香草蘭揮發油納米微乳液制備及穩定性評價

摘" 要：為改善香草蘭揮發油水溶性差、穩定性低等問題，以馬達加斯加香草蘭豆莢提取得到的香草蘭揮發油作為主要原料，采取自發乳化法構建香草蘭揮發油納米微乳化體系并對其穩定性進行評價。結果表明：香草蘭揮發油納米微乳液最佳組成為表面活性劑Tween 40與助表面活性劑丙二醇的質量比為2，混合表面活性劑與油相的質量比為9∶1，可得到水包油型（O/W）香草蘭揮發油納米微乳液，納米微乳液的粒徑為（16.75±0.06）nm，聚合物分散系數（PDI）為0.240±0.003，Zeta電位為（–3.15±0.46）V。采用離心法、加熱法以及低溫貯藏法對香草蘭揮發油納米微乳液進行穩定性評價。結果表明，在離心速率為2000～10 000 r/min，加熱溫度為40～90 ℃條件下，香草蘭揮發油納米微乳液能保持澄清、透明狀態，在4 ℃條件下放置30 d，未產生渾濁、沉淀等現象，表明香草蘭揮發油納米微乳液具有良好的離心穩定性、熱穩定性以及貯藏穩定性。研究結果為香草蘭揮發油的應用提供一定的技術支撐。

關鍵詞：香草蘭揮發油；納米微乳液；穩定性；評價

中圖分類號：TQ654.2" " " 文獻標志碼：A

Preparation and Stability Evaluation of Vanilla Volatile Oil Nano- Microemulsion

DU Min1，2， DONG Li2， TANG Bing1，3，4，5， HU Xiaosong2， ZHANG Yanjun1，3，4，5， XU Fei1，3，4，5*

1. Spices and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100000， China; 3. National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research， Wanning， Hainan 571533， China; 4. Hainan Tropical Spices Beverage Crop Engineering Technology Research Center， Wanning， Hainan 571533， China; 5. Key Laboratory of Processing Suitability and Quality Control of the Special Tropical Crops of Hainan Province， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract： In order to solve the problems of poor water solubility and low stability of vanilla volatile oil， the vanilla volatile oil extracted from Madagascar vanilla pods was used as the main raw material， and the nano-emulsification system of vanilla volatile oil was constructed by the spontaneous emulsification method and stability was evaluated. The results showed that the optimal process formula of vanilla volatile oil nano-microemulsion was the mass ratio of surfactant to co-surfactant was 2， and the mass ratio of mixed surfactant to oil phase was 9∶1， and O/W vanilla volatile oil nano-microemulsion could be obtained， and the particle size of the nano-microemulsion was （16.75±0.06）nm， and the polymer dispersity index （PDI） was 0.240±0.003. The Zeta potential was （–3.15±0.46）V. The results showed that the vanilla volatile oil nano-microemulsion could remain clear and transparent under the conditions of centrifugation rate of 2000-10 000 r/min and heating temperature of 40–90 ℃， and was placed at 4 ℃ for 30 days without turbidity and precipitation， indicating that the vanilla volatile oil nano-emulsion had good centrifugal stability， thermal stability and storage stability. The results would provide some technical support for the application of vanilla volatile oil and nano microemulsion.

Keywords： vanilla volatile oil; nano-microemulsion; stability; evaluation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.02.018

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）屬蘭科香子蘭屬，是一種多年生熱帶藤本植物，果實為肉質莢果狀，常稱之為豆莢。香草蘭豆莢成熟時自身無香氣，通過殺青、發汗、干燥等過程使其具有豐富的香氣物質[1]，從豆莢中提取的揮發性物質具有獨特的香味[2-4]。因此，以微生物發酵后的香草蘭豆莢為原料通過水蒸氣蒸餾、超臨界二氧化碳萃取等方法提取得到天然香精——香草蘭揮發油，香草蘭揮發油具有濃郁的香氣和風味，是世界上最受歡迎的香料之一[5]。據聯合國糧食及農業組織統計，世界范圍內香草蘭種植面積約9.6萬hm2，總產量約7500 t，年進出口總量2000～3000 t，馬達加斯加和印度尼西亞的香草蘭種植面積占全球的85%，香草蘭在我國的種植主要分布在海南、云南、廣東等熱帶地區[6]。香草蘭除用作香料以外，還具有健胃、補腎、軟化血管以及促進腦功能改善等功效，其相關產品在國際上供不應求，目前主要在高檔食品、高檔化妝品等行業中已有廣泛應用，但是香草蘭揮發油水溶性差，容易受到氧氣、光照、溫度等條件的影響，限制了其應用范圍[7]。

