不同酶解工藝對鮮木薯塊根粗多糖得率的影響

摘""要：本研究以木薯塊根為原料，采用單因素試驗結合Box-Behnken響應面方法，優化超聲波輔助木薯粗多糖的提取工藝，分析4種不同酶酶解鮮木薯塊根的工藝，比較木薯粗多糖（crude"polysaccharide"of"cassava"root，"CPCR）得率的差異。結果表明：4種酶酶解最優工藝均有所差異，加酶提取CPCR得率顯著高于不加酶，4種酶的CPCR得率大小為中溫α-淀粉酶gt;普魯蘭酶gt;半纖維素酶gt;低溫α-淀粉酶，其中低溫α-淀粉酶酶解超聲處理時間最長（360"min），但CPCR得率最低為7.02%；中溫α-淀粉酶CPCR得率最高（20.25%），其最佳酶解提取工藝為超聲功率300"W，超聲溫度70"℃，加酶量5"KU/g，料液比（g/mL）1∶2.5，超聲時間240"min；普魯蘭酶酶解超聲處理時間最短（60"min），CPCR得率為13.98%；半纖維素酶酶解條件下CPCR得率為7.99%。進一步對優化條件進行驗證，結果表明，粗多糖得率和預測值接近，但是在僅加入酶不加木薯樣本的條件下也檢測到粗多糖含量，扣除酶的影響后中溫α-淀粉酶的提取率仍然為最高（17.22%），可見，中溫α-淀粉酶酶解木薯塊根是一種高效率提取CPCR的方法。本研究有望為鮮木薯粗多糖的深入研究和開發利用提供技術基礎。

關鍵詞：木薯；粗多糖；響應面分析；酶解提取中圖分類號：Q814.9，S533""""""文獻標志碼：A

Effect"of"Different"Enzymatic"Hydrolysis"Processes"on"the"Yield"of"Crude"Polysaccharide"from"Fresh"Cassava"Roots

YU"Houmei1，2，"LIN"Liming1，2，"WANG"Qinfei1，2，"YAO"Qingqun1，2，"DU"Peixu1，"ZHANG"Jinquan1，"ZHANG"Zhenwen1，2*

• Institute"of"Tropical"Crops"Genetic"Resources，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"National"Ramp;D"Center"for"Potato"Processing，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2.nbsp;Key"Laboratory"of"Germplasm"Resources"Conservation"and"Utilization"of"Cassava，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs，"Haikou"Hainan"571101，"China

Abstract："Cassava"roots"were"used"as"the"raw"material."Single"factor"tests"combined"with"the"Box-Behnken"response"surface"method"were"used"to"optimize"the"extraction"process"of"cassava"crude"polysaccharide"（CPCR）"assisted"by"ultrasonic"wave，"and"the"process"of"enzymatic"hydrolysis"of"cassava"tuber"roots"by"four"different"enzymes"was"analyzed."The"results"showed"that"the"four"enzymatic"hydrolysis"processes"were"different."The"extraction"yield"of"CPCR"with"enzyme"was"significantly"higher"than"that"without"enzyme."The"CPCR"yield"of"the"four"enzymes"was"α-medium"temperaturegt;pullulanasegt;hemicellulasegt;α-low-temperature"amylase，"the"ultrasonic"treatment"time"of"α-low-temperature"amylase"was"the"longest"（360"min），"but"the"CPCR"yield"was"the"lowest"（7.02%）."The"α-medium"temperature"CPCR"yield"was"the"highest"（20.25%），"and"the"best"enzymatic"extraction"process"was"as"follows："ultrasonic"power"300"W，"ultrasonic"temperature"70"℃，"enzyme"content"5"KU/g，"solid-liquid"ratio"（g/mL）"1∶2.5，"and"ultrasonic"time"240"min."The"ultrasonic"treatment"time"of"pullulanase"was"the"shortest"（60"min），"and"the"CPCR"yield"was"13.98%."The"yield"of"CPCR"under"hemicellulase"hydrolysis"was"7.99%."The"optimized"conditions"were"further"verified，"and"the"results"showed"that"the"yield"of"crude"polysaccharide"was"close"to"the"predicted"value."However，"the"crude"polysaccharide"content"was"also"detected"under"the"condition"that"only"enzyme"was"added"without"cassava"sample，"and"the"extraction"rate"of"medium"temperature"α-amylase"was"still"the"highest"（17.22%）"after"deducting"the"influence"of"enzyme."It"can"be"seen"that"medium"temperature"α-amylase"enzymatic"hydrolysis"of"cassava"tuber"roots"is"an"efficient"way"to"extract"CPCR."This"study"is"expected"to"provide"technique"basis"for"its"further"research"and"utilization"of"crude"polysaccharide.

