基于微衛星標記的中國近海龍頭魚群體遺傳結構分析

摘要：開展中國近海龍頭魚群體遺傳結構研究，為我國龍頭魚資源的開發利用和漁業管理單元的劃分提供遺傳學背景資料。基于6個微衛星標記對2018—2020年采自連云港（LYG）、南通（NT）、三門（SM）、泉州（QZ）、湛江（ZJ）、北海（BH）和三亞（SY）的7個龍頭魚群體的遺傳結構和遺傳分化進行評估和分析，共檢測到111個等位基因，7個群體平均等位基因豐富度（Rs）為7.944～10.087，平均期望雜合度（He）和平均觀測雜合度（Ho）分別為0.721～0.807和0.621～0.785，平均多態信息含量（PIC）為0.673～0.768，呈現較高的遺傳多樣性水平。SY和BH群體間的遺傳距離最小（0.302 2），BH和LYG群體間的遺傳距離最大（0.501 9）。兩兩群體間的遺傳分化指數（Fst）為0.005 4～0.073 7，東海和南海群體（SM、QZ、ZJ、BH、SY）與黃海群體（LYG、N T）之間存在顯著的遺傳分化，基于群體間Nei氏標準遺傳距離構建的UPGMA聚類樹也顯示LYG和NT群體獨立于其他群體。將所有群體分為1個基因池或是2個基因池進行分子方差分析，均表明絕大部分遺傳變異來源于群體內個體間。三維因子對應分析和Structure分析提示龍頭魚群體可劃分為2個自由交配組群，在漁業管理上應視作不同的捕撈單元進行區別管理。

關鍵詞：龍頭魚；微衛星標記；遺傳結構

中圖分類號：Q347" " " " 文獻標志碼：A" " " " 文章編號：1674-3075（2025）01-0090-09

龍頭魚（Harpadon nehereus Hamilton，1822）是我國近海重要的中小型經濟魚類，也是海洋生態系統和食物鏈的重要組成部分。20世紀80年代以來，以龍頭魚為代表的中小型魚類生物量在短時間內呈迅速增加趨勢，在浙江北部海域漁獲物中占比一度高達75%，逐漸成為東海和南海海區的優勢魚類種群（杜曉雪，2018；郭峻宏等，2019）。龍頭魚肉質細嫩，蛋白質含量約為干重的70%，鈣磷含量高于大黃魚（Larimichthys crocea）和帶魚（Trichiurus japonicas）等傳統經濟魚類，營養價值豐富且價格親民，其干制品“龍頭烤”更是備受消費者的喜愛（韓素珍和董明敏，1994；Rupsankar，2010）。近年來，隨著龍頭魚的商業價值與營養價值逐漸被挖掘，其資源的開發利用也受到越來越多關注（陳玲等，2012）。

種群是物種進化的基本單位，也是漁業生物學研究和漁業管理的基本單元（陳大剛，1991）。通過對魚類種群遺傳結構和特征的研究，可以闡明其適應環境的遺傳學機制，結合歷史事件，亦可以推斷群體歷史動態，為漁業資源的開發、管理和保護提供重要的理論依據（Hedgecock，1987）。然而，迄今為止圍繞龍頭魚種群遺傳學領域的研究僅見部分線粒體基因（Cyt b、ND2）和相關序列擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子標記的報道（郭易佳等，2019；蔣艷琳等，2020）。

微衛星DNA（microsatellite DNA）又稱為簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）或短串聯重復序列（short tandem repeats，STR），是真核生物基因組中廣泛分布的以1～6個核苷酸為基元，首尾串聯而成的重復序列（Jarne amp; Lagoda，1996）。由于微衛星分子標記具有遺傳變異水平高、重復序列多、數量豐富、呈共顯性遺傳、引物具有通用性等特點，成為研究魚類群體遺傳結構和遺傳多樣性的重要工具之一（Chistiakov et al，2006；Panagiotis et al，2013；傅建軍等，2023）。Xu等（2011）和李海燕（2012）曾采用磁珠富集法開發了5個具有多態性的龍頭魚微衛星標記，但由于操作步驟繁瑣、技術難度大，這些標記并未成功應用到群體遺傳學研究中。本研究利用前期在龍頭魚肌肉組織轉錄組數據中挖掘的大量微衛星信息，篩選出擴增效果好且多態性高的微衛星標記對中國近海7個龍頭魚不同地理群體的遺傳結構和遺傳多樣性進行了分析，以期為我國龍頭魚資源的開發利用和漁業管理單元的劃分提供遺傳學背景資料。

