基礎治療對重度牙周炎患者齦溝液內中性粒細胞胞外誘捕網形成的影響研究

[摘要] 目的 探討基礎治療對重度牙周炎患者齦溝液（GCF） 內中性粒細胞胞外誘捕網（NETs） 水平的影響，并分析影響NETs 形成的因素。方法 納入Ⅲ～Ⅳ期牙周炎患者31 例，初診及基礎治療后6～8 周，記錄牙周臨床指標菌斑指數（PLI）、牙齦指數（GI）、探診深度（PD） 和臨床附著喪失（CAL），采用免疫熒光技術檢測GCF 內NETs 水平，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR） 檢測齦下非附著菌斑中總菌、牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）、伴放線菌團聚桿菌（A. actinomycetemcomitans） 和中間普雷沃菌（P. intermedia） 數量，酶聯免疫吸附試驗檢測GCF 中腫瘤壞死因子-α （TNF-α） 和白細胞介素-8 （IL-8） 水平，并分析NETs 水平與上述指標的相關性。結果 基礎治療后，GCF 內NETs 水平，PLI、GI、PD、CAL等牙周臨床指標，總菌、P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans及P. intermedia 數量，IL-8 及TNF-α 水平均顯著下降（Plt;0.05）。GCF 內NETs 水平與PLI、GI、PD、CAL、TNF-α、IL-8 水平，總菌和P. gingivalis 數量存在高度正相關性（Plt;0.05）。結論 基礎治療能降低重度牙周炎患者GCF 中的NETs 水平，后者的形成可能與P. gingivalis 數量和GCF 中TNF-α、IL-8 水平相關。

[關鍵詞] 牙周炎； 基礎治療； 齦溝液； 中性粒細胞胞外誘捕網

[中圖分類號] R781.4 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2024.2024162

牙周炎是一種微生物相關，宿主介導并導致牙周附著喪失的炎癥[1]。牙周支持組織破壞是包括牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）、伴放線菌團聚桿菌（Aggregatibacteractinomycetemcomitans，A. actinomycetemcomitans）和中間普雷沃菌（Prevotella intermedia，P. intermedia）在內的牙周致病菌的直接破壞和宿主的免疫損傷共同作用的結果。中性粒細胞是抵御牙周致病菌入侵的重要防線，其過度活化在牙周免疫破壞中發揮了重要作用[2]。

2004 年，Brinkmann 等[3]發現了一種新的殺菌方式，即中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellulartraps，NETs），它是一種以DNA 為骨架，鑲嵌彈性蛋白酶、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組織蛋白酶G等多種抗菌顆粒蛋白的胞外纖維網狀結構，可捕獲并殺死入侵致病微生物。NETs 參與了牙周炎的發生發展過程。Jiang等[4]在齦上菌斑生物膜中檢測到了NETs，Vitkov等[5]通過掃描電鏡觀察證實牙周炎患者的齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF） 中存在NETs。Magán-Fernández 等[6]在牙周炎患者和齦炎患者的牙齦組織中均檢測到了NETs，并發現齦炎患者的NETs數量更多，可能與炎癥急性期有關。齦溝/牙周袋是中性粒細胞抵御牙周致病菌入侵的前沿，其內的NETs 可直接捕獲，并清除入侵致病微生物，控制牙周感染，與牙周免疫炎癥反應的關系更為密切[7]。目前，關于牙周炎患者GCF 中NETs 水平的研究仍不充分。

本研究擬觀察牙周基礎治療前后，Ⅲ～Ⅳ期牙周炎患者GCF 中NETs 水平的變化，并評估后者與牙周臨床指標、齦下菌斑中P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans、P. intermedia 等牙周致病菌數量，以及GCF 腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-8 （interleukin-8，IL-8） 水平的相關性，以明確基礎治療對GCF中NETs形成的影響以及與NETs 水平相關的臨床與微生物學因素。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

標準菌株P. gingivalis ATCC 33277、A. actinomycetemcomitansATCC 29523 和P. intermedia ATCC25611 由口腔疾病研究與防治國家級重點實驗室培育建設點保種并提供。腦心浸液（brain heartinfusion，BHI） 培養基（Gibco Life Sciences 公司，美國），DNA提取試劑盒及PCR反應相關試劑（Ta-KaRa Biotechnology 公司，日本），TaqMan 探針及PCR 引物（南京驥驁生物技術有限公司），IL-8、TNF- α 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA） 試劑盒（上海愛必信生物科技有限公司），抗MPO 抗體（Abcam Plc 公司， 美國），ACLAR （Honeywell International 公司，美國）。