Keywords："cassava;"crude"polysaccharides;"response"surface"analysis;"enzymolysis"extraction

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.016

多糖是一類由單糖通過糖苷鍵連接在一起形成的生物大分子物質[1-2]，廣泛存在于自然界中，并因其獨特的生物活性，如免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等備受關注，并在醫藥、食品和化妝品等領域具有廣泛的應用價值[3-7]。木薯（Manihot"esculenta"Crantz）作為一種在全球熱帶地區廣泛種植的糧食作物，為超過10億人口提供了基本的營養來源[8]，其塊根含有淀粉、纖維素、蛋白質等營養物質，且已被證實是制備活性多糖的重要物質基礎[9-11]。已有研究表明，木薯塊根中的多糖不僅種類繁多，而且具有顯著的生物活性。例如，CHARLES等[12]從木薯塊根中分離出一種由蔗糖、果糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等組成的粘多糖，具有特定的分子量和組成，該粘多糖來自半纖維素；CHIA等[13]的研究則揭示了木薯多糖對大鼠耐力的積極影響；此外，木薯粉提取的粗多糖亦被證實具有抗氧化活性和對大鼠肝損傷的保護作用[14]；UTHUMPORN等[15]進一步研究發現，木薯多糖的添加能夠顯著改善小麥粉面團的加工特性。

多糖的提取是多糖活性評價的前提，其方法的選擇對于多糖的得率、性質及生物活性具有顯著影響[16-19]，傳統的提取方法如熱水提取、酸堿提取雖操作簡單，但存在得率低、活性低等缺點。相比之下，超聲提取和酶法提取因具有條件溫和、提取率高、活性強等優勢而逐漸受到重視[20-21]。超聲波能夠破壞植物細胞壁結構，促進多糖的釋放，而酶法則具有專一性強、反應條件溫和、活性強、成本低、環保等特點，特別是當把2種方法結合使用時，能夠進一步提高多糖的得率和活性[22]。然而，值得注意的是，盡管超聲輔助酶法在多糖提取領域展現出巨大的潛力，但該方法尚未被應用于木薯多糖的提取。因此，本研究旨在充分利用超聲和酶解法的優點，通過響應面法優化不同酶解條件下的最佳提取工藝，以期為木薯多糖的深入研究和綜合高效利用提供理論支持和實踐指導。

1""材料與方法

1.1""材料

華南9號木薯（South"China"9，"SC9）塊根采自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所國家薯類加工技術研發分中心（海南儋州）；無水葡萄糖、葡萄糖醛酸、牛血清白蛋白（bovine"serum"albumin，"BSA）、四硼酸鈉、考馬斯亮藍均購自北京索萊寶公司；低溫α-淀粉酶、半纖維素酶均購自上海源葉生物公司；中溫α-淀粉酶、普魯蘭酶、三氯乙酸均購自上海麥克林公司；無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、硫酸等所有分離用有機試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

KQ-600DE超聲波清洗器（昆山舒美公司）；TU-1810APC紫外分光光度計（北京普析公司）；Simple-Q15超純水系統（上海芷昂公司）；Multiskan"FC酶標儀（美國Thermo公司）；PHS-3E"pH計（上海儀電科學儀器公司）；SRY-150生化培養箱（寧波賽福公司）；IJXFSTPRP-24全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業公司）；Z327K高速冷凍離心機（德國HERMLE公司）。