1" "材料與方法

1.1" "樣本采集

本研究用到的165尾龍頭魚為2018—2020年利用拖網作業的方式采集自我國連云港（LYG，29尾）、南通（NT，22尾）、三門（SM，24尾）、泉州（QZ，24尾）、湛江（ZJ，24尾）、北海（BH，19尾）和三亞（SY，23尾）的7個地理群體的野生樣本（圖1）。樣本體長為12.1～19.3 cm，雌雄比例分布均勻。所有魚類樣本經形態學鑒定后，剪取背鰭下方約2～3 g新鮮肌肉組織浸泡于95%乙醇溶液中，并置于-20℃冰箱待用。

1.2" "DNA提取與PCR擴增

采用傳統的苯酚—氯仿法抽提取基因組DNA（Sambrook et al，1989），使用NanoDrop分光光度計檢測DNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA降解和污染情況。從龍頭魚肌肉組織轉錄組測序獲得的Unigene庫中設計合成微衛星引物100對，經篩選獲得26個具有多態性的微衛星標記，包括23個二堿基重復、1個三堿基重復和2個四堿基重復位點。從上述26對引物中進一步挑選出在全部165個樣本中擴增效果均較好的6對（LTY-9、LTY-15、LTY-42、LTY-45、LTY-47和LTY-58）用于群體遺傳學分析（表1）。每對引物的正向引物合成時分別添加FAM，HEX和TAMARA等3種熒光接頭，用于引物數據識別。

25 μL PCR擴增反應體系包括：2.5μL 10×PCR緩沖液（Trans，北京），2 μL dNTPs，正反引物各1 μL（10 μmol/L），17.25 μL去離子水，0.25 μL Easy Taq DNA聚合酶（Trans，北京）和1μL DNA模板。PCR擴增程序設置為：94 °C預變性5 min、94 °C變性30 s、最佳退火溫度下退火30 s、72 °C延伸30 s、循環33次，72 °C延伸10 min。所得PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因分型。

1.3" "數據分析

使用GeneMarker軟件讀取基因分型結果文件（Hulce et al，2011），經校正后讀取最大峰值對應等位基因長度，記錄于Excel表格中；使用Excel Microsatellite Toolkit軟件計算各微衛星位點的遺傳多樣性參數（Shaibi et al，2008），包括等位基因數（A）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和多態信息含量（PIC）；使用FASTA v.2.9.3統計各位點的等位基因豐富度（Rs）（Goudet，1995）；使用Micro-Checker對每個位點進行無效等位基因檢測（Oosterhout et al，2004），并用GENEPOP v.4.0對每個位點進行哈迪—溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）及連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）檢測（Rousset，2008）；運用Arlequin v.3.1計算兩兩群體間的遺傳分化指數（Fst）并進行分子方差分析（AMOVA）（Excoffier amp; Lischer，2010）；由Population v.1.2計算群體間Nei氏標準遺傳距離，并構建UPGMA樹（Raymond amp; Rousset，1995）；使用Structure v.2.3確定龍頭魚自由交配組群（Evanno et al，2005），設置同質組（homogeneous population）數目（K）的范圍為1～7，每個K值重復運行模擬10次后，通過STRUCTURE HARVESTER（https：//taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/）在線工具推導最佳自由交配組群數（Earl amp; von Holdt，2012）；利用Genetix v.4.05對龍頭魚群體進行三維因子分析（3D-AFC）；使用Bottleneck v1.2.02進行瓶頸效應檢測（Piry et al，1999）。

2" "結果與分析

2.1" "群體遺傳多樣性

本研究中7個龍頭魚群體的遺傳多樣性參數見表2。位點LTY-42的等位基因數最少（7個），位點LTY-9等位基因數最多（30個）。6個位點在所有群體中共檢測到等位基因111個，平均每個位點的等位基因數為18.5個，各位點均表現出多態性。對所有微衛星位點進行綜合分析顯示，泉州群體具有最高的平均等位基因豐富度（10.087）、平均觀測雜合度（0.785）和平均期望雜合度（0.807）；連云港群體的平均等位基因豐富度最低為7.944；平均觀測雜合度和平均期望雜合度的最低值分別為南通群體（0.621）和三門群體（0.721）；群體平均多態信息含量（PIC）為0.673～0.768，除位點LTY-42在三門、泉州、湛江、北海、三亞群體和LTY-9位點在南通群體中表現出中度多態，其余位點在各群體中均表現為高度多態性。

