一種基于異佛爾酮的生物硫醇熒光探針

DOI：10.3969/j.issn.10001565.2025.02.006

摘" 要：小分子生物硫醇在生物體內扮演著至關重要的角色，當其濃度異常時會引發各種疾病.因此，開發用于檢測生物體內硫醇水平變化的新方法對于人類生命健康具有重要意義.由于熒光探針法具有操作簡單、選擇性高、靈敏度高、響應快速等特點，本文以2，4-二硝基苯磺酰基作為識別基團，異佛爾酮衍生物為熒光團，設計合成了一種近紅外硫醇熒光探針DCI-AC-NBS.該探針與硫醇發生“親核取代-環化”反應后生成熒光性能優良的香豆素類物質DCI-COU.該探針對硫醇具有選擇性高、檢出限低和斯托克斯位移大等優點，并可用于實時監測細胞內硫醇水平的變化，為生物體內硫醇檢測提供新思路.

關鍵詞：熒光探針；生物硫醇；生物成像

中圖分類號：O316""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：10001565（2025）02015708

A fluorescent probe for biothiols based on isophorone

JIANG Ningning， ZHOU Keyan， LIU Hongmei， LI Xiaoxing， YANG Yutao

（Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis Ministry of Education，College of Chemistry and Materials Science， Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： Small molecule biothiols play vital roles in living organisms， and abnormal concentrations can lead to various diseases. Therefore， developing new methods to detect biothiol levels is very important for human health. Fluorescent probes， known for their simple operation， high selectivity， high sensitivity， and fast response， are particularly useful for this purpose. In this study， a near-infrared fluorescent probe， DCI-AC-NBS， was designed and synthesized for biothiols detection， incorporating a 2，4-dinitrobenzenesulfonyl group as the recognition moiety and an isophorone derivative as the fluorophore. Through a nucleophilic substitution-cyclization reaction between DCI-AC-NBS and biothiols， a coumarin derivative， DCI-COU， was produced， exhibiting excellent fluorescence properties. The DCI-AC-NBS has the advantages of high selectivity， a low detection limit， and a large Stokes shift for biothiols， making it suitable for real-time monitoring of intracellular biothiol level changes， thereby providing a new approach for in vivo biothiol detection.

Key words： fluorescent probe; biothiols; bioimaging

收稿日期：20241112;修回日期：20241207

基金項目：

國家自然科學基金面上項目（22177025）;河北大學教育部藥物化學與分子診斷重點實驗室主任基金項目（MCMDZR-2024003）

第一作者：江寧寧（2001—），女，河北大學在讀碩士研究生，主要從事熒光探針及其生物傳感方向研究.E-mail：18334534763@163.com.

通信作者：李曉幸（1984—），女，河北大學實驗師，主要從事熒光探針及其生物傳感方向研究. E-mail：lixiaoxing.1984@163.com

楊瑜濤（1984—），女，河北大學副研究員，主要從事熒光探針的構建及其識別機制方向研究. E-mail：yutaoyang2016@163.com

小分子生物硫醇主要包括半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH），它們在生物體內發揮著至關重要的作用［1-3］，參與細胞信號傳導、維持氧化還原平衡、蛋白質合成與功能調節等生命過程，維護生物體的健康［4-7］. 然而，當生物硫醇的濃度異常時會引起各種疾病，如心血管疾病、癌癥和阿爾茨海默病等 ［8-11］.因此，硫醇的檢測在臨床診斷和疾病預防中具有重要意義，迫切需要開發一種新型的用于檢測小分子生物硫醇的新方法［12-14］ .

目前，熒光探針法具有操作簡單、選擇性高、靈敏度高、響應快速等特點，已廣泛應用于生物、醫學等領域［15-18］.研究表明，2，4-二硝基苯磺酰基可作為硫醇的特異性識別位點，應用于硫醇熒光探針的設計.目前，已報道的許多相關探針的熒光團骨架是預先存在的，其與硫醇發生親核取代反應后，將“保護”的熒光團釋放出來，從而實現對硫醇的識別與檢測，但卻存在背景熒光干擾等缺點，限制了生物成像和應用［19-28］.因此，在前者的基礎上，筆者選擇異佛爾酮衍生物作為熒光團，2，4-二硝基苯磺酰基團作為識別基團，構建了一種新的生物硫醇熒光探針DCI-AC-NBS.由于2，4-二硝基苯磺酰基團具有吸電子特性，熒光團的分子內電荷轉移（ICT）效應被阻止，導致探針本身不發熒光.在 Cys/Hcy/GSH 存在下，巰基首先進攻2，4-二硝基苯磺酰基發生親核取代反應，然后進一步發生分子內環化，原位形成新近紅外熒光團香豆素衍生物DCI-COU.該探針具有高選擇性、低檢出限（Cys：36 nmol/L；GSH：32 nmol/L；Hcy：72 nmol/L）、快速響應（1 500 s內）和大斯托克斯位移（165 nm）等優良特性，并具有良好的生物相容性，可用于實時監測細胞內硫醇水平的變化.