由油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑組成的納米微乳液是一種穩定體系，粒徑在1～100 nm之間，與普通乳液相比，納米微乳液具有顆粒分布均勻、粒徑小、穩定性好等優點[8-9]。微乳技術對揮發油等水不溶性物質具有較強的增溶能力，可以有效改善其不溶于水、穩定性差等缺點，從而提高揮發油的利用率[10-11]。ALMASI等[12]制備了百里香精油微乳體系的海藻酸鈣抗菌膜，與百里香精油相比，該體系明顯提高了牛肉中食源性致病菌的抗菌活性，能夠有效延長食品的保質期。CHEN等[13]將白藜蘆醇制成納米微膠囊，該制劑比游離的白藜蘆醇具有更強的抗氧化能力、更低的細胞毒性以及更高的穩定性，可增強白藜蘆醇在心血管疾病方面的保健作用。EMTIAZI等[14]制備了千里耆精油的納米脂質體和納米囊泡，與千里耆精油相比，2種納米體系對乳腺癌細胞MCF-7均具有很好的細胞毒性，為乳腺癌提供了一種新穎、高潛力的治療方法。

香草蘭揮發油為黃色液體，具有穩定性差、揮發性強、不溶于水等特點，鑒于此，納米微乳液作為一種載體，可以改善揮發油的溶解度，提高香草蘭揮發油的穩定性及利用價值[10]。本研究以香草蘭揮發油為油相，采用自乳化法制備香草蘭揮發油納米微乳液，對制備工藝進行優化得到水包油型（O/W）納米微乳液，對制備的揮發油納米微乳液進行表征及穩定性評價，以提高香草蘭揮發油的應用范圍。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 供試材料" 香草蘭豆莢購自萊柏特芳香科技（成都）有限公司，為墨西哥香草蘭，通過烘干、粉碎、超臨界二氧化碳萃取得到香草蘭揮發油。

1.1.2" 主要試劑" Tween 40、Tween 60、Tween 80、甘油、丙二醇均為食品級，購自Roll Into One Emulsifier Co. Ltd.；無水乙醇（分析純）購自西隴科學股份有限公司；亞甲基藍（指示劑級）、蘇丹Ⅳ（分析純）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3" 儀器與設備" AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HJ-4恒溫磁力加熱攪拌器，江蘇金壇宏華儀器廠；Zetasizer nano ZS 90激光粒度分析儀，馬爾文儀器有限公司；CTI18RT臺式高速冷凍離心機，上海天美儀器科技有限公司；SynergyH1全波長掃描式多功能讀數儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" 香草蘭揮發油納米微乳液的制備" 采用自乳化法[15-16]制備香草蘭揮發油納米微乳液：將表面活性劑與助表面活性劑按一定質量比（Km）進行混合，再按照混合表面活性劑與揮發油質量比（S/O）1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進行混合，以400 r/min攪拌15 min，然后向體系中邊攪拌邊逐滴添加水相，直至最終形成澄清透明的納米微乳液[17]。

1.2.2" 偽三元相圖的繪制" 在滴加水相的過程中，觀察并記錄體系由渾濁到透明且不發生變化時的去離子水質量，計算香草蘭揮發油、去離子水、混合表面活性劑的質量百分比，用Origin 2021軟件繪制偽三元相圖，并計算微乳面積百分比。

1.2.3" 微乳配方的篩選" （1）表面活性劑的篩選。設定Km=2，以甘油為助表面活性劑，水相為去離子水，按照1.2.1的方法制備納米微乳液。

（2）助表面活性劑的篩選。設定Km=2，在1.2.3-（1）中篩選出來的表面活性劑的基礎上，按照1.2.1的方法制備納米微乳液。

（3）表面活性劑與助表面活性劑質量比（Km）的篩選。在1.2.3-（1）和1.2.3-（2）的基礎上，設定Km值為1、0.5、0.3、0.25、2、3、4，按照1.2.1的方法進行納米微乳液的制備。

1.2.4" 納米微乳液的表征及穩定性分析" （1）納米微乳液的外觀及粒徑。將制備的微乳樣品在室溫下平衡48 h，用激光粒度分析儀測定乳液粒徑和聚合物分散系數（PDI）以及Zeta電位，每個樣品重復測定3次。

（2）染色法鑒定納米微乳液的類型。取乳液置于透明玻璃瓶中，分別加入亞甲基藍（1.0 g/L）和蘇丹Ⅳ（1.0 g/L）染色液各2滴，于靜止狀態下觀察2種指示劑在納米微乳液中的擴散速度，若亞甲基藍快于蘇丹Ⅳ，說明制備的納米微乳液是水包油（O/W）型，反之為油包水型（W/O），二者的擴散速度相當則說明該納米微乳液為雙連續型[18]。