對7個群體6個微衛星位點的42個群體—位點組合進行哈迪—溫伯格平衡檢測，經Bonferroni校正后位點LTY-42和LTY-9在連云港和南通群體中檢測到偏離平衡的現象，位點LTY-58在北海群體中檢測到偏離平衡狀態，位點LTY-47在除北海群體外的群體中均檢測到偏離平衡的現象。此外，所有群體的位點間均未檢測到連鎖不平衡現象。Micro-Checker結果顯示，位點LTY-47可能在泉州群體中存在無效等位基因，LTY-42和LTY-9可能在連云港和南通群體中存在無效等位基因。

2.2" "群體遺傳結構分析

對龍頭魚群體的遺傳分化指數（Fst）和遺傳距離統計顯示（表3），龍頭魚整體的Fst值為0.042 3，兩兩群體間的Fst為0.005 4～0.073 7，泉州和南通群體間Fst值最大，北海和三亞群體間的Fst值最小。經Bonferroni校正后，連云港群體與泉州群體，以及南通群體和三門、泉州、北海群體間的Fst值達到了極顯著水平。龍頭魚群體間的Nei氏遺傳距離為0.302 2～0.501 9，三亞群體和北海群體間的遺傳距離最小，北海群體和連云港群體間的遺傳距離最大。三門、泉州、湛江、北海和三亞5個群體間的遺傳距離相對較近，且處于同一水平，連云港和南通群體與前5個群體的遺傳距離相對較遠，且同樣保持了一定程度的一致性。

根據Nei氏遺傳距離采用非加權配對算數平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）對龍頭魚群體進行聚類分析，結果如圖2所示。7個群體分為3個支系，三門和泉州群體為第1支系，湛江、北海和三亞群體為第2支系，連云港和南通群體為第3支系。第1支系首先與第2支系聚為一支，而后與第3支系聚為大支，第1支系與第2支系間的遺傳關系較近，第3支系與其余2個支系間的遺傳關系較遠。兩兩群體間遺傳分化指數與遺傳距離結果均支持了連云港和南通群體與其他群體的分化，體現出較一致的群體遺傳結構。

三維因子對應分析（3D-FCA）顯示，3個向量所代表的變異因子分別解釋總遺傳變異來源的40.14%、17.17%和12.58%（圖3）。三亞、湛江、北海、泉州和三門群體重疊聚集，連云港和南通群體空間上較為分散，且與前5個群體分隔較遠。

自由交配組群分析結果表明當K=2時ΔK值最高，組群劃分為最優選擇（圖4）。Structure條形圖中的個體分配模式顯示，龍頭魚群體具有2個自由交配群，三門、泉州、湛江、北海和三亞群體的大部分個體被分配于同一自由交配群，連云港和南通群體的絕大部分個體被分配于另一交配群（圖5）。將所有群體作為1個基因池進行分子方差分析（analysis of molecular variation，AMOVA），結果顯示97.73%的遺傳變異來源于群體內，群體間的遺傳變異占2.27%，兩兩群體間遺傳分化指數Fst = 0.022 7（P=0），群體間存在顯著的遺傳分化（表4）。為進一步檢測龍頭魚群體的遺傳結構，基于遺傳分化指數、遺傳距離、3D-FCA和自由交配組群分析結果，將龍頭魚群體劃分為2個組群進行AMOVA層次分析，三門、泉州、湛江、北海和三亞群體劃為一個組群；連云港和南通群體為另一組群。基于這一劃分，龍頭魚2個組群間的遺傳分化指數Fct = 0.020 01（P=0.046 93），組群內群體分化指數Fsc = 0.012 85（P=0.000 30），群體間分化指數Fst = 0.032 61（P=0.000 00），Fct gt;Fsc，組群劃分具有意義且組群間遺傳分化顯著。

2.3" "遺傳瓶頸檢測

基于無限等位基因模型（infinite allele model，IAM）、雙相模型（two phase mutation model，TPM）和逐步突變模型（stepwise mutation model，SMM）3種不同假設模型，利用Bottleneck軟件對龍頭魚7個地理群體進行Wilcoxon檢驗，以判斷群體近期是否經歷遺傳瓶頸效應（表5）。在IAM模型假設條件下，連云港和南通群體表現出雜合子過剩現象（Plt;0.05），瓶頸效應較為顯著。在TPM和SMM模型假設條件下，7個龍頭魚群體均未檢測到雜合度冗余現象，即未發生瓶頸事件。Mode shift檢測結果表明，龍頭魚群體各位點的等位基因頻率均呈常的L型分布。相較于IAM模型，TPM和SMM模型最貼近微衛星突變模式，被認為更適合用于處理微衛星數據。

