叉頭盒E1 基因與中國漢族人群非綜合征型唇腭裂的關聯研究

[摘要] 目的 探究叉頭盒E1 （FOXE1） 基因所在單倍型區域hg19 chr9：100560865-100660865 附近的單核苷酸多態性（SNPs） 位點與中國西部漢族人群非綜合征型唇腭裂（NSCL/P） 發生的相關性。方法 第一階段納入159 名NSCL/P 患者，采用目標區域捕獲測序的方法，擬篩查FOXE1 基因所在單倍型區域附近與NSCL/P 發生相關的SNPs 位點。第二階段，選擇21 個常見SNPs 位點，在1 000 名非綜合征型單純唇裂（NSCLO） 患者，1 000 名非綜合征型單純腭裂（NSCPO） 患者和1 000 名正常對照樣本中進行驗證。使用PLINK軟件對研究人群進行哈迪-溫伯格平衡（HWE） 分析，對常見變異進行關聯分析，對罕見變異進行基因負荷分析并使用MutationTaster 等軟件對非同義突變的SNPs 進行功能預測。結果 第一階段，共篩選出126 個變異位點，包括76 個SNPs 變異位點和50 個插入/缺失。納入的所有SNPs 在研究人群中遵循HWE。對篩選出的罕見變異進行功能有害性預測和基因負荷分析，差異均無統計學意義；對常見變異的關聯分析表明，FOXE1 基因的rs13292899 位點與NSCL/P 發生顯著相關（P=1.85E-27），并且該位點與NSCLO （P=6.41E-23）、NSCLP （P=2.36E-15） 發生也有相關性。隨后在驗證階段，發現rs79268293 （P=0.013，P=0.022）、rs10983951 （P=0.009 2，P=0.007 6）、rs117227387 （P=0.009 2，P=0.007 6）、rs3758250 （P=0.009 2，P=0.007 6） 和rs116899397 （P=0.009 2，P=0.007 6），這5 個SNPs 位點與NSCLO和NSCPO均有顯著關聯性；另外，rs13292899 （P=0.008 5）、rs74606599（P=0.008 3）、rs143226042 （P=0.008 3） 和rs117236550 （P=0.01）， 這4 個SNPs 位點與NSCLO 發生相關；rs12343182 （P=0.008 7）、rs10119760 （P=0.012）、rs10113907 （P=0.012） 和rs13299924 （P=0.012）， 這4 個SNPs 位點與NSCPO 發生相關。結論 本研究在FOXE1 基因上發現了一個新的易感SNPs 位點rs13292899 與NSCL/P 及NSCLO發生密切相關，以及其他13 個SNPs 位點與NSCLO或NSCPO發生相關。

[關鍵詞] 非綜合征型唇腭裂； 叉頭盒E1 基因； 目標區域捕獲測序； 單核苷酸多態性； 關聯分析

[中圖分類號] Q786 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2024.2024110

唇腭裂（cleft lip with or without palate，CL/P）是由于胚胎發育過程中面部各胚突聯合或融合失敗出現唇部、鼻部、腭部裂開，是一類常見的先天出生缺陷[1]。其流行病學特征已在歐洲、北美、亞洲等人群進行了廣泛的研究，并且在不同國家、地區和種族間其發病率差異存在統計學意義，其中我國CL/P 的發病率約為1.8‰[2-5]。約70%的CL/P 患者不合并顱面部及身體其他部位畸形，稱為非綜合征型唇腭裂（non-syndromic cleft lip with orwithout cleft palate，NSCL/P），是一種協同環境因素共同致病的多基因遺傳病[2-5]。NSCL/P 患者從出生到成年期間需要接受多學科綜合序列治療，并且美觀、功能等方面的缺陷將影響患者的生活質量和身心健康[4-6]。因此，研究NSCL/P 發病機制，通過有效的產前科普、咨詢、遺傳篩查等來降低NSCL/P 的發病率是必要的。