1.2""方法

1.2.1""木薯粗多糖提取樣本預處理""采收生長期1年的華南9號木薯塊根，木薯塊根洗凈泥沙、去掉外表皮和木薯內層皮，切塊、研磨成漿、分裝，?20"℃冷凍待用。

1.2.2""超聲輔助酶解木薯粗多糖提取工藝""CPCR的提取參考CHARLES等[12]、CHEN等[23]的方法并優化，按照圖1流程進行提取：在木薯樣本中加入一定量的去離子水和酶，300"W條件下超聲浸提，25"℃，8000"r/min離心10"min后取上清，加4%三氯乙酸去蛋白，離心后在上清中加無水乙醇至濃度為80%，混勻后室溫靜置2"h離心取沉淀，沉淀用去離子水復溶后使用截留量為3.5"kDa透析袋在去離子水中透析72"h。

1.2.3""單因素試驗""低溫α-淀粉酶：以CPCR得率為指標，在超聲功率300"W、超聲溫度45"℃條件下，按照1.2.2提取CPCR，依次分別考察加酶量（0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1"KU/g）、料液比（g/mL）（1∶2、1∶3、1∶5、1∶8）、超聲時間（60、120、180、240、300、360"min）對CPCR得率的影響。

中溫α-淀粉酶：以CPCR得率為指標，在超聲功率300"W、超聲溫度70"℃條件下，按照1.2.2提取CPCR，依次分別考察加酶量（0、1.0、2.0、3.5、4.5、6.0"KU/g）、料液比（g/mL）（1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶8）、超聲時間（30、60、120、240、360、480"min）對CPCR得率的影響。

普魯蘭酶：以CPCR得率為指標，在超聲功率300"W、超聲溫度55"℃條件下，按照1.2.2提取CPCR，依次考察加酶量（0、1.0、2.0、3.0、4.0"KU/g）、料液比（g/mL）（1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶8）、超聲時間（30、60、120、240、360、480"min）對CPCR得率的影響。

半纖維素酶：以CPCR得率為指標，在超聲功率300"W、超聲溫度50"℃條件下，按照1.2.2提取CPCR，依次考察加酶量（0、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0"KU/g）、料液比（g/mL）（1∶2、1∶3、1∶5、1∶8、1∶10）、超聲時間（15、30、45、60、80、100、120"min）對CPCR得率的影響。

1.2.4""響應面優化""基于單因素試驗結果，采用Design-Expert"12的Box-Behnken設計響應面組合試驗方案[24]，以加酶量、料液比和超聲時間為正交因子，CPCR得率為響應值，優化木薯粗多糖的超聲波輔助提取工藝參數，具體試驗因素水平如表1所示。

1.2.5""粗多糖組成測定""采用苯酚-硫酸法測定木薯粗多糖總糖含量，采用間羥基聯苯法測定酸性糖含量，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量[25]。

1.3""數據處理

每個試驗至少重復3次，采用Excel"2016軟件計算試驗數據平均值和相對標準偏差，響應面試驗數據由Design-Expert"12軟件處理，采用IBM"SPSS"Statistics"27軟件進行單因素顯著性統計分析，相關圖形數據均由Origin"2021軟件處理。