3" "討論

3.1" "龍頭魚群體遺傳差異

在微衛星數據分析中，常通過等位基因數、雜合度和多態信息含量等指標來評價群體的遺傳多樣性。本研究中，各龍頭魚群體均表現出較高的等位基因數和等位基因豐富度，具有較高的遺傳多樣性。雜合度是反映群體中遺傳變異程度的最優參數和主要指標，雜合度越高，表明群體的遺傳同質性越低，群體的遺傳變異越大，即群體遺傳多樣性越高（任建功等，2021）。龍頭魚7個群體的雜合度為0.621～0.807，整體上遺傳多樣性水平較高，且符合海洋魚類微衛星檢測結果通常表現出較高雜合度水平，以及微衛星標記計算出的群體雜合度值在0.3～0.8的普遍規律（董秋芬等，2007）。多態信息含量是指一個后代獲得某個等位基因標記來自其親代的同一等位基因標記的可能性，根據Botstein等（1980）提出的衡量標準，本研究中龍頭魚群體均表現出相對較高的平均多態信息含量。各項遺傳參數均表明，我國近海龍頭魚群體具有較為豐富的種內遺傳變異和較高的遺傳多樣性。

物種的遺傳多樣性豐富程度會受到遺傳瓶頸效應的影響（程嬌，2013）。龍頭魚群體在更適合微衛星數據分析的TPM和SMM突變模型下均未檢測雜合度過量的現象，所有群體的等位基因頻率分布均呈正常的L型。除連云港和南通群體外，其余5個龍頭魚群體近期未經歷過遺傳瓶頸事件，有利于龍頭魚群體遺傳差異的累積，維持較高水平遺傳多樣性。哈迪—溫伯格平衡指一個足夠大的隨機交配種群在沒有選擇、突變和遷移等因子影響的理想狀態下，等位基因頻率和基因型頻率隨世代的增加保持穩定不變（戴灼華和王亞馥，2016）。本研究中11個位點—群體組合偏離哈迪—溫伯格平衡狀態，說明龍頭魚群體受到外來因素干擾較大，群體可能產生了不同程度的遺傳漂變。在檢測到無效等位基因的位點—群體組合中均出現了偏離哈迪—溫伯格平衡的現象，無效等位基因的擴增也是影響群體偏離此平衡的重要因素。

3.2" "龍頭魚群體間遺傳分化

遺傳分化系數（Fst）是衡量群體遺傳分化水平的重要指標。根據Wright（1978）對遺傳分化水平的定義：當0lt;Fstlt;0.05，群體間分化較小；當0.05[≤]Fstlt;0.15，群體間存在中等程度的遺傳分化；0.15[≤]Fstlt;0.25，群體間存在較高程度的遺傳分化；當Fst[≥]0.25，群體間存在極大的遺傳分化。但是，也有學者認為Wright的定義并不能作為衡量群體分化水平的唯一標準，存在遺傳差異的群體間并不總是表現出較高的遺傳分化系數（劉名，2010），Fst值統計檢驗的顯著性更能體現群體間遺傳分化水平，如：歐洲無須鱈（Merluccius merluccius）（Fst=0.013， Plt;0.001）（Lundy et al，1999）以及地中海東大西洋石斑魚（Epinephelus marginatus）（Fst=0.018，Plt;0.000 1）（Innocentiis et al，2001）群體均具有顯著的遺傳分化。本研究中盡管龍頭魚群體間的Fst較小，但在統計上顯著。對應群體所處海區位置，發現顯著的遺傳分化主要存在于黃海群體（LYG和NT）與東海（SM和QZ）、南海群體（ZJ、BH和SY）之間。UPGMA聚類分析顯示了由連云港和南通群體組成的獨立黃海支系，支持了Fst的分析結果。為進一步檢測龍頭魚群體的遺傳結構，我們采用了3種方法分別展開研究：3D-FCA分析結果顯示，東海與南海群體聚類，明顯區別于黃海群體；Structure分析顯示，黃海群體為獨立的自由交配群；AMOVA層次分析顯示，黃海組群與東海、南海組群間的遺傳分化達到顯著水平。基于線粒體Cyt b基因的相關研究表明，中國近海龍頭魚群體具有連續的系統地理格局，不存在顯著的群體遺傳結構（郭易佳等，2019）。造成這一差異的原因可能一方面是樣本的來源不同，另一方面核基因微衛星突變速率是線粒體基因的102～106倍，能夠檢測到群體間微弱的遺傳分化，更好地反映生物種群近期遺傳信息和遺傳格局（劉云國，2009）。