1" 實驗部分

1.1" 儀器

核磁共振儀 （400 Hz，中科牛津波譜，武漢）；紫外-可見分光光度計 （Cary 60 Agilent， America）；熒光分光光度計 （Cary Eclipse Agilent， America）；高分辨質譜儀 （Bruker Daltonik， America）；CO2培養箱 （Thermo Fisher， America）；激光共聚焦顯微鏡 （Zeiss， Germany）.

1.2" 試劑

異佛爾酮、丙二腈、4-羥基-苯甲醛、六次甲基四胺（HMTA）、乙氧甲酰基亞甲基三苯基膦（Ph3P=CHCOOC2H5）、2，4-二硝基苯磺酰氯、哌啶、三氟乙酸（TFA）、三乙胺（TEA）、無水乙醇（EtOH）、乙腈、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲亞砜（DMSO）、乙酸乙酯（EA）、石油醚（PE）、二氯甲烷（DCM）等為合成所需主要試劑，半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）等氨基酸用于光譜測試實驗，以上試劑均為分析純.

1.3" 溶液配制及光譜測定

用 DMSO 制備探針的儲備液，濃度為 2×10-3" mol/L，各種分析物均用去離子水配制，濃度為 2×10-3" mol/L.紫外和熒光光譜均在 PBS-DMSO（10 mmol/L，PBS與DMSO體積比為3∶2，pH=7.4）中檢測獲得，熒光光譜激發波長為 550 nm，光柵狹縫為 5 nm/5 nm.

1.4" 熒光探針的制備與表征

1.4.1" 化合物 DCI 的合成

將異佛爾酮（3.80 g，27 mmol）與丙二腈（6.00 g，88 mmol）溶于無水乙醇（30 mL）中，并在上述溶液中加入哌啶（200 μL），于 60 ℃下攪拌，待原料反應完畢后，將反應物真空濃縮，用乙酸乙酯（20 mLⅹ3）萃取，飽和氯化鈉（20 mL）洗滌，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮除去溶劑，將粗產物通過快速柱色譜（VPE∶VEA=30∶1）進行分離，得到白色針狀物（3.58 g，72%），見圖1.

1.4.2" 化合物 DCI-OH 的合成

將4-羥基-苯甲醛（0.12 g，1 mmol）和化合物DCI（0.19 g，1 mmol）溶解于乙腈溶液（6 mL）中，將 10 滴哌啶加入到上述溶液中，于 82 ℃回流攪拌 6 h.反應完成后，冷卻至室溫，真空濃縮除去溶劑，通過快速柱色譜分離（VPE∶VEA=15∶1）得到橘色固體（0.17 g，58%）.

1.4.3" 化合物 DCI-CHO-OH 的合成

將化合物DCI-OH（0.58 g，2 mmol）和 HMTA （0.56 g，4 mmol）溶解于 TFA （10 mL）溶液中，于 73 ℃回流攪拌 3 h. 反應完成后，冷卻至室溫，加入冰水（30 mL），用二氯甲烷（20 mLⅹ3）萃取，飽和氯化鈉（20 mL）洗滌，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮除去溶劑，將粗產物通過快速柱色譜（VDCM∶VEA=1∶1）進行分離，得到黃色固體（0.29 g，46%）.

1.4.4" 化合物 DCI-AC-OH 的合成

將化合物DCI-CHO-OH（0.16 g，0.50 mmol）和乙氧甲酰基亞甲基三苯基膦（0.26 g，0.75 mmol）加入到甲苯（30 mL）溶液中，在氬氣保護下加熱到 60 ℃，避光反應 4 h.反應完成，冷卻至室溫，用二氯甲烷（20 mL×3）萃取，再用飽和氯化鈉（20 mL）洗滌，合并有機相，真空濃縮除去溶劑.將粗產物通過快速柱色譜（VDCM∶VPE=1∶1）進行分離，得到橘色固體（0.16 g，83%）.