2""結果與分析

2.1""單因素試驗

2.1.1""加酶量對CPCR得率的影響""4種酶的不同加酶量對CPCR得率的影響表明，在未添加和低劑量添加酶時，CPCR得率較低。隨著加酶量的增加，CPCR得率逐漸升高，當加酶量達到一定程度時，CPCR得率不再顯著增加，部分情況下反而有所降低（圖2）。這可能是因為在加酶量較低時，酶可以充分與底物接觸，隨著加酶量增加底物被完全反應，進一步增加加酶量可能導致酶的活性被抑制[26]。低溫α-淀粉酶在加酶量為0.9"KU/g時得率達到最高，進一步增加加酶量未顯著提高CPCR得率（圖2A），因此，選擇0.6～"1.0"KU/g作為優化范圍；中溫α-淀粉酶加酶量達到4.5"KU/g時，粗多糖得率達到最高，為23.11%（圖2B），其優化范圍為2.0～5.0"KU/g。普魯蘭酶為液體型，加酶量增加會導致料液比相應增加，結合料液比數據（圖2C），其優化范圍選擇為2.0～4.0"KU/g。半纖維素酶在加酶量達到2.0"KU/g時CPCR得率達到最大，但在0.7"KU/g后增加不顯著（圖2D），其優化范圍為0.3～3.0"KU/g。

2.1.2""料液比對CPCR得率的影響""4種酶解條件下料液比對CPCR得率的影響見圖3，隨著溶劑增加，圖3A、圖3B、圖3D中粗多糖得率均呈現先增加后減少的趨勢。當溶劑較少時對木薯酶解不充分，隨著料液比增加，可能雜質的溶出抑制了多糖的提取，使得多糖呈現先增加后減少的趨勢[27]。從圖3A中可知，料液比在1∶3"時粗多糖得率最高，與1∶2"的料液比無顯著性差異，料液比1∶5"或1∶8"時，多糖得率顯著下降，因此，料液比選擇1∶2～1∶5"作為優化范圍；圖3B料液比在1∶2"時粗多糖得率最高，因此選1∶1.5～1∶3.0"作為其優化范圍；圖3C中料液比1∶2"后CPCR得率未顯著增加，料液比選擇1∶2～1∶8"作為其優化范圍；圖3D料液比在1∶5"時粗多糖得率最高，隨著料液比上升粗多糖得率迅速下降，料液比選擇1∶3～1∶8"進一步優化。

2.1.3""超聲時間對CPCR得率的影響""超聲時間對CPCR得率的影響如圖4所示。隨著超聲時間延長，木薯粗多糖得率逐漸增加，說明適當延長超聲時間可以提高CPCR得率，但時間過長，多糖得率呈現下降趨勢，可能是粗多糖溶解到平衡后，會引起粗多糖結構的改變從而降低得率[28]。低溫α-淀粉酶在超聲時間60～300"min時CPCR得率和超聲時間成正比，超過300"min后CPCR得率下降（圖4A），可能是超聲時間太長導致水溫上升，超過了低溫α-淀粉酶的最適溫度45"℃導致酶失活，導致得率下降，因此提取時間選取180～360"min作為優化范圍；中溫α-淀粉酶在超聲時間大于120"min后粗多糖得率并未顯著增加（圖4B），表明經過120"min的超聲處理，大部分木薯粗多糖都已溶出[25]，隨著超聲時間延長水溫升高，但是仍然在中溫α-淀粉酶的活性溫度范圍內，所以隨著超聲時間延長，CPCR得率未減少，因此提取時間選取60～240"min作為優化范圍；普魯蘭酶超聲時間對木薯粗多糖的得率如圖4C所示，隨著提取時間延長，CPCR得率逐漸增加，但超過360"min后未顯著提高粗多糖得率，因此提取時間選取60～360"min作為優化范圍；半纖維素酶在15～100"min隨著超聲時間延長，CPCR"得率逐漸增加，并在100"min時達到最大（圖4D），說明適當延長超聲時間可以提高木薯粗多糖得率，可能是超聲能破壞細胞壁促進粗多糖溶出，但超聲時間超過100"min后木薯粗多糖得率開始下降，可能長時間超聲破壞了多糖結構并使其降解，導致得率下降[29-30]，因此超聲時間選取45～120"min作為優化范圍。

