BMP4/SMAD4通過下調GJA1基因表達影響綿羊卵巢顆粒間隙連接活性

摘 要：

旨在探索骨形態發生蛋白4（bone morphogenetic protein 4， BMP4）對綿羊卵巢顆粒細胞中間隙連接蛋白基因（gap junction protein alpha 1， GJA1）表達的影響及其分子調控機制。本研究利用廊坊市屠宰場收集的2～4歲健康綿羊卵巢分離顆粒細胞，采用免疫熒光染色技術定位GJA1在顆粒細胞中的分布。將細胞隨機分為4組，分別添加0、10、50和100 ng·mL-1濃度的重組BMP4蛋白，每組3個重復，培養24 h，利用CCK-8法評估細胞活性，RT-qPCR和Western blot研究BMP4對GJA1的mRNA和蛋白表達水平的影響。為探究BMP4調控GJA1表達的潛在機制，將細胞隨機分為3組，每組3個重復，除對照組外分別添加10 μmol·L-1 BMP I型受體抑制劑（Dorsomorphin）和干擾小RNA敲除SMAD家族蛋白4（SMAD family member 4， SMAD4），均添加100 ng·mL-1的BMP4處理細胞24 h，RT-qPCR檢測GJA1和SMAD4表達量，Western blot分析測定GJA1和SMAD4表達水平以及SMAD1/5/8的磷酸化水平，最后利用劃痕染料示蹤試驗檢測綿羊卵巢顆粒細胞之間的間隙連接活性。結果顯示，BMP4顯著抑制了綿羊卵巢顆粒細胞中GJA1 表達和間隙連接活性（Plt;0.05），此抑制效應在添加Dorsomorphin和敲除SMAD4后顯著減弱（Plt;0.05），同時，BMP4處理顯著增加了SMAD1/5/8的磷酸化水平（Plt;0.05）。綜上，BMP4通過SMAD1/5/8-SMAD4信號轉導調控GJA1表達進而影響顆粒細胞間隙連接活性，本結果增加了對綿羊BMP/SMAD通路調控顆粒細胞間隙連接活性的了解，為改進體外卵泡成熟方法和高繁母羊的分子育種提供了基礎。

關鍵詞：

綿羊；卵巢顆粒細胞；BMP4；間隙連接；GJA1；SMAD4

中圖分類號：

S826.3""" "文獻標志碼：A"" """"文章編號： 0366-6964（2025）02-0679-10

收稿日期：2024-08-09

基金項目：中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（Y2024YJ08）;財政部和農業農村部國家現代農業產業技術體系資助（CARS-38）；山西省基礎研究計劃面上項目（20210302123371）；山西農業大學博士科研啟動項目（2021BQ04）

作者簡介：何 "雨（2000-），女，河北廊坊人，碩士生，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail： heyu_22@163.com

*通信作者：梁 琛，主要從事動物遺傳育種與繁殖的研究，E-mail：cekiv@163.com；儲明星，主要從事羊優異繁殖性狀分子機理研究，E-mail：chumingxing@caas.cn

BMP4/SMAD4 Downregulates GJA1 Gene Expression to Affect the Gap Junctional

Intercellular Communication Activity in Sheep Ovarian Granulosa Cells

HE" Yu1， WANG" Xiangyu2， DI" Ran2， CHU" Mingxing2*， LIANG" Chen1*

（1.College of Animal Science， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801，" China;

2.State Key Laboratory of Animal Biotech Breeding， Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural

Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract：

This study aimed to explore the effect of bone morphogenetic protein 4 （BMP4） on the expression of gap junction protein alpha 1 （GJA1） in sheep ovarian granulosa cells and its molecular regulatory mechanism. Granulosa cells were isolated from the ovaries of healthy 2-4-year-old sheep obtained from a slaughterhouse in Langfang city. Immunofluorescence staining was used to localize the distribution of GJA1 in granulosa cells. The cells were randomly divided into 4 groups， each treated with recombinant BMP4 protein at concentrations of 0， 10， 50， and 100 ng·mL-1， with 3 replicates per group， and cultured for 24 hours. Cell viability was assessed using the CCK-8 assay， while RT-qPCR and Western blot were employed to examine the effects of BMP4 on GJA1 mRNA and protein expression levels. To investigate the potential mechanism by which BMP4 regulates GJA1 expression， the cells were divided into 3 groups with 3 replicates per group. In addition to the control group， cells were treated with 10 μmol·L-1 BMP type I receptor inhibitor （Dorsomorphin） and small interfering RNA to knock down SMAD family member 4 （SMAD4）， all treated with 100 ng·mL-1 BMP4 for 24 hours. RT-qPCR was used to measure the expression of GJA1 and SMAD4， and Western blot was used to assess the expression levels of GJA1 and SMAD4 as well as the phosphorylation levels of SMAD1/5/8. Finally， a scratch dye tracking assay was performed to assess the gap junction activity between sheep ovarian granulosa cells. The results showed that BMP4 significantly inhibited the expression of GJA1 and gap junction activity in sheep ovarian granulosa cells （Plt;0.05）. This inhibitory effect was significantly weakened after treatment with Dorsomorphin and SMAD4 knockdown （Plt;0.05）. Moreover， BMP4 treatment significantly increased the phosphorylation levels of SMAD1/5/8 （Plt;0.05）. In conclusion， BMP4 regulates GJA1 expression and subsequently affects the gap junction activity of granulosa cells through the SMAD1/5/8-SMAD4 signaling pathway. These findings enhance the understanding of how the BMP/SMAD pathway regulates gap junction activity in sheep granulosa cells， providing a foundation for improving in vitro follicle maturation methods and molecular breeding of high-fertility ewes.

Key words： sheep; ovarian granulosa cells; BMP4; gap junction; GJA1; SMAD4

*Corresponding authors： LIANG Chen， E-mail：cekiv@163.com; CHU Mingxing， E-mail：chumingxing@caas.cn

間隙連接是一種重要的細胞通道，直接連接細胞質，促進各種小分子、代謝物和離子在相鄰細胞之間的轉移［1，2］，每個間隙連接由兩個相互對接的半通道（或稱為連接體）組成，跨越細胞膜并構成細胞間連接的“橋梁”［3］。在顆粒細胞和卵母細胞之間基于連接蛋白的通道不僅提供營養和代謝產物轉運，還在維持卵母細胞減數分裂停滯中發揮關鍵作用［4，5］。顆粒細胞之間通過間隙連接交流促進了其增殖和分化［6］，同時，顆粒細胞通過間隙連接向卵母細胞傳遞營養物質，推動了卵母細胞的生長和成熟［7］。

間隙連接主要由連接蛋白構成，它們是一個跨膜蛋白多基因家族。人類卵泡中間隙連接蛋白α1（gap junction protein alpha 1， GJA1），又被稱為Cx43蛋白，是卵泡發育過程中形成顆粒細胞之間連接的最重要的組成蛋白［8］，GJA1在顆粒細胞中大量表達，存在于卵泡發育的所有階段，它在維持卵母細胞減數分裂停滯和卵泡發育中起著關鍵作用，且GJA1受到BMP/SMAD通路調控［9-11］。BMP4是TGF-β超家族的成員之一［12］，并且作為BMP/SMAD信號通路中的重要配體發揮作用［13，14］。BMP4主要通過與細胞膜上的Ⅰ型受體（BMPR1A和BMPR1B）結合［15］，調控下游信號傳導，磷酸化SMAD1/5/8蛋白［16］，再與SMAD家族成員4（SMAD family member 4，SMAD4）形成復合體，影響卵巢顆粒細胞的功能［17］。有研究指出，BMP4在人類顆粒細胞中引發了GJA1表達的下調，這種下調是通過激活SMAD 1/5/8信號通路來實現的。此外，BMP4還可能參與了抑制排卵和黃體生成的過程［9］。綿羊上有報道表明，在卵泡不同發育階段，GJA1表達存在差異，但GJA1產生差異及其通過改變間隙連接活性影響卵泡發育的機制并不明晰［18］。

本試驗以綿羊卵巢顆粒細胞為研究對象，研究BMP4對綿羊卵巢顆粒細胞中GJA1表達的影響，以及其通過BMP/SMAD依賴途徑的潛在調節模式，以期為改進體外卵泡發育及卵母細胞成熟的方法提供科學基礎，也為高繁母羊的分子育種提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用綿羊卵巢來自河北廊坊大廠回族自治縣屠宰場。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

根據NCBI數據庫已知的綿羊各基因序列，利用Primer Premier 6.25軟件分別設計GJA1，TGF-β通路中的SMAD4等基因和熒光定量內參基因的相關引物，交由上海生工生物工程有限公司合成。si-SMAD4參照NCBI公布的綿羊SMAD4基因序列，以非特異性片段為陰性對照（NC-siRNA），由上海吉瑪生物科技有限公司設計合成。引物序列及產物長度等信息見表1。

