)行PCoA（圖6），拉魯濕地各個(gè)樣點(diǎn)之間原生生物群落存在空間分布差異，S10與其他樣點(diǎn)均存在較大差異，獨(dú)立地聚為一類，S3和S9兩個(gè)樣點(diǎn)之間的差異相較于與其他樣點(diǎn)的差異要小，聚類距離相對(duì)接近，S1和S2兩個(gè)樣點(diǎn)聚類距離較近，且與S4、S5、S6、S7和S8樣點(diǎn)聚類距離都較為接近，與其他樣點(diǎn)相比相對(duì)差異要小。

2.2" "水環(huán)境因子

各樣點(diǎn)水環(huán)境理化因子數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。水溫11.7～24.6 ℃；pH為7.58～10.21，總體呈現(xiàn)弱堿性，個(gè)別樣點(diǎn)pH大于9；DO為2.11～7.61 mg/L，在源頭2個(gè)樣點(diǎn)S1和S2都處于相對(duì)較高水平，至拉魯濕地入水口處，DO含量降低，在濕地內(nèi)部S5、S7和S8處DO含量上升至與源頭持平，在下游S9和S10降至最低；TP為0.05～0.48 mg/L，S9和S10的TP含量較高，均值為0.23 mg/L，拉魯濕地其他樣點(diǎn)絕大多數(shù)低于這個(gè)值，但是在S5出現(xiàn)了明顯的異常，達(dá)到了0.48 mg/L；TN為0.34～1.37 mg/L，在拉魯濕地10個(gè)樣點(diǎn)中，源頭處的TN處于中等水平，平均值為0.75 mg/L，進(jìn)入濕地后，TN含量下降，但在S7和S8出現(xiàn)反彈，分別為1.38和0.76 mg/L，在S9和S10，TN含量達(dá)到峰值，為2.63和2.69 mg/L；TUR為3.20～15.90 NTU。

2.3" "原生生物群落與環(huán)境因子的關(guān)系

對(duì)拉魯濕地相對(duì)豐度占比大于1%的13個(gè)類群與水環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析（redundancy analysis，RDA）和Spearman秩相關(guān)性分析。對(duì)與生物類群顯著相關(guān)的環(huán)境因子作了RDA分析（圖7a），結(jié)果顯示，各個(gè)樣點(diǎn)原生生物受到不同環(huán)境因子的影響程度不同，其中，S1、S2、S5、S6和S7樣點(diǎn)的原生生物受水中DO影響較大，與水中溶氧量呈正相關(guān)，與TN呈負(fù)相關(guān)，S1和S2還與T呈負(fù)相關(guān)；S3、S9和S10的原生生物則主要受TN和DO的影響，與TN呈正相關(guān)，與DO呈負(fù)相關(guān)；S8的原生生物受到T、TN和DO等多種因子的共同影響，與DO和T呈正相關(guān)，與TN呈負(fù)相關(guān)。對(duì)不同類群原生生物與水環(huán)境因子作Spearman秩相關(guān)分析（圖7b），結(jié)果顯示，金藻和隱藻與DO濃度呈顯著正相關(guān)，絲足蟲(chóng)門(mén)與水中DO和pH呈顯著負(fù)相關(guān)，裸藻門(mén)與T呈顯著正相關(guān)，多鞭毛蟲(chóng)門(mén)則與TUR呈顯著正相關(guān)，與DO呈顯著負(fù)相關(guān)。