目前的研究尚不能完全解釋NSCL/P 的發病機制，尤其是在遺傳因素方面。全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS） 基于大樣本人群篩查疾病的易感基因，提高了對這一類多基因遺傳病突變的檢測能力。GWAS 具有高效率、敏感性和廣泛性等優勢，為研究人員定位和篩選疾病的易感基因和染色體區域提供了有效的指導[7]。研究至今，NSCL/P 的易感基因位點和染色體區域不斷被發現和驗證[4-16]。Grosen 等[17]認為NSCL/P 和非綜合征型單純腭裂（non-syndromiccleft palate only，NSCPO） 具有很高的遺傳性，其遺傳力都在90%以上；另外NSCL/P 的陽性家族史也是其發病的高危風險因素；其余為有害環境因素或兩者協同作用的結果。研究[18]證實環境因素，如孕期吸煙、飲酒、服用藥物、葉酸缺乏、流產史、病毒感染、接觸有毒物質等因素均可增加NSCL/P 的發生風險，而葉酸等維生素的補充、適齡生育、高等教育背景等是NSCL/P發生的保護因素。

Marazita 等[19]發現叉頭盒E1 （forkhead box E1，FOXE1） 基因單核苷酸多態性（single nucleotidepolymorphisms，SNPs） 與NSCL/P 發病密切相關，為探索NSCL/P 發病機制提供了新思路。FOXE1基因，又名甲狀腺轉錄因子-2 （thyroid transcriptionfactor 2，TTF-2），位于9 號染色體長臂22 區，包括一個DNA結合叉頭結構域，其唯一的外顯子編碼367 種特殊氨基酸，并翻譯成50 多種功能蛋白，參與組織特異性轉錄過程，在真核生物中調節多種組織和器官的生長發育[20-24]。研究[20，23-24]發現FOXE1 基因與多種先天出生缺陷發生密切相關，如甲狀腺發育不全、頭發生長異常、唇腭裂等。2009 年Moreno 等[25]研究表明FOXE1 基因與NSCL/P 及其NSCPO 亞型發生顯著相關。隨后，在不同人群中陸續報道了FOXE1 基因或其附近的位點與NSCL/P 發生的相關性[26-28]，但是部分研究結果不一致，需要進一步的驗證。

目前尚無研究[29]表明FOXE1 基因SNPs 位點與中國西部漢族人群NSCL/P 發生有相關性。因此，本研究基于人類基因組單體型計劃數據庫中的中國北京漢族人群和日本東京人群（CHB/JPT） 的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD） 結構，選擇了FOXE1 基因的單倍型區域hg19 chr9：1005608-65-100660865 進行目標區域捕獲測序，篩查更多易感SNPs 位點。本研究將檢出率在95%以上的變異點，按照其最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF），分為常見變異（MAF≥0.01） 和罕見變異（MAFlt;0.01） 兩類，使用PLINK軟件對納入的SNPs 位點在研究人群中進行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE） 檢驗，并且對常見變異進行關聯分析，對罕見變異進行基因負荷分析并預測其有害性。后期納入1 000 名非綜合征型單純唇裂（non-syndromic cleft lip only，NSCLO）患者、1 000 名NSCPO患者和1 000 名正常對照（驗證樣本的基因型數據從2019 年GWAS 中提取[30]），驗證FOXE1 基因常見變異與NSCL/P 發生的關聯。

1 材料和方法

1.1 研究對象

第一階段納入來自四川大學華西口腔醫院唇腭裂外科病房2016 年2 月—2018 年12 月期間就診的患者，共159 例NSCL/P 患者，其中79 例NSCLO患者和80 例非綜合征型唇裂伴腭裂（non-syndromiccleft lip with cleft palate，NSCLP） 患者（表1）。NSCL/P 均來自中國西部地區漢族人群，符合NSCL/P 診斷標準，并納入來源于諾禾致源數據庫的542 名正常人的全基因組測序數據作為對照。第二階段納入1 000名NSCLO、1 000名NSCPO和1 000名正常對照的基因型數據進行驗證（驗證樣本的基因型數據從2019 年GWAS 中提取[30]）（表1）。

該研究經四川大學華西口腔醫院倫理委員會批準，所有研究對象在簽署知情同意書后，由護士抽取外周靜脈血2～5 mL，以EDTA-Na2 抗凝管收集血液，轉移至實驗室，放置于?20 ℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 全基因組DNA提取

采用鹽析法提取基因組DNA，檢測DNA樣本純度與濃度（純度OD260/OD280在1.8～2.0 之間，并且標準實驗濃度為20～100 ng/μL 為合格） 均符合質量要求，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測為合格樣本，方可納入研究使用。