1.2.2 綿羊卵巢顆粒細胞的體外分離及培養

羊卵巢來自河北廊坊大廠回民自治縣屠宰場，羊屠宰后取卵巢放于保溫瓶中迅速帶回實驗室，用75%酒精和添加2%青霉素鏈霉素的37℃生理鹽水輕輕沖洗2遍，用5 mL注射器抽出2～5 mm生長卵泡中的卵泡液，將卵泡液收集于15 mL離心管中，加入含1%青霉素鏈霉素的PBS，1 800 r·min-1離心5 min，棄上清；PBS重懸沉淀，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清，重復兩次，獲得較為純凈的顆粒細胞沉淀。收集到的細胞沉淀用含1%青霉素鏈霉素、5% FBS（胎牛血清）的DMEM重懸沉淀，分別于6 cm培養皿中接種細胞數為每孔1×106個，每孔加入2 mL含10% FBS、1%青霉素鏈霉素的完全培養基，于37℃、5% CO2培養箱中分別培養。

1.2.3 免疫熒光染色

將細胞爬片置于6孔板中央，細胞接種于細胞爬片上，細胞生長貼壁至大約90%后，PBS洗滌細胞5 min 3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌細胞5 min 3次，采用0.1%TritonX-100 4℃通透15 min，PBS洗滌細胞5 min 3次，5%山羊血清封閉30 min，棄去封閉液，4℃搖床孵育一抗Cx43（Abcam， ab312836）過夜，次日PBST洗滌5 min 3次（用錫箔紙包裹6孔板避光），避光室溫孵育二抗（Abcam， ab150081）2 h，PBST洗滌5 min 3次，DAPI復染細胞核5 min，PBS洗滌細胞5 min 3次，小心取出細胞爬片，滴加一滴抗熒光淬滅劑封片，在熒光倒置顯微鏡下鏡檢，采集圖像。

1.2.4 CCK-8檢測羊卵巢顆粒細胞增殖

將顆粒細胞接種于96孔板中，接種密度為1×104 個·mL-1，培養至貼壁后，將細胞分為4組，分別添加0、10、50、100 ng·mL-1的BMP4重組蛋白（Ramp;D System公司，314-BP-050/CF），BMP4處理濃度的設定參考Sugiura等［19］已發表的文章，每孔100 μL體系，每組設置3個生物學重復，每個生物學重復設置3個復孔，于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h后按照細胞增殖于毒性檢測試劑盒（Solarbio公司， CA1210）說明書進行細胞活性檢測。具體操作步驟如下：將添加不同濃度的BMP4重組蛋白培養基棄去，每孔加入100 μL新的培養液，并加入10 μL的CCK-8溶液，在培養箱內孵育1 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值，計算出添加不同濃度BMP4重組蛋白的細胞活性。

1.2.5 顆粒細胞的轉染

將卵巢顆粒細胞與6孔板中培養至70%～80%匯合度時進行轉染試驗，利用Lipofectamine 2000轉染試劑盒（Invitrogen，11668019），按照500 μL的體系進行配置，具體配置方法如表2所示，將配置好的A液與B液顛倒混勻，室溫下孵育20 min，均勻地滴加到各孔細胞中，添加OPTI補齊至2 mL，6 h后更換為完全培養基，在培養箱中37℃ 5% CO2培養24 h，用于后續試驗。

1.2.6 RNA的提取和熒光定量PCR

用RNAsimple總RNA提取試劑盒（TIANGEN公司，DP419）提取添加BMP4不同時間段的顆粒細胞的總RNA，Nanodrop測其純度和濃度（1.8lt;OD260nm/OD280nmlt;2.0）后，反轉錄得到cDNA。按照以下反應體系進行RT-qPCR：SYBR MIX 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，加入ddH2O補充體系至20 μL。反應條件：95℃ 5 min; 95℃ 10 s， 60℃ 30 s， 共40個循環；95℃ 15 s， 60℃ 1 min， 95℃ 15 s。基因相對表達量用2-△△Ct法計算［20］，引物具體信息見表1。