1.2 樣本納入

本研究經南京醫科大學附屬口腔醫院倫理委員會批準（批準號：PJ 2022-176-001），并取得所有納入者知情同意。納入2022 年5 月—2023 年12月于南京醫科大學附屬口腔醫院牙周病科就診的Ⅲ～Ⅳ期牙周炎患者31 例。牙周炎診斷標準依據2018 年牙周病和植體周病國際新分類，具體如下：1） 口內留存牙≥20 顆；2） 6 個月內未行牙周治療；3） 3 個月內未服用非甾體類抗炎藥或抗生素；4）沒有與牙周炎相關的系統性疾病，如糖尿病、高血壓、類風濕性關節炎等；5） 不在正畸治療期間；6） 無吸煙史；7） 非妊娠或哺乳期婦女。采樣牙納入標準為：1） PD≥5 mm；2） 無齲齒或牙頸部非齲性缺損；3） 無冠修復體或充填體；4） 鄰牙及采樣牙無扭轉、錯位。

1.3 臨床檢查

初診時，記錄性別、年齡等一般信息，拍攝全口曲面體層片。初診及基礎治療后6～8 周，進行全口牙周檢查，記錄牙周臨床指標，包括菌斑指數（plaque index，PLI）、牙齦指數（gingival index，GI）、探診深度（probing depth，PD） 和臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）。所有受試者接受牙周基礎治療，包括口腔衛生指導、齦上潔治、齦下刮治及根面平整。PLI 根據牙面菌斑的厚度記分而不根據菌斑覆蓋面積記分：0=齦緣區無菌斑；1=齦緣區的牙面有薄的菌斑，但視診不可見，若用探針尖的側面可刮出菌斑；2=在齦緣或鄰面可見中等量菌斑；3=齦溝內或齦緣區及鄰面有大量菌斑。GI：0=牙齦健康；1=牙齦輕度炎癥：牙齦的色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血；2=牙齦中等炎癥：牙齦色紅，水腫光亮，探診出血；3=牙齦嚴重炎癥：牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動出血傾向。

1.4 樣本收集

初診及基礎治療后6～8 周，采集齦溝內NETs，方法[8]如下：將預涂聚d-賴氨酸的ACLAR 膜裁剪為1.5 mm×15 mm。選取牙周袋寬而深的2 個位點采集NETs。采樣前，棉卷隔濕采樣區域，去除大塊齦上牙石，將ACLAR條帶插入牙周袋底，直至感覺輕微阻力，放置30 s 取出，置于4%多聚甲醛中，4 ℃保存備用。在全口余留位點中，紙捻法采集PD≥5 mm 的18 個位點的齦下非附著菌斑及GCF，?80 ℃保存備用。

1.5 GCF 中NETs 的免疫熒光檢測

將ACLAR膜用4%多聚甲醛固定20 min，0.5%TritonX-100 透化20 min；2%BSA 封閉30 min；加入抗人MPO 抗體（1∶300），4 ℃孵育過夜，加入Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔熒光二抗（1∶100），室溫避光孵育2～3 h，加入DAPI 染色液，避光孵育2 min，加入抗熒光猝滅劑后，熒光顯微鏡下觀察NETs 結構，隨機挑選5 個視野，計算每個視野中形成NETs 的細胞占視野內總細胞數的百分比。

1.6 總菌、P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans和P. intermedia 數量的檢測

將對數生長期的P. gingivalis ATCC 33277、A.actinomycetemcomitans ATCC 29523 和P. intermediaATCC 25611 接種至BHI 液體培養基中增菌24～72 h，收集（1.0～5.0） ×109 CFU 細菌，提取16SrDNA，用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應（realtimequantitative polymerase chain reaction，qPCR）標準曲線制備。從齦下非附著菌斑樣本中提取16S rDNA，采用TaqMan 探針法定量總菌、P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans 和P. intermedia數量。qPCR 反應過程如下：95 ℃、30 s 預變性；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s；50 ℃冷卻30 s，共40 個循環。所用探針和引物序列見表1。

1.7 TNF-α 與IL-8 的測定

GCF 樣本復溫后，根據ELISA 試劑盒檢測說明書，加入300 μL 樣本稀釋液，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清液，檢測450 nm 波長下OD值，計算樣本中TNF-α 和IL-8 水平。