3" "討論

3.1" "原生生物分布特征

本研究共鑒定到421個(gè)原生生物OTUs，隸屬于21門(mén)35綱84目105科140屬。此前巴桑（2013）在拉魯濕地共鑒定原生動(dòng)物255種，與之相比，本研究基于宏基因組方法能更好地覆蓋原生動(dòng)物多樣性（羅帥等，2022），如本研究檢測(cè)到了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)難以進(jìn)行鑒定觀察的類群（如急游蟲(chóng)等）。鑒定到的類群中以絲足蟲(chóng)為主，可能是由于采樣點(diǎn)水淺、流速快等原因，部分底質(zhì)懸浮于水體，導(dǎo)致底質(zhì)中絲足蟲(chóng)在水體中被采集檢測(cè)出來(lái)。拉魯濕地不同區(qū)域的原生生物多樣性存在差異。濕地源頭的原生生物多樣性高于濕地入水口，濕地源頭娘熱溝和奪底溝兩處水系水源清潔，由于位置遠(yuǎn)離居民區(qū)，沒(méi)有人為干擾，因此原生生物多樣性較高；濕地入水口處的水主要來(lái)自娘熱溝和奪底溝兩大水系的水、納金電站的尾水以及從拉薩河引入的部分水，受家畜和人為干擾較小，存在一定污染，但程度較輕，入水口處綠色植物相較于濕地內(nèi)部要少，水中含氧量較低，因此原生生物多樣性也偏低；在水流進(jìn)入濕地內(nèi)部后，經(jīng)過(guò)濕地的凈化作用（陳小彎等，2022；劉倩等，2022），水體質(zhì)量得到改善，水中原生生物多樣性有所提升，濕地內(nèi)部各個(gè)樣點(diǎn)原生生物多樣性均高于濕地入水口；水流離開(kāi)濕地后會(huì)經(jīng)過(guò)拉薩城區(qū)，經(jīng)過(guò)城區(qū)流到濕地下游干渠后，受到部分工業(yè)廢水和居民生活廢水的污染，原生生物多樣性又有所降低。

3.2" "環(huán)境因子對(duì)原生生物群落結(jié)構(gòu)的影響

原生生物群落結(jié)構(gòu)一般受多種環(huán)境因子影響，在不同生境中，影響群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子也存在差異（楊金鵬等，2012；薛棋文等，2022）。已有研究表明，溫度、酸堿度、總磷、總氮等多種水環(huán)境因子都會(huì)對(duì)原生生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響（王鑫，2014；楊漸，2015）。本研究通過(guò)Spearman秩相關(guān)性分析，探討拉魯濕地原生生物群落與水體多種環(huán)境因子的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)水溫、酸堿度、總氮、溶氧和濁度等都是影響原生生物群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子，和此前學(xué)者的研究結(jié)果一致（張鵬等，2022），盡管本研究中各原生生物類群未與總磷、總氮呈顯著相關(guān)，但在更低階元，如在OTU水平上，能檢測(cè)到部分OTU與總磷和總氮呈顯著的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，這表明總磷、總氮對(duì)不同類群原生生物的影響不同，在門(mén)類水平上，各不同類群之間的影響相互抵消或是淹沒(méi)，表現(xiàn)為在門(mén)水平?jīng)]有類群與總磷、總氮呈顯著相關(guān)，即拉魯濕地不同樣點(diǎn)間總磷、總氮的差異不會(huì)導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生劇烈變化。濕地上游娘熱溝、奪底溝都是山間溪流、流水，故上游水中含氧量較高，能夠更好地滿足水中生物的氧氣需求，使得水中原生動(dòng)物種類增加；影響濕地東南方向樣點(diǎn)的因素較多，一方面由于濕地管理部門(mén)對(duì)濕地的保護(hù)改造，使該區(qū)域水流通加快，另一方面該區(qū)域水草茂盛，存在一定的地勢(shì)差距，水流速度快，因此該區(qū)域樣點(diǎn)的含氧量相對(duì)較高，而拉薩市部分生活污水自拉魯濕地中干渠流入拉魯濕地，導(dǎo)致了遠(yuǎn)高于濕地內(nèi)部其他樣點(diǎn)的總磷、總氮含量，金藻、硅藻、甲藻等數(shù)量減少，纖毛蟲(chóng)和裸藻的數(shù)量增加。