1.2.7 Western blot檢測相關蛋白的表達

收集BMP4處理后的顆粒細胞，按照試劑盒提取總蛋白后應用BCA法測定蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳，轉膜后用封閉液室溫搖床震蕩封閉2 h，加入稀釋好的一抗（CST，GJA1，#83649，1∶1 000稀釋；Proteintech，SMAD4，10231-1-AP，1∶1 000稀釋；Invitrogen，SMAD1/5/8，#PA5-104523，1∶1 000稀釋；CST，p-SMAD1/5/8，#13820，1∶1 000稀釋；Proteintech，GAPDH，10494-1-AP；Proteintech，Beta Tubulin，10068-1-AP），4℃搖床孵育過夜。次日加入二抗（Proteintech，SA00001-2），室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL顯色液，曝光。應用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析，每組試驗設置兩個重復，GAPDH和Beta Tubulin為內參分析目的蛋白的表達量。

1.2.8 劃痕標記染料示蹤試驗

將處理好的貼壁細胞用預熱37℃的PBS輕輕沖洗3遍，用手術刀片在培養皿底劃痕3～5道，然后加入染料（MP， lucifer yellow， L453）1 mL，在培養箱內避光孵育5 min，吸去染液，用預熱37℃的PBS輕輕沖洗3遍，洗去殘留的染液，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍攝照片［21，22］。

1.2.9 數據統計分析

采用2-△△Ct法計算基因相對表達量，使用GraphPad Prism 8.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析，并根據結果作圖。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 GJA1在顆粒細胞中的定位和分布

為了探究GJA1在顆粒細胞中表達的位置，應用免疫熒光染色試驗研究了GJA1在綿羊卵巢顆粒細胞中的定位和分布情況。如圖1所示，在細胞膜上觀察到強烈的綠色熒光信號，表明GJA1蛋白主要定位于細胞膜。

2.2 BMP4下調了顆粒細胞中GJA1的表達

為了檢測BMP4對顆粒細胞內GJA1表達的影響，分別用不同濃度的BMP4（0、10、50和100 ng·mL-1）處理顆粒細胞。CCK-8結果顯示（圖2A），除添加0 ng·mL-1的對照組（ctrl）外，其余處理組之間沒有顯著差異。RT-qPCR結果顯示BMP4處理顆粒細胞12 h后，BMP4以濃度依賴性的方式抑制顆粒細胞中GJA1基因mRNA表達水平（Plt;0.05），在處理后24 h，BMP4對GJA1表達的抑制作用最為顯著（Plt;0.01，圖2B）。后續試驗選擇100 ng·mL-1為濃度、時間為24 h作為試驗條件來處理顆粒細胞。

2.3 BMP Ⅰ型受體抑制劑Dorsomorphin對BMP4誘導GJA1表達下調效果的影響

已知BMP家族的Ι型受體可能參與調控BMP4誘導的信號通路激活，因此，選用BMP家族的Ι型受體抑制劑Dorsomorphin來抑制BMP I型受體（ALK2、ALK3和ALK6）。分別用10 μmol·L-1 Dorsomorphin預處理顆粒細胞1 h，然后加入100 ng·mL-1的BMP4培養24 h，檢測細胞中GJA1蛋白表達量變化。Western blot結果顯示，Dorsomorphin能夠抑制BMP4誘導的GJA1表達水平的下調（圖3）。根據結果證明試驗的特異性。

2.4 顆粒細胞中BMP4激活SMAD1/5/8信號通路

為探究BMP4激活的相關信號通路活性，使用100 ng·mL-1的BMP4處理顆粒細胞24 h，Western blot檢測SMAD1/5/8的磷酸化水平變化。結果如圖4所示，BMP4處理后SMAD1/5/8的磷酸化水平均顯著增加，表明BMP4可以激活顆粒細胞內的SMAD1/5/8信號通路。

2.5 BMP4通過SMAD4調節GJA1表達

在BMP信號通路中，SMAD4作為轉錄因子與磷酸化的SMAD1/5/8結合形成復合物［23］，并在細胞核中與靶基因GJA1結合發揮作用［24，25］。為了證實BMP4是通過SMAD信號通路對GJA1表達水平進行調節，使用SMAD4的特異性siRNA來抑制顆粒細胞內SMAD4的表達。顆粒細胞轉染si-SMAD4后48 h，SMAD4的表達水平顯著下降（圖5C和5D）。顆粒細胞轉染si-SMAD4完成后，100 ng·mL-1的BMP4再處理24 h。RT-qPCR和Western blot結果顯示SMAD4表達被抑制后，BMP4誘導的GJA1表達水平的下調被抑制（圖5A、5B）。

2.6 GJA1對細胞間隙轉運效率的影響

采用刮痕染料示蹤技術探究GJA1作為間隙連接蛋白對細胞間轉運效率的影響。結果顯示（圖6），加入lucifer yellow染料避光孵育5 min后，轉染si-SMAD4處理的顆粒細胞與lucifer yellow耦合的效率低于ctrl組，加入BMP4后，耦合的效率有所升高。證明GJA1是間隙連接的重要蛋白，且受到SMAD4調控。