1.2.2 目標區域捕獲測序

基于人類基因組單體型計劃HapMap 數據庫中的中國北京漢族和日本東京人群（CHB/JPT） 的LD結構，選擇了位于hg19 chr9：100560865-10066-0865 位置的FOXE1 基因的單倍型區域（圖1） 擬進行目標區域捕獲測序。按照測得的樣本濃度，抽取含1.0 μg DNA 樣本的TE buffer，使用AgilentSureSelect Target Enrichment System 探針試劑盒富集并有效捕獲DNA樣本目標序列。目標序列的測序則由Illumina Hiseq 4000 平臺完成，測序模式為雙末端150 bp 測序。

1.2.3 生物學信息分析

目標區域捕獲測序分析的對照組來源于諾禾致源基因公司（http：//www.novogene.com） 提供的542 名中國漢族正常人的全基因組測序數據。測序數據由Burrows-Wheeler Aligner （BWA） 軟件與參考基因組（GRCh37/hg19） 進行比對，即可得到BAM格式的原始比對結果，即清樣數據?；讷@得的雙端測序數據質量控制過濾得到的數據進行生物信息學分析。通過與大量數據庫，如外顯子組整合聯合數據庫（exome aggregation consortium，ExAC）、寡核苷酸多態性數據庫（single nucleotidepolymorphism database，dbSNP）、CADD 數據庫、千人基因組數據庫（1000 genome）、人類基因突變數據庫（human gene mutation database，HGMD）等進行比對，最終獲得了包括突變位點位置、突變類型等相關信息。此外，對于位于外顯子區域的變異，通過與相關的基因轉錄注釋數據庫對比，即可確定突變引起的核酸改變。本研究使用Mutation Taster、PolyPhen-2、SIFT、CADD等軟件對非同義突變的SNPs 進行了功能預測，以初步判斷突變的有害性。

1.2.4 常見SNPs 位點的基因型測定

對目標區域捕獲測序的關聯分析階段所發現的常見SNPs 位點（Plt;0.05），總共選擇21 個SNPs位點納入后續的驗證性研究（樣本基因型數據來自2019 年GWAS 中[30]）。

1.3 數據分析

1.3.1 HWE分析

使用PLINK 軟件對研究人群進行HWE 檢驗，如果符合HWE，可證明該研究樣本具有群體代表性，可以用來反映群體的可信性較高。

1.3.2 關聯分析和基因負荷分析

基于以下標準來篩選罕見變異：在1000 Genome數據庫、諾禾致源中國北京漢族人群和中國南方漢族人群（CHB amp; CHS） 數據庫中MAF 小于0.01 的變異，或者在基因組突變頻率數據庫（gnomAD）中MAF 小于0.001 的變異。對選出的罕見變異，使用PLINK Fisher 精確檢驗進行基因負荷分析； 使用PolyPhen-2、SIFT、Mutation Taster、CADD 軟件來預測非同義突變是否為有害突變。使用PLINK 軟件對常見變異進行關聯分析，通過非條件logistic 回歸分析計算比值比（odds ratio，OR） 和95%置信區間（confidence intervals，CI），以評估納入研究的SNPs 位點與NSCL/P 及其亞型發生風險之間的相關性。第一階段，多重校正后Plt;3.97E-04 差異具有統計學意義；第二階段，多重校正后Plt;0.025 差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 測序結果和HWE分析

本研究共篩選出126 個變異位點，包括76 個SNPs 變異位點和50 個插入/缺失。其基因型頻率在研究人群中測量值和期望值差異無統計學意義（標準：HWE 值gt;0.001），結果遵循HWE，說明選取的研究樣本具有較好的群體代表性。只有通過質量控制（HWE值gt;0.001 并且與1 000 個基因組的CHB數據一致） 的SNPs 位點才被納入后續的關聯分析。

2.2 關聯分析

2.2.1 第一階段

關聯分析研究結果表明：NSCLO組與對照組相比較：位點rs13292899 差異有統計學意義（P=6.41E-23），其余SNPs 位點差異無統計學意義，說明rs13292899 與NSCLO的發生具有相關性（圖2、表2）；NSCLP 組與對照組相比較：rs13292899 差異有統計學意義（P=2.36E-15），其余SNPs 位點差異無統計學意義，說明rs13292899 與NSCLP 的發生有相關性（表2、圖3）；NSCL/P 組與對照組相比較：rs13292899 差異有統計學意義（P=1.85E-27），其余SNPs 位點差異無統計學意義，說明位點rs13292899 與NSCL/P 的發生有相關性（表2、圖4）。所以第一階段的關聯分析，發現rs13292899 位點與NSCL/P、NSCLO 和NSCLP 亞型發生均有相關性，差異有統計學意義。