1.8 統計學分析

采用SPSS 24.0 軟件進行統計分析。qPCR 結果對數轉換后進行統計，計量數據以xˉ±s 表示。采用配對t 檢驗比較治療前后各指標的差異。采用Spearman 相關性分析，分析GCF 中的NETs 水平和牙周臨床指標、牙周致病菌數量以及TNF-α、IL-8水平的相關性。Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基礎治療前后牙周臨床指標的變化

本研究共納入31 例Ⅲ～Ⅳ期牙周炎患者，平均年齡38.9 歲，其中男性18 例，女性13 例。牙周基礎治療后，采樣牙牙周臨床指標PLI、GI、PD 和CAL均比治療前顯著下降（Plt;0.05，表2）。

2.2 GCF 內NETs 水平的變化

免疫熒光染色可見胞外DNA 纖維網狀結構（藍色），MPO陽性染色蛋白鑲嵌其中（綠色），表明NETs 形成（圖1A）。治療前形成的NETs 數量更多，NETs 形成細胞百分比由治療前的54.10%降為治療后的17.51%（Plt;0.01，圖1B）。

2.3 齦下非附著菌斑中的總菌、P. gingivalis、A.actinomycetemcomitan 和P. intermedia 的定量檢測

從齦下非附著菌斑中提取16S rDNA，qPCR檢測發現，牙周基礎治療后，患者齦下非附著菌斑中總菌、P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans和P. intermedia 數量均顯著低于治療前（Plt;0.05，圖2）。

2.4 GCF 中TNF-α 及IL-8 水平的變化

ELISA 檢測顯示， 治療前， TNF- α 水平為（48.16±13.54） pg/mL， IL-8 水平為（2 634.94±856.95） pg/mL；治療后，TNF-α 水平為（35.01±7.68）pg/mL，IL-8水平為（543.56±253.85） pg/mL，兩種細胞因子水平均顯著下降（Plt;0.05，圖3）。

2.5 相關性分析

Spearman 相關性分析發現，治療前GCF 內NETs 水平與采樣牙牙周臨床指標PLI、GI、PD、CAL，GCF 中TNF-α、IL-8 水平、總菌和P. gingivalis數量存在高度正相關性（1gt;rgt;0.6，Plt;0.05），與A. actinomycetemcomitans 數量（0.60.05）、P. intermedia （00.05） 數量無相關性。Spearman 相關性分析結果見表3。

3 討論

NETs 作為中性粒細胞的主要殺菌機制之一，在牙周炎的發生發展中發揮了重要作用。本研究揭示了Ⅲ～Ⅳ期牙周炎患者基礎治療后GCF中NETs水平的變化，并發現后者可能與采樣牙PD、CAL、PLI、GI 等牙周臨床指標，GCF 中IL-8、TNF-α 水平及P. gingivalis 數量相關。

NETs 的檢測方法主要包括：1） 免疫細胞組織學檢測，共定位胞外DNA、MPO、瓜氨酸化組蛋白等；2） qPCR 檢測外周血、唾液中的無細胞DNA、DNA-MPO復合物等；3） 流式細胞學檢測NETs 組件，如MPO和瓜氨酸化組蛋白等[9]。免疫細胞學檢測是最經典的方法[5]。有學者[10]收集了牙周炎患者和牙齦炎患者的牙齦組織，并對牙齦中瓜氨酸化組蛋白或MPO進行免疫組化染色，共定位NETs，但牙齦收集有一定創傷，染色特異性尚待進一步研究。血清或組織液中的無細胞DNA并非NETs 所獨有[11]， 而MPO-DNA 復合物滴度與NETs 形成速率相關，可能影響ELISA 檢測準確度[12]。流式細胞術僅能檢測MPO-瓜氨酸化組蛋白共定位的NETs，不同刺激物誘導的NETs 組分存在差異，MPO或瓜氨酸化組蛋白含量較低的NETs可能難于檢測[13]。因此，上述檢測均存在一定局限性。