1.2.5" 納米微乳液穩定性評價" （1）離心穩定性。通過測定乳液的吸光度變化對乳液的離心穩定性進行評價，將制備的乳液于2000～10 000 r/min下離心30 min，觀察是否分層，在550 nm波長處檢測離心前后乳液的吸光度，透光率計算公式如下：

式中，A0為離心前吸光度，A1為離心后吸光度[19]。

（2）熱穩定性。采用水浴加熱法評價乳液的熱穩定性，于40～90 ℃條件下將乳液加熱30 min，在550 nm波長處檢測其加熱前后的吸光度，透光率計算公式如下：

式中，A2為加熱前吸光度，A3為加熱后吸光度[20]。

（3）貯藏穩定性。將納米微乳液置于4 ℃冰箱中保存30 d，每隔7 d在550 nm處測定樣品的吸光度，并計算納米微乳液貯藏前后的透光率，透光率計算公式如下：

式中，A4為貯藏前吸光度，A5為貯藏后吸光度。

1.3" 數據處理

采用Excel 2016軟件對試驗數據進行整理與統計，利用Origin 2021軟件繪制偽三元相圖，采用SPSS 27.0軟件進行差異顯著性分析（Plt; 0.05）。

2" 結果與分析

2.1" 表面活性劑的篩選

表面活性劑是微乳體系的重要組成之一，通過降低液體的表面張力促進乳液的形成[21]，而吐溫系列表面活性劑在食品、化妝品以及醫藥等行業應用廣泛[22]。通過分析表面活性劑對香草蘭揮發油微乳液形成的影響，結果表明，不同的表面活性劑與油相形成的狀態不同，甘油與Tween 40能夠與香草蘭揮發油在S/O（9∶1、8∶2）時形成澄清透明或半透明體系（表1）。當Km=2時，Tween 40納米微乳液面積比為2.44%，而表面活性劑Tween 60、Tween 80與香草蘭揮發油不能自發形成納米微乳液（圖1）。不同表面活性劑的親水親油平衡值（HLB）有差異，可將其作為制備微乳液選擇表面活性劑的參考。表面活性劑的HLB值通常介于8～18之間，在這個范圍內，表面活性劑的親水性與HLB值呈正比[23-24]。表面活性劑Tween 40的HLB值相對較大，且形成的微乳面積也最大（表2），因此，為了制備合適的水包油型（O/W）納米微乳液，選擇Tween 40作為表面活性劑。

2.2" 助表面活性劑的篩選

通過分析不同助表面活性劑對微乳液形成的影響，結果表明，丙二醇與Tween 40作為混合表面活性劑時與香草蘭揮發油更易形成澄清透明微乳液狀態（表3），形成的微乳區域最大（圖2）。不同助表面活性劑微乳區域面積百分比順序：丙二醇gt;無水乙醇gt;甘油（表4）。研究表明，助表面活性劑單獨使用不能構成穩定的微乳體系，但是與表面活性劑協同使用可進一步降低界面張力[25]。

2.3" 表面活性劑與助表面活性劑質量比（Km）的篩選

體系中表面活性劑和助表面活性劑的含量對微乳的形成具有重要影響。由表5可知，當Km為0.5、0.3、0.25時，只有S/O為9∶1時能夠形成微乳；Km為2時，S/O從9∶1～6∶4均能形成微乳。由圖3和表6可知，當Km為2時形成的微乳面積最大，為2.44%。Km值逐漸減小時，表面活性劑占比減小，油水界面張力減小導致表面活性劑基團之間吸引力降低，油相與表面活性劑作用不充分，使香草蘭揮發油納米微乳液形成穩定體系能力降低，導致微乳區域面積逐漸變小[26]。與之相反，Km值逐漸增大，助表面活性劑占比減少使其協同乳化作用降低，使微乳區域面積相對減少[27-28]。另外，Km為3、4時形成的微乳面積區域比Km為2的小，因此選擇Km為2的比例進行納米微乳液的制備。