2.2.2 基因負荷分析

對罕見變異進行了基因負荷分析，結果顯示差異無統計學意義（Pgt;0.05），沒有發現與NSCL/P 具有相關性的罕見變異位點，并且在非同義突變功能預測中沒有發現有害突變。

2.2.3 驗證階段

研究發現，rs79268293 （P=0.013，P=0.022）、rs10983951 （P=0.009 2，P=0.007 6）、rs117227387（P=0.009 2，P=0.007 6）、rs3758250 （P=0.009 2，P=0.007 6）和rs116899397 （P=0.009 2，P=0.007 6），這5 個SNPs 位點與NSCLO 和NSCPO 均有顯著關聯性。另外，rs13292899 （P=0.008 5）、rs746065-99 （P=0.008 3）、rs143226042 （P=0.008 3） 和rs-117236550 （P=0.01），這4 個SNPs 位點與NSCLO發生相關。另外，rs12343182 （P=0.008 7）、rs101-19760 （P=0.012）、rs10113907 （P=0.012） 和rs13-299924 （P=0.012），這4 個SNPs 位點僅與NSCPO發生關聯（表3）。

3 討論

FOXE1 基因屬于哺乳動物叉頭盒（forkheadbox，FOX） 轉錄因子家族的一員，包含一個與胚胎生長發育特異性相關的DNA 結合域[22-24]；作為一種功能性轉錄因子，通過激活其他相關轉錄因子共同參與真核生物的生長發育[24]。研究[25，31-32]指出在小鼠胚胎發育期間，FOXE1 基因在甲狀腺原基、顱咽部外胚層、前腸內胚層等均能檢測到表達。在小鼠胚胎10.5～11.5 d 時，FOXE1 基因在口咽上皮中有特異表達，這種轉錄因子模式在側鼻突和上頜突融合形成上唇過程中特別重要；在13.5～15.5 d 時，FOXE1 基因在繼發性腭上皮中也有差異表達[25]。FOXE1 轉錄因子可以通過其靶基因msh 同源框1 （msh homeobox 1，MSX1） 和轉化生長因子β3 （transforming growth factor beta 3，TGFβ3） 直接參與胚胎的成長發育，也可以通過其他信號通路間接參與胚胎的生長發育[33]。以上研究說明FOX-E1 基因在胚胎顱面部發育過程中起著極為重要的作用。另外，也有研究[32-35]表明FOXE1 基因突變可能導致Bamforth Lazarus 綜合征，其特征性臨床表現以先天性甲狀腺功能減退、腭裂表型、毛發異常和后鼻孔閉鎖最為顯著，這也提示FOXE1 基因參與了胚胎組織分化生長相關的調控通路。

2004 年Marazita 等[19]基于NSCL/P 大家系全基因組連鎖研究發現，人類基因組9 號染色體長臂22～33 區（即FOXE1 基因所在染色體區域） 與NSCL/P 發生有顯著相關性。2014 年Ludwig 等[20]研究證明了FOXE1 基因是北歐人群NSCL/P 發病的候選基因。許多研究者[36-39]在不同人群中報道了FOXE1 基因或其附近的位點與NSCL/P 發生的相關性，但是部分研究結果存在不一致性，需要進一步的驗證。Lennon 等[36]研究指出，FOXE1 基因位點rs3758249 與哥倫比亞人群NSCPO 亞型發生顯著相關。Nikopensius 等[37] 報道了FOXE1 基因rs7860144 位點與東歐人群NSCL/P 發生有相關性。Xie 等[38] 研究證實FOXE1 基因rs1867277 位點是NSCL/P 發生的易感位點。另外，在2020 年一項薈萃分析中表明，FOXE1 的rs4460498 位點與NSCL/P 發生有相關性；rs4460498 位點的TT 基因型與NSCL/P 發生的相關性比CC、CT 基因型顯著；rs-10217225 的TT 基因型與NSCL/P 發生風險增高有顯著相關性[39]。以上研究表明FOXE1 基因是NSCL/P 發生的重要候選基因。