3.3" "應(yīng)用原生生物多樣性評(píng)價(jià)拉魯濕地水環(huán)境質(zhì)量

早在1990年就有學(xué)者提出基于原生生物多樣性對(duì)水環(huán)境質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，認(rèn)為水環(huán)境質(zhì)量越高，原生生物多樣性越高（沈韞芬，1990）。在本研究中，拉魯濕地上游源頭水源無(wú)人為污染，為山間溪流，水體清潔，原生生物多樣性處于一個(gè)相對(duì)高水平；濕地北干渠入水口生物多樣性相比于其他樣點(diǎn)要低，入水口水源由多處水流匯集而成，由于地處拉薩城區(qū)，受到人為排放的污染物影響，生物多樣性處于一個(gè)相對(duì)低的水平（巴桑和普布，2014；索郎扎西等，2015）；濕地內(nèi)部部分樣點(diǎn)生物多樣性較高，這可能源于濕地生態(tài)系統(tǒng)的自我凈化功能，此外濕地內(nèi)部東南區(qū)域的樣點(diǎn)毗鄰公路，受到人為干擾波動(dòng)，導(dǎo)致流速加快，生長(zhǎng)有大量的水草等綠色植物，故該區(qū)域水中溶氧較高（拉多等，2009；王佳俊等，2020），且該區(qū)域有部分拉薩河水自東南匯入，總氮、總磷也要高于其他樣點(diǎn)（陳在妮等，2008；張文駒和張瀟瀟，2014），諸多因素累加，該區(qū)域的原生生物多樣性仍處于較高水平，與濕地內(nèi)部其他樣點(diǎn)無(wú)顯著差異；濕地下游的兩個(gè)樣點(diǎn)位于一污水處理廠附近，水中總磷、總氮和濁度遠(yuǎn)超于其他樣點(diǎn)，原生生物多樣性低于濕地內(nèi)部樣點(diǎn)和濕地源頭樣點(diǎn)。綜上所述，水源清潔處原生生物多樣性較高，總磷和總氮含量較高的區(qū)域原生生物多樣性較低，拉魯濕地的自我調(diào)節(jié)生態(tài)功能良好。

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Protist Diversity in the Lhalu Wetland of Tibet Based on Metagenomic Sequencing

Abstract：Lhalu wetland plays an important role in promoting the virtuous cycle of Lhasa's urban ecosystem and improving the quality of the urban environment. In this study， we explored the diversity and community structure of protists in Lhalu wetland as well as its relationship with environment factors. Our aim was to provide data to help conserve regional biological resources and the aquatic environment， and to protect and utilize biodiversity. During August and September of 2020， environmental DNA samples were collected at 10 sites in Lhalu wetland （S1 and S2 as upstream sites; S3-S8 as wetland sites， and S9 and S10 as downstream sites）. The species and community structure of protists in the Lhalu wetland were identified based on metagenomic sequencing， and water samples were collected simultaneously for determination of environmental factors. Results are as follows： （1） A total of 421 operational taxonomic units （OTUs） were identified， belonging to 140 genera， 105 families 84 orders， 35 classes， and 21 phyla. Among them， Euglenozoa， Ciliophora and Cercozoa had the highest species richness， while Cercozoa， Bacillariophyta and Ciliophora had the highest abundance. （2） There were significant differences in the diversity of protists in different regions of Lhalu wetland. The diversity of protists was high in the upstream sites， and the distribution among various groups was quite even. Protist biodiversity in the wetland was also high， especially the Cercozoa and Bacillariophyta. Protist diversity was low in the downstream sites， and the primary groups were Cercozoa and Ciliophora. （3） Protist diversity was affected by a variety of environmental factors. In general， the diversity was low at sites with high concentrations of nitrogen and phosphorus. The relationship between different protist groups and environmental factors was as follows： Euglenozoa was positively correlated with total phosphorus， total nitrogen and turbidity; Bacillariophyta was negatively correlated with total phosphorus and total nitrogen; Ciliophora was positively correlated with total phosphorus and pH; and Cercozoa was significantly negatively correlated with dissolved oxygen and pH. This study provides data necessary for assessing aquatic ecosystem conditions in the region.

Key words：protist; biodiversity; metagenomic sequencing; Lhalu wetland