2.4" 納米微乳液粒徑

微乳是一種熱力學穩定體系，液滴大小和粒徑分布是表征其物理穩定性的重要參數[29]。不同S/O的微乳粒徑如表7所示，在9∶1～6∶4之間，制備的納米微乳液粒徑均在10～100 nm之間，但9∶1比例制備的納米微乳液粒徑最小，為（16.75±0.06）nm。粒徑分布圖呈正態分布（圖4），表明S/O為9∶1時，形成的乳液粒徑主要分布在10～100 nm范圍且呈單峰分布，表明該乳液均一性較好。聚合物分散指數（PDI）是反映乳液粒徑是否均一的重要指標，PDI值越小表示粒徑分布越窄、分散性越好[30]。S/O在9∶1～6∶4之間時納米微乳液PDI均在0～1之間，S/O為9∶1時納米微乳液PDI最小，為0.240±0.003。另外，Zeta電位對乳液穩定性也具有重要的參考意義，其絕對值越大表明乳液的穩定性越好[31]。S/O為6∶4時，其納米微乳液的Zeta電位絕對值最大，但與9∶1的Zeta電位絕對值相差不大，且其粒徑和PDI均大于9∶1，而澄清透明程度低于9∶1；且9∶1的Zeta電位分布圖呈正態分布（圖5），表明制備的乳液粒徑分布均勻穩定性較好。綜上選擇S/O為9∶1進行納米微乳液的制備。

2.5" 納米微乳液類型的鑒定

本研究采用染色法鑒定納米微乳液的類型，該方法是根據相似相溶原理進行判斷的，是一種比較直觀且方便判斷乳液類型的方法。結果表明，亞甲基藍在乳液中的擴散速度明顯快于蘇丹Ⅳ（圖6），表明制備的納米微乳液為O/W型。O/W型納米微乳液在不改變其結構的前提下能夠被水無限稀釋，因此O/W型納米微乳液的應用價值比W/O更高。

2.6" 納米微乳液穩定性評價

穩定性評價是微乳體系質量特性中的重要部分，對微乳的應用范圍、有效期及儲存條件具有重要影響。考慮到納米微乳液的應用范圍和周期性，需要對其穩定性進行評價。本研究中對制備的香草蘭納米乳液主要從離心穩定性、熱穩定性以及儲藏穩定性3個方面進行考察，從而為其實際應用提供參考價值。

2.6.1" 離心穩定性" 評價納米微乳液穩定性的傳統方法是將納米微乳液在一定條件下放置一段時間，觀察其分層現象，但是此法耗時長。而利用離心機對納米微乳液進行離心處理可以非常方便快捷地測定納米微乳液的穩定性。通過測定乳液在2000～10 000 r/min條件下離心前后的吸光度變化來考察納米微乳液體系的穩定性[32-33]。結果表明，香草蘭揮發油納米微乳液在不同的離心速率條件下，依然保持澄清透明，均未出現分層現象，其透光率均在100%以上，且在測試的離心條件下，制備的乳液透光率無顯著性差異（圖7），表明離心過程中微乳的顆粒聚集程度非常低，表明制備的乳液具有較好的離心穩定性。

2.6.2" 熱穩定性" 溫度對吐溫系列乳化劑的溶解度有重要影響，因此有必要考察制備的納米微乳液的熱穩定性。通過測定乳液在不同溫度下水浴加熱前后的吸光度來反映乳液的熱穩定性，為其應用實際提供依據[34]。乳液在不同水浴溫度下的透光率如圖8所示，在40～90 ℃范圍內，香草蘭揮發油納米微乳液均未出現渾濁或分層，其透光率均在100%以上，表明制備的乳液在測試溫度范圍內具有很好的穩定性。但是當溫度超過80 ℃后，乳液的透光率顯著提高，與40～70 ℃條件下乳液的透光率差異顯著，可能是由于表面活性劑在高溫條件下促進了油水的進一步混合使乳液透光率提高。

2.6.3" 貯藏穩定性" 納米微乳液的穩定性與產品的最終質量密切相關，而貯藏穩定性是考察乳液是否穩定的重要環節。新制備的納米微乳液在體系中是均一的，在貯藏過程中由于重力作用一般會出現分層或者乳析等現象。因此納米微乳液的貯藏穩定性是評價納米微乳液是否穩定的重要依據[35]。

將所制備的乳液置于4 ℃冰箱中貯藏30 d，乳液在不同貯藏時間的透光率如圖9所示，在整個貯藏過程中，香草蘭揮發油納米微乳液均保持澄清透明，未出現分層或渾濁現象。在4 ℃貯藏條件下，揮發油納米微乳液的透光率均在94%以上，說明香草蘭揮發油納米微乳液在4 ℃低溫條件下具有較好的穩定性。隨著貯藏時間的延長，乳液的透光率有所降低，出現該情況的原因可能是Tween 40在低溫條件下析出使乳液出現渾濁，致使乳液的透光率降低。