本研究在針對FOXE1 基因單倍型區域捕獲測序中發現，位點rs13292899 與NSCLO （P=6.41E-23）、NSCLP （P=2.36E-15） 和NSCL/P （P=1.85E-27） 均有相關性。此次研究表明FOXE1 基因rs13292899 位點與中國西部漢族人群中NSCL/P 及其亞型發生有相關性，即FOXE1 基因rs13292899位點是NSCL/P 發生的新易感位點。以往研究[25]表明，位于FOXE1 基因附近LD 區域內的rs3758249和rs4460498，這2 個SNPs 位點與歐洲人群NSCL/P 和NSCPO發生有顯著相關性；并且這2 個SNPs位點與中歐人群和中美人群NSCL/P 發生也有密切關系[39]。此外，Yin 等[40]選擇了FOXE1 基因3 個SNPs 位點在中國人群（602 名病例和605 名對照）中進行關聯研究，發現FOXE1 基因的rs7043516位點增加了NSCLO 發生的風險。此外，Lammer等[21]通過對加州人群的病例對照研究指出，FOXE1基因的多態性增加了包括NSCLO、NSCPO 和NSCLP 亞型在內的NSCL/P 發病的風險。以上研究進一步證實了FOXE1 基因是NSCL/P 的易感基因。

第二階段在1 000 名NSCLO、1 000 名NSCPO和1 000 名正常對照樣本中進行驗證研究（驗證樣本的基因型數據從2019 年GWAS 中提取[30]），發現rs13292899 位點在NSCLO組仍然表現出統計學相關性（P=0.008 5，OR=0.85，95%CI：0.73～1），而在NSCPO組沒有統計學差異（P=0.032，OR=0.83，95%CI：4.99～0.98）。筆者得出結論，FOXE1 基因的rs13292899 位點與NSCLO發生有關。由于不同的胚胎發育機制，各SNPs 位點對NSCL/P 發生的貢獻程度不同。猜測rs13292899 位點對于NSCLO的發生貢獻大于NSCPO，在NSCLO 發生中顯著性更強。另外，在驗證分析中，也發現rs79268293（P=0.013，P=0.022）、rs10983951 （P=0.009 2，P=0.007 6）、rs117227387 （P=0.009 2，P=0.007 6）、rs3758250 （P=0.009 2，P=0.007 6） 和rs116899397（P=0.009 2，P=0.007 6），這5 個SNPs 位點不僅與NSCLO 發生相關，而且與NSCPO 發生相關。另外，研究結果也發現rs13292899 （P=0.008 5）、rs-74606599 （P=0.008 3）、rs143226042 （P=0.008 3）和rs117236550 （P=0.01），這4 個SNPs 位點與NSCLO發生相關；rs12343182 （P=0.008 7）、rs1011-9760 （P=0.012）、rs10113907 （P=0.012） 和rs13-299924 （P=0.012） 僅與NSCPO 發生相關。以上研究結果說明了FOXE1基因是NSCL/P發生的重要基因，也表明了不同的SNPs 位點對于NSCL/P 各亞型發生的貢獻程度有差異，所以與疾病發生的相關性有明顯的差異。同樣，2019 年Huang 等[30]基于中國人群GWAS 研究指出NSCL/P 各個亞型的易感基因位點是不同的，并提出了一個有趣的觀點：IRF6 基因在NSCLO 和NSCPO 發生中具有相反的作用，原因是IRF6 基因的表達量有顯著性差異。這一觀點與本研究中NSCL/P 各個亞型的易感基因位點有差異是一致的。

綜上所述，本研究在中國西部漢族人群中通過關聯研究的方法，在FOXE1 基因上發現了一個新的易感SNPs 位點rs13292899 與NSCL/P 及NSCLO亞型發生密切相關，以及其他13 個與NSCLO或NSCPO 相關的SNPs 位點，補充和完善了中國西部漢族人群唇腭裂易感基因數據庫資料，但是對于發現的新的易感位點的功能有待進一步驗證。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 杜冰）

[基金項目] 國家自然科學基金面上項目（82170919）；四川大學華西口腔醫院交叉項目（RD-03-202301）；四川省科技廳自然科學基金面上項目（2024NSFSC0649）