2.2""響應面優化

2.2.1""低溫α-淀粉酶""應用Design-Expert"12軟件對表2中的數據進行建模和分析，得到了粗多糖得率（R）的加酶量（A）、料液比（B）、和超聲時間（C）的多元回歸方程：R=3.7600+1.2700A?1.3000B+"0.1613C?0.3725AB+0.0150AC?0.4975BC?0.3590A2?0.3365B2+0.3410C2。響應面試驗數據的分析結果見表3，模型P=0.0413lt;0.05，R2=83.62%，說明此模型顯著，失擬項P=0.9053gt;0.05，說明明顯的失擬因素不存在，因此該回歸方程可信。根據F值可判斷3項因素對CPCR得率影響大小排序為B（料液比）gt;A（加酶量）gt;C（超聲時間）。

根據回歸模型分析結果，運用Design-Expert"12軟件中的Optimization功能，以粗多糖含量最大為條件，求解回歸模型優化得到最優參數：加酶量為1"KU/g，料液比（g/mL）為1∶2，超聲時間為360"min，粗多糖得率為7.02%。

2.2.2""中溫α-淀粉酶""應用Design-Expert"12軟件對表4中的數據進行建模和分析，得到粗多糖得率（R）的加酶量（A）、料液比（B）、和超聲時間（C）的多元回歸方程：R=16.4300+2.8400A+1.9300B+"1.5300C?0.5163AB?0.8623AC?0.0935BC?0.4883A2?1.9400B2+0.5730C2。響應面試驗數據的分析結果見表5，P=0.0014lt;0.01，R2=94.34%，說明此模型極顯著，失擬項P=0.5926gt;0.05，說明明顯的失擬因素不存在，因此該回歸方程可信。F值可評估判斷自變量對因變量產生的影響，可知3個因素影響CPCR提取率的程度為A（加酶量）gt;B（料液比）gt;C（超聲時間）。

根據回歸模型分析結果，運用Design-Expert"12軟件中的Optimization功能，以粗多糖含量最大為條件，求解回歸模型優化得到最優參數：加酶量為5"KU/g，料液比為1∶2.5，超聲時間為240"min，粗多糖得率為20.25%。

2.2.3""普魯蘭酶""應用Design-Expert"12軟件對表6中的數據進行建模和分析，得到了粗多糖得率（R）的加酶量（A）、料液比（B）、和超聲時間（C）的多元回歸方程：R=8.4900+3.2100A+0.0072B?"0.4989C?0.1425AB?0.3443AC+0.6830BC+0.3117A2?0.0120B2+0.3152C2。響應面試驗數據的分析結果見表7，Plt;0.01，R2=98.04%，說明此模型極顯著，失擬項P=0.0564gt;0.05，說明該回歸方程可信。由F值可知3個因素影響CPCR提取率的程度為A（加酶量）gt;C（超聲時間）gt;B（料液比）。

根據回歸模型分析結果，運用Design-Expert"12軟件中的Optimization功能，以粗多糖含量最大為條件，求解回歸模型優化得到最優參數：加酶量為4"KU/g，料液比為1∶2"g/mL，超聲時間為60"min，粗多糖得率為13.98%。

2.2.4""半纖維素酶""應用Design-Expert"12軟件對表8中的數據進行建模和分析，得到粗多糖得率（R）的加酶量（A）、料液比（B）、和超聲時間（C）的多元回歸方程：R=3.59000+0.72000A?0.20250B+"0.86250C+0.13000AB+0.34500AC+1.82000BC?1.11000A2+1.53000B2+0.06957C2。響應面試驗數據的分析結果見表9，P=0.0060lt;0.01，R2=91.14%，說明此模型極顯著，失擬項P=0.4365gt;0.05，說明該回歸方程可信。由F值可評估3個因素影響提取率的程度為C（超聲時間）gt;A（加酶量）gt;B（料液比）。

根據回歸模型分析結果，運用Design-Expert"12軟件中Optimization功能，以粗多糖含量最大為條件，求解回歸模型優化得到最優參數：加酶量為2.4"KU/g，料液比為1∶8，超聲時間為120"min，粗多糖得率為7.99%。