NETs 非常脆弱，紙捻法收集GCF 或化膿性齦溝滲出物時，NETs 可能附著于紙捻纖維素，因而無法完整轉移到多聚賴氨酸覆蓋的表面[14]。本研究采用的ACLAR 膜可檢測牙周袋內的NETs，后者與外周血/唾液中的NETs 相比能更好地反應牙周組織免疫炎癥反應的變化。ACLAR膜是一種共聚物薄膜，自身不產生熒光，且能耐受化學和高溫損傷，涂布多聚賴氨酸后能用于采集，并使用免疫熒光技術檢測GCF 中的NETs[8]。但使用ACLAR膜進行采樣時，對牙周袋寬度和深度有一定要求，因此納入患者均為Ⅲ～Ⅳ期牙周炎，以獲得寬而深的牙周袋，便于插入ACLAR膜。如何采集淺袋或窄袋內的NETs，還需進一步摸索采樣方法，或改良ACLAR膜的物理性能。

P. gingivalis 與NETs 形成密切相關，除了激活經典的NADPH氧化酶，還可分泌包括牙齦素在內的半胱氨酸蛋白酶，誘導NETs 形成[15]。A. actinomycetemcomitans的毒力因子LTX 能溶解白細胞，并誘導中性粒細胞遷移、脫顆粒和形成NETs[16]。

P. intermedia 同樣可通過激活NADPH 氧化酶，誘導NETs 形成[17]。但本研究僅發現，NETs 水平與P.gingivalis 數量存在較強相關性，而與A. actinomycetemcomitans和P. intermedia 數量的相關性不明顯。Gon?alves 等[18]認為，A.actinomycetemcomitans檢出率與取樣位點的炎癥程度無明顯相關性。研究[19]報道， 中國牙周炎患者的A. actinomycetemcomitans檢出率為48.3%，與牙周健康者沒有顯著差異，且含LTX 的A. actinomycetemcomitans 高毒株攜帶率較低[20]。Liu 等[21]比較了基礎治療前后漢族牙周炎患者的齦下菌斑組成，結果發現A. acti‐nomycetemcomitans 分布及相對豐度均維持在較低水平。以上證據提示，中國人群齦下菌斑中的A.actinomycetemcomitans 數量可能并不能很好地反映牙周局部炎癥，這也許是A. actinomycetemcomitans數量與NETs 相關性不明顯的原因。P. intermedia不是紅色復合體成員，而后者與牙周炎的關系更為緊密，這也可能與本研究未發現P. intermedia 與NETs 水平的相關性有關。還需要納入更多樣本和更長時間觀察，以進一步驗證本研究的結論。

目前，NETs 相關的牙周臨床研究多聚焦于牙周炎患者外周血和唾液中的NETs。Koval?íková等[22]揭示，牙周炎患者的唾液中，NETs 含量高于健康人，且與PD 正相關。Moonen 等[23]發現，基礎治療后，牙周炎患者的血漿降解NETs 的能力增強，可能導致患者外周血的NETs 水平下降。但White 等[24]認為，在相同刺激下，牙周炎患者和健康人的外周血中性粒細胞釋放NETs 的能力沒有差異，推測外周血NETs 與牙周炎的關系可能并不密切。齦溝/牙周袋是口腔中性粒細胞（oral polymorphonuclearneutrophil， oPMN） 的主要聚集地之一，oPMN的生物學功能可更好地反映牙周炎癥狀況。相同條件下，oPMN產生的NETs 是外周血中性粒細胞的13 倍[25]。本研究探討了基礎治療對GCF 中NETs 水平的影響，后者較全血或唾液中的NETs 能更好反映牙周炎癥水平和局部oPMN功能。

TNF-α 是一種重要的促炎因子和骨吸收因子，可以誘導破骨細胞分化，促進基質金屬蛋白酶、膠原酶等產生。Czerwińska等[26]的研究表明，TNF-α/IL-17/IL-23 信號軸的激活能誘導產生NETs。IL-8 是一種經典的趨化因子，能誘導中性粒細胞向炎癥部位或致病菌入侵部位趨化。Shu 等[27]發現，IL-8 還能通過MAPKs 和NADPH 信號通路，誘導NET-s 形成。上述發現與本研究中NETs 水平可能和TNF-α、IL-8 含量相關的結論一致。

綜上所述，牙周基礎治療可通過降低牙周致病菌水平，減少局部TNF-α、IL-8 等細胞因子產生，降低GCF 中NETs 水平，進而控制牙周免疫炎癥反應，減輕局部組織破壞。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 洪瀟）

[基金項目] 江蘇省自然科學基金（BK20231268）；江蘇省科教能力提升工程——江蘇省研究型醫院（YJXYYJSDW4）；江蘇省醫學創新中心（CXZX202227）