1.4.5" 探針DCI-AC-NBS的合成

將化合物DCI-AC-OH（0.10 g，0.25 mmol）與 TEA （0.18 g，0.28 mmol）溶解于 15 mL DMF 中，室溫下攪拌 10 min，然后滴加2，4-二硝基苯磺酰氯（0.48 g，1.65 mmol），在室溫下攪拌反應 10 h后，加入水（20 mL）淬滅反應，用二氯甲烷（20 mL×3）萃取，再用飽和氯化鈉（20 mL）洗滌，合并有機相后，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮除去溶劑，將粗產物通過快速柱色譜（VPE∶VEA=5∶1）進行分離，得到黃色固體（0.07 g，38%）.熔點：224.4～226.3 ℃， 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 9.04 （d， J=1.4 Hz， 1H）， 8.55 （dd， J1=5.6 Hz， J2=1.4 Hz， 1H）， 8.22 （d，J=0.8 Hz， 1H）， 8.11 （d， J=5.8 Hz， 1H）， 7.72 （dd，J1=5.8 Hz， J2=1.0 Hz， 1H）， 7.51 （d， J=10.8 Hz， 1H）， 7.43 （d， J=10.6 Hz， 1H）， 7.30 （d， J=10.0 Hz， 1H）， 7.23 （d，J=10.8 Hz， 1H）， 6.85 （s， 1H）， 6.56 （d， J=10.6 Hz， 1H）， 4.08 （q， J=4.8 Hz， 2H）， 2.58 （s， 2H）， 2.45 （s， 2H）， 1.17 （t， J=4.8 Hz， 3H）， 0.98 （s， 6H）; 13C NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 170.1， 165.3， 155.0， 151.5， 148.0， 146.8， 136.5， 135.5， 134.9， 133.5， 131.7， 131.6， 130.8， 128.0， 127.6， 126.5， 124.2， 123.6， 121.8， 121.1， 113.6， 112.8， 77.4， 60.4， 42.3， 38.2， 31.6， 27.4， 13.9. HRMS （ESI， m/z）： Calcd for C30H26N4O9S+ （［M+H］+） 619.14987， found： 619.14945.

2" 結果與討論

2.1" 探針DCI-AC-NBS對生物硫醇的光學性能

首先，通過熒光分光光度法考察了DCI-AC-NBS對生物硫醇的選擇性.在含有DCI-AC-NBS（10 mmol/L）的 PBS-DMSO（PBS與DMSO體積比為3∶2，pH=7.4）溶液中加入 100 μmol/L 的 Cys、Hcy、GSH 和 200 μmol/L 的其他分析物（如精氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、硒代半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨基酸、纈氨酸、異亮氨酸、硫化氫），如圖 2a熒光光譜顯示，其他分析物的熒光強度沒有明顯變化，而加入生物硫醇后，705 nm處的熒光強度明顯增加.上述研究結果表明，DCI-AC-NBS對生物硫醇具有較高的選擇性.同時，分別對DCI-AC-NBS與生物硫醇（Cys、Hcy、GSH）之間的反應進行了動力學研究，實驗結果如圖 2b所示.在加入生物硫醇后，DCI-AC-NBS快速開啟響應，在 1 500 s內達到最大值，說明DCI-AC-NBS可以快速識別硫醇.隨后，研究了不同 pH 對DCI-AC-NBS識別硫醇的影響.選擇不同 pH 值（3～12）的 PBS-DMSO（PBS與DMSO體積比3∶2）作為緩沖條件，以 GSH 為例進一步展開研究.如圖 2c所示，在 pH 值為3～9，DCI-AC-NBS本身保持穩定不變；但當加入 GSH 且 pH 值處于 7.4～11 時，其熒光強度顯著提升，說明DCI-AC-NBS可以在較寬的 pH 值范圍內識別硫醇.

接下來，在含有體積分數40% DMSO的PBS 緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.4）中測試了DCI-AC-NBS對生物硫醇（以 GSH 為例）響應的紫外和熒光滴定光譜（圖2d）.如圖 2d所示，DCI-AC-NBS在 400 nm處有最大吸收峰.隨著 GSH濃度（0～24 μmol/L）的增加，400 nm處的吸收峰逐漸降低，在 540 nm處出現了新的吸收峰，在 442 nm處出現等吸收點，這表明形成了新的化合物（圖2e）.圖 2e是與之相對應的 GSH 熒光滴定光譜，DCI-AC-NBS本身幾乎沒有熒光，隨著 GSH 濃度的增加，在 540 nm波長的激發下，位于 705 nm處發射峰的熒光強度升高了 76 倍. 隨后，根據DCI-AC-NBS識別 GSH 的熒光滴定光譜圖，繪制出了DCI-AC-NBS檢測GSH的工作曲線（圖2f）.如圖 2f所示，溶液的熒光強度與 GSH 的濃度（0～18 μmol/L）之間存在良好

的線性關系，線性方程為 Y=43.103 6X+19.759 84，R2=0.995 07，k=43.103 6.將空白探針掃描 10 次，通過 705 nm處的熒光強度計算出方差 σ，利用 3σ/k 公式計算出最低檢測限為 32 nmol/L.同樣，Cys 和 Hcy 的檢測限分別為 36 nmol/L 和 72 nmol/L，表明DCI-AC-NBS對生物硫醇有較低的檢出限和較高的靈敏度.