3" 討論

植物揮發油是芳香植物和藥用植物的固有成分，富含生物活性，但是受揮發油的高疏水性，在水介質中溶解度差及其高揮發性導致遞送行為不受控制等限制，揮發油的應用范圍仍然很窄，針對以上限制因素，微乳技術可以提供相應解決方案以提高揮發油的穩定性和生物活性[36-37]。在本研究中，制備的香草蘭乳液具有較好的離心穩定性、熱穩定性以及貯藏穩定性，提高了香草蘭揮發油的穩定性，有利于香草蘭揮發油的進一步開發利用。微乳技術可應用于多種植物精油，以改善其穩定性和生物活性，尤其在改善天然香辛料精油的穩定性等方面應用廣泛。如通過超聲剪切制備肉桂精油納米微乳液，在離心、凍融、加熱-冷凍等條件下肉桂精油納米微乳液均未出現分層、乳析等現象，粒徑及PDI變化幅度較小，具有很好的穩定性[38]。楊菲等[39]制備的柳葉蠟梅精油乳液對熱、pH具有良好的穩定性以及抗氧化活性，另外對大腸桿菌等食源性致病菌具有良好的抑菌活性，有助于柳葉蠟梅精油的進一步開發應用。將精油制成乳液不僅可改善精油穩定性和水溶性差的缺點，還可以拓展其應用范圍，如張坤[40]制備的薄荷精油乳液用于果樹病蟲害的防治，以乳液的形式進行應用解決了精油揮發性強導致的病蟲防治效果差的問題。目前，對不同來源的揮發油輔以表面活性劑、助表面活性劑構建乳化體系也可提高揮發油的穩定性，使揮發油的應用范圍更廣泛。

納米乳液作為一種遞送系統，在營養物質的運輸方面具有一定的優勢，但是也存在一定的安全問題。表面活性劑作為納米乳液的基本組成成分之一，其主要作用是降低油水界面的張力，而表面活性劑在兩相界面之間存在吸附和解吸附的動態平衡過程，加之納米乳液的粒徑較小意味著比表面積較大，因而制備納米乳液需要使用較多的表面活性劑[41-42]。雖然表面活性劑應用普遍，但是也存在一定潛在危害。過量的表面活性劑會造成體系不穩定并降低生物活性，JIMENEZ- ESCOBA等[43]在制備類胡羅卜素納米乳液時，研究了表面活性劑對小鼠肝臟的影響，結果表明Tween 40能夠促進丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸轉移酶等生物標志物的增加從而對小鼠的肝臟造成損傷。KERWIN[44]通過研究認為，Tween 20和Tween 80可以發生自氧化和水解，導致酸和氫過氧化物的形成，將其用于生物制藥產品中可能容易產生氧化應激的易感性。Tween系列表面活性劑對人類健康存在一定危害，而天然表面活性劑，如大豆卵磷脂等在一定程度上可以代替人工合成的表面活性劑，但是其乳化能力低于人工合成的表面能活性劑，同時目前制備納米乳液還無法完全摒棄人工合成的表面活性劑，這將為乳液的制備以及安全性帶來一定挑戰。

本研究通過繪制偽三元相圖考察活性劑對香草蘭揮發油乳液形成的影響，制備了香草蘭揮發油納米微乳液，通過微乳技術提高了香草蘭揮發油的穩定性，解決了香草蘭揮發油水溶性差、利用率低等方面的問題，擴大了香草蘭揮發油在食品領域的應用范圍。但是，本研究僅對制備的香草蘭揮發油納米微乳液的穩定性進行了研究，今后應對其他生物活性，如抗氧化、抗菌等活性進行重點研究。

4" 結論

本研究通過將香草蘭揮發油制備成納米微乳液，并對香草蘭揮發油納米微乳液進行表征及穩定性評價，結果表明，香草蘭揮發油納米微乳液最佳組成為Tween 40、丙二醇，Tween 40與丙二醇的質量比為2，混合表面活性劑與油相的質量比為9∶1，可得到O/W型香草蘭揮發油納米微乳液，納米微乳液的粒徑為（16.75±0.06）nm，聚合物分散系數（PDI）為0.240±0.003，Zeta電位為（–3.15±0.46）V。制備的香草蘭揮發油納米微乳液在離心、加熱以及4 ℃低溫條件下具有良好的穩定性。本研究初步測定了制備的香草蘭揮發油乳液的表征及穩定性，在后續研究中可通過對制備的香草蘭揮發油乳液進行更系統的結構和性質測定，以期進一步擴大其應用范圍。另外在乳液中還可以添加一些功能性物質，以擴大或者改善乳液的生物活性，制備更加實用的納米乳液。

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