3 討 論

GJA1作為間隙連接蛋白，參與多種生物過程的協調和調控，近年來相關的研究逐漸增多，在人［26］、小鼠［27］、水牛［28］、綿羊［29］中都有研究表明GJA1是間隙連接的組成蛋白之一，架起了細胞與細胞之間的橋梁，向細胞內運輸氨基酸、葡萄糖、核苷酸和生長因子等對卵母細胞發育所必需的營養物質［30］。已有研究表明，GJA1水平在發情周期中的變化與血清FSH和LH水平高度相關［31，32］，顆粒細胞中GJA1的表達主要受垂體促性腺激素的調節［32］。除促性腺激素外，類固醇激素同樣可以調節包括人在內的許多哺乳動物GJA1的表達。Wu等［33］已經證明高水平雄激素可降低人顆粒細胞系的GJA1水平和GJIC活性。

在生長卵泡中，GJA1介導的間隙連接協助卵泡發育［34］并且GJA1 mRNA和蛋白質水平在排卵前增加［34］。GJA1基因敲除小鼠的突變卵泡無法進行減數分裂和成熟［35］，也無法受精，表明含有GJA1的間隙連接通道是卵母細胞成熟和黃體化所必需的［36］。BMP4已被證實可以增加牛卵巢顆粒細胞的活細胞數量［37］。本研究結果顯示，BMP4可能通過抑制GJA1的表達進而影響間隙連接通道在綿羊顆粒細胞中發揮生物學功能。綜合本試驗證實的BMP4抑制了GJA1的表達和以往的研究推測，在排卵的前期，BMP4可能參與抑制排卵和預防黃體化。

目前，TGF-β超家族成員，特別是BMPs，在生殖系統中對于GJA1表達的調控效應尚未得到充分研究。本研究直接證明了BMP4處理可以下調綿羊卵巢顆粒細胞中GJA1的mRNA和蛋白水平。迄今為止，人類中已有20多種BMPs被鑒定，并且研究表明其中一些生長因子在卵巢中有表達。例如，卵母細胞表達BMP6和BMP15；顆粒細胞表達BMP2、BMP5和BMP6；卵泡膜細胞表達BMP4和BMP7［38］。還需要進一步研究，以確定綿羊源的BMPs是否與人類顆粒細胞中BMPs對GJA1調作用相似。

雖然已經報道了BMP對GJA1在小鼠骨肉瘤細胞中的調節作用，但介導BMP對GJA1調節功能的分子機制仍未被確定［39，40］。Chang等［9］的研究結果表明，構成BMP下游信號通路的SMAD1/5/8介導了BMP4對GJA1的抑制作用。雖然本試驗提供了SMAD1/5/8能否結合到GJA1啟動子的直接證據，但之前和現在的研究結果表明，SMAD1/5/8可能參與了BMP4誘導的綿羊顆粒細胞中GJA1的下調作用。在生殖系統中，BMPs在顆粒細胞中的表達和功能具有多樣性。例如，BMP4和BMP7在卵泡膜細胞中的表達可能對顆粒細胞中GJA1的調控發揮作用。此外，BMP4通過SMAD1/5/8信號通路介導對GJA1的抑制作用，這可能與排卵和黃體化的抑制過程有關［41］。

綜上，GJA1在顆粒細胞中的表達和功能受到BMP4/SMAD4信號通路的精細調節，且BMP4 SMAD1/5/8的磷酸化起著重要的作用，這些調節機制對于卵泡的正常發育和排卵過程至關重要。未來需要進一步探索這些具體的調節機制，以及它們在調控綿羊卵母細胞成熟和增加產羔數中的作用。

4 結 論

本研究初步分析了BMP4/SMAD4通過下調GJA1基因表達影響綿羊卵巢顆粒細胞間隙連接活性的分子機制，發現BMP4下調了GJA1在綿羊卵巢顆粒細胞中mRNA的表達量和蛋白水平，并且降低了間隙連接活性；BMP Ι型受體抑制劑Dorsomorphin和SMAD4的敲除逆轉了BMP4對GJA1表達的影響。本研究結果為BMP4/SMAD4參與GJA1調控綿羊卵巢顆粒細胞間隙連接活性分子機制提供了理論依據。

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（編輯 郭云雁）