海洋魚類群體間的遺傳分化主要由以下4個方面的原因導致：（1）歷史上的氣候波動。如：更新世時期冰期海平面下降，棲息地急劇收縮，導致位于邊緣海的玉筋魚（Ammodytes personatus）群體發生遺傳分化，甚至產生生殖隔離（Hewitt，2000）。（2）以海洋鋒面、海水溫度和鹽度為主的海洋環境因素。寒、暖流會影響流經海域的水文條件，并在交匯區形成較強的水平溫度和鹽度梯度，產生隔離屏障，如：黃海冷水團就以一個等溫線為邊界，保持了水團內外的溫度差，從而影響黃海冷水種的分布（王秀亮，2017）。（3）魚類自身的生態習性，包括有限的遷移能力、定向洄游、產卵場的隔離以及產卵時間差異等，如：由于返回原棲息地的定向洄游，導致了美洲鰻鱺（Anguilla rostrate）和歐洲鰻鱺（A. Anguilla）即使產卵場交疊仍存在顯著遺傳分化（Avise et al，1986）。（4）地理隔離及棲息地的不連續性，如：大西洋鱈（Gadus morhua）的遺傳分化就主要是由于深海溝導致了不同棲息地種群間基因流的下降（Ruzzante et al，1999）。

據此，我們推測黃海群體與東海、南海群體間顯著的遺傳分化可能與洋流、長江沖淡水以及龍頭魚自身生態習性和有限活動能力相關。每年5—8月為長江水域豐水期，大量淡水涌入東海與南下的中國沿岸流匯合并在浙江沿岸形成切變鋒和羽狀鋒（朱建榮等，2003），大部分龍頭魚魚群在同一時期到達近岸淺海區或河口附近分散產卵，復雜的海流鋒面系統極有可能對2個海區浮性卵的擴散產生阻隔。7—9月成魚和當年生的幼魚開始索餌育肥，長江沖淡水在產生阻隔作用的同時帶來了豐富的營養物質，也一定程度上將魚群的活動范圍限制在其輻射區內。10月后氣溫下降，龍頭魚逐漸向稍深近海越冬，但由于運動能力有限，較小的緯度范圍內短距離產卵和越冬洄游降低了群體間混合的可能性。在這些機制的綜合作用下，黃海龍頭魚群體與南部海域群體間的基因交流受阻，從而導致顯著遺傳差異的產生。綜上所述，在微衛星水平上黃海龍頭魚群體與東海、南海群體存在顯著的遺傳分化，建議作為兩個管理單元分別進行漁業管理。

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Genetic Structure of Harpadon nehereus Populations in the Coastal

Waters of China Based on Microsatellite Markers

Abstract：Population genetic structure analysis is the basis for establishing fishery management， and is important for conserving biodiversity and the scientific development and use of fishery resources. Microsatellite DNA is abundant in eukaryotic genomes and， because it is dominant and has a high mutation rate， has become an effective genetic marker for differentiating fish populations. Harpadon nehereus is an important small to medium-sized commercial fish species in the coastal water of China， and a vital food chain component of marine ecosystems. In this study， we analyzed the genetic structure and differentiation of seven H. nehereus populations [Lianyungang （LYG）， Nantong （NT）， Sanmen （SM）， Quanzhou （QZ）， Zhanjiang （ZJ）， Beihai （BH） and Sanya （SY）] in the coastal waters of China， based on six microsatellite markers. During 2018-2020， a total of 165 wild H. nehereus specimens from the seven populations were sampled by trawl for DNA extraction and PCR amplification. A total of 111 alleles were detected， and the average allelic richness （Rs） of the seven populations ranged from 7.944 to 10.087. The ranges of the average expected heterozygosity （He） and the average observed heterozygosity （Ho） were 0.721-0.807 and 0.621-0.785， respectively. The average polymorphic information content （PIC） ranged from 0.673 to 0.768， showing a high level of genetic diversity. The genetic distance between the SY and BH populations was the lowest （0.302 2）， while the highest genetic distance （0.501 9） was observed between the BH and LYG populations. The pairwise genetic differentiation index （Fst） ranged from 0.005 4 to 0.073 7， and there was significant genetic differentiation between the East and South China Sea populations （SM， QZ， ZJ， BH and SY） and the Yellow Sea populations （LYG and NT）. The UPGMA tree constructed based on Nei’s standard genetic distance also shows that the Yellow Sea populations （LYG and NT） were topologically independent of the other populations. Regardless of whether the populations were divided into one or two gene pools for AMOVA analysis， the results show that most of the genetic variation came from individuals within populations. 3D-FCA analysis and structure analysis suggest that the H. nehereus population in coastal China should be divided into two free mating groups and treated as different units for fishery management.

Key words： Harpadon nehereus; microsatellite markers; genetic structure