2.3""參數驗證

根據多元回歸方程和模型，預測了4種酶法輔助超聲波提取木薯粗多糖最優參數。經過5次平行試驗，CPCR的得率如表10所示。結果顯示，4種酶對木薯肉粗多糖得率大小：中溫α-淀粉酶＞普魯蘭酶＞半纖維素酶＞低溫α-淀粉酶，中溫α-淀粉酶酶解木薯漿時CPCR得率最高。進一步分析發現，所有加酶條件下的CPCR得率均極顯著高于未加酶條件的得率，這證明了超聲波輔助酶解能極顯著提高CPCR的提取效率。此外，在僅加入酶而不加木薯樣本的試驗中也檢測到了多糖成分，無樣本只加酶提取的粗多糖得率大小為普魯蘭酶（5.23%）gt;低溫α-淀粉酶（2.97%）gt;中溫α-淀粉酶（2.58%）gt;半纖維素酶（0.04%），這可能是由于菌種自身的胞壁多糖，或者在酶的生產過程中菌種培養等原因而殘留的能產生多糖的成分所致[31-33]。具體而言，在未加樣本只加酶的情況下，普魯蘭酶的多糖得率最高，達到5.23%，而半纖維素酶的多糖得率最低，僅為0.04%。在扣除酶本身產生的多糖影響后，我們發現中溫α-淀粉酶對木薯漿中CPCR的提取得率仍然為最高（17.22%）。值得注意的是，中溫α-淀粉酶的最佳作用溫度為70"℃，這與木薯淀粉的糊化溫度相近[34]，因此，不加酶的情況下，由于樣本大部分已凝固，導致無法有效提取木薯粗多糖，所以，中溫α-淀粉酶提取條件下不加酶無法獲得木薯粗多糖。總的來說，建立的回歸模型能準確反映3個因素對木薯粗多糖得率的影響，并且實際結果與預測值非常接近。經過響應面法優化的超聲波輔助酶法提取的參數具有實際應用價值，為CPCR的提取提供了有效的技術方法。

3""討論

木薯是世界重要的糧食作物，其塊根富含淀粉和纖維素，是傳統的植物基多糖提取制備的優質原料。傳統采用熱水浸提法提取多糖時，過高的提取溫度（65"℃以上）會引起淀粉的糊化[34]，進而影響非淀粉多糖的提取效率。而采用α-淀粉酶和糖化酶聯合酶解處理山藥的多糖得率為溫水浸提的3.5倍左右[35]，為此，常見能降解淀粉的酶類如α-淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶等常被用于高淀粉含量樣本的粗多糖提取。本研究表明，中溫α-淀粉酶提取的多糖得率最高，這可能中溫α-淀粉酶的作用溫度為70"℃，超聲過程中溫度會升高，導致實際作用溫度高于70"℃，但是還是在中溫α-淀粉酶的最佳作用溫度范圍內，在該范圍內木薯淀粉已糊化，糊化的淀粉空間結構更松散，更易于被酶解，提高了粗多糖的得率[36]。

從提取工藝看，超聲輔助提取多糖也是一種常用的物理提取方法，超聲形成的空化效應具有高強度的沖擊力和剪切力，能夠穿透細胞壁，從而促進胞內物質的溶出[37]，縮短時間，提高得率[38]，使多糖分子量更小，活性更高[39]。本研究結果表明300"W超聲波輔助酶解能顯著提高CPCR得率，但不同的酶最適作用條件不同，所得產物也有差異。許多研究也表明，不同的酶解條件下所得到的多糖在含量、單糖組成、分子量、外觀形態等方面有顯著差異[40-42]。可見，超聲波輔助酶水解植物基提取功能多糖可能是今后產業化應用的主流技術。本研究系統分析了CPCR的提取工藝，為后續CPCR的分離純化及活性組分研究奠定基礎，有助于進一步揭示其結構與生物活性之間的關系。然而，不同超聲時間和酶是如何高效水解淀粉、CPCR主要來源于淀粉還是纖維或細胞壁等科學問題尚不清楚，這將是今后研究的重點。

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