2.2" 探針DCI-AC-NBS識別硫醇的機理

對DCI-AC-NBS識別硫醇的反應機理提出假設，如圖 3a所示.硫醇的巰基攻擊2，4-二硝基苯磺酰基團引起裂解反應，發生分子內環化，形成最終產物DCI-COU.隨后，對DCI-COU進行了質譜（HR-MS）表征，如圖 3b所示，充分驗證了本文所提出的反應機理的正確性.

2.3" 探針DCI-AC-NBS的細胞成像

以 HepG2 細胞為模型，將細胞以1×105個/mL接種于6孔板中，在CO2培養箱中孵育12 h，使用不同濃度的探針DCI-AC-NBS（0、1、3、5、10、20 μmol/L）對細胞進行孵育，隨后使用流式細胞儀分析細胞對探針的攝取能力.如圖 4a所示，隨著探針DCI-AC-NBS濃度的增大，細胞的攝取能力隨之增大. 隨后，將 HepG2 細胞分為5組：Control 組、NEM（N-乙基馬來酰亞胺，生物硫醇清除劑）組、NEM+Cys組、NEM+Hcy組、NEM+GSH組，以密度為 5×104 個/mL接種于共聚焦小皿中，接種量為 2 mL，在 CO2 培養箱中孵育 24 h待用.當細胞貼壁后進行共聚焦顯微鏡成像.如圖 4b所示，Control組細胞只需使用DCI-AC-NBS孵育30 min，即可觀察到明顯的紅色熒光信號.NEM組細胞使用NEM（200 μmol/L）清除細胞中的部分生物硫醇后，再使用DCI-AC-NBS進行孵育，發現熒光信號明顯消失.最后，為了證明DCI-AC-NBS可以檢測外源性生物硫醇，先用 NEM 清除NEM+Cys組、NEM+Hcy組、NEM+GSH組細胞中的部分生物硫醇，再分別與Cys、Hcy和GSH（100 μmol/L）一起孵育30 min，最后，用DCI-AC-NBS孵育 30 min后進行成像，發現熒光信號更加明顯.上述結果表明，DCI-AC-NBS可用于動態監測活細胞中的生物硫醇.

λex=561 nm， λem=640～745 nm，比例尺：10 μm，數據以平均值士標準差（SD）表示（n=3），" ****P＜0.000 1，**P＜0.01，ns沒有統計學意義

生物硫醇作為一種重要的體內抗氧化劑，在細胞氧化還原過程中發揮著重要作用.因此，筆者將過氧化氫（H2O2）引入細胞中，模擬氧化應激狀態，將 HepG2 細胞分為3組：Control 組、H2O2 組、H2O2+ALA（硫辛酸，H2O2 的清除劑）組進行共聚焦顯微鏡成像.如圖 5 所示，Control組細胞使用DCI-AC-NBS孵育30 min，可以觀察到有明顯的紅色熒光；H2O2組細胞使用外源 H2O2（50 μmol/L ）進行處理，再使用DCI-AC-NBS孵育30 min，觀察到紅色熒光減弱；然而，當H2O2+ALA組細胞使用 H2O2 和 ALA （500 μmol/L）分別處理細胞 30 min，再用DCI-AC-NBS孵育 30 min后，熒光信號又明顯回升.這些結果進一步表明，DCI-AC-NBS可用于細胞內硫醇水平變化的實時監測.

λex=561 nm， λem=640～745 nm，比例尺：10 μm，數據以平均值士標準差（SD）表示（n=3），****P＜0.000 1，*P＜0.1

3" 總結

本文設計合成了一種新型的熒光增強型近紅外生物硫醇熒光探針DCI-AC-NBS，用于生物硫醇的檢測和生物成像.通過核磁共振氫譜、高分辨質譜等手段，發現在生物硫醇作用下，DCI-AC-NBS發生親核取代-環化反應，生成強熒光物質DCI-COU.該探針對生物硫醇的檢測具有高選擇性和高靈敏度，并成功用于活細胞中生物硫醇的檢測和熒光成像，有望在相關疾病的診斷中發揮積極作用.

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（責任編輯：梁俊紅）