線粒體翻譯起始因子（MTIF2）基因甲基化的特征及其與肝細胞癌發生的相關性分析

摘要：目的結合生物信息學分析方法對線粒體翻譯起始因子（MTIF2）基因的甲基化特征進行分析，并探討其與肝細胞癌發生發展的關系。方法應用MethSurv、EWAS Data Hub軟件對MTIF2甲基化樣本進行標準化分析和聚類分析，內容包括生存曲線分析、甲基化特征分析、腫瘤信號通路相關性及泛癌數據庫比對分析。計量資料兩組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。使用Cox比例風險模型基于患者CpG部位的甲基化水平執行單變量和多變量生存分析。通過Kaplan-Meier圖標識較低和較高甲基化患者組之間的生存差異。Log-likelihood ratio法用于組間生存差異分析。結果MTIF2甲基化整體聚類表明在種族、人種、BMI、年齡等特征間MTIF2基因甲基化水平沒有明顯差異。Kaplan-Meier生存曲線分析發現，MTIF2基因N-Shore高甲基化的患者預后明顯好于低甲基化患者（HR=0.492，Plt;0.001），而CpG island和S-Shore甲基化的高低與生存率無明顯差異（P值均gt;0.05）。基于不同年齡、性別、BMI、人種、種族、臨床分期繪制MTIF2基因甲基化譜發現，隨年齡增長會降低MTIF2基因N-Shore和CpG island的甲基化水平，白種人的MTIF2基因N-Shore的甲基化水平明顯低于亞洲人（Plt;0.05），臨床分期Ⅳ期患者MTIF2基因N-Shore和CpG island的甲基化水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者（P值均lt;0.05）。臨床驗證試驗表明，Ⅲ/Ⅳ期肝細胞癌患者MTIF2甲基化水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者（Plt;0.05），且低于健康人群（Plt;0.05）。結論MTIF2基因N-Shore低甲基化是肝細胞癌發生發展的危險因素。

關鍵詞：線粒體翻譯起始因子；甲基化；癌，肝細胞；計算生物學

基金項目：四川省自然科學基金（2022NSFSC1415）；西部戰區總醫院應用基礎研究項目（2021-XZYG-C22）

Characteristics of mitochondrial translational initiation factor 2 gene methylation and its association with the development of hepatocellular carcinoma

XIE Huajie1，CHANG Kai1，WANG Yanyan1，NA Wanlin1，CAI Huan1，LIU Xia1，JIANG Zhongyong2，HU Zonghai1，LIU Yuan1

1.Department of Clinical Laboratory，The General Hospital of Western Theater Command，Chengdu 610083，China；2.Department of Clinical Laboratory，Affiliated Cancer Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu Seventh People’s Hospital，Chengdu 610041，China

Corresponding author：CHANG Kai，ck8148@126.com（ORCID：0000-0001-6013-9256）

Abstract：Objective To investigate the characteristics of mitochondrial translational initiation factor 2（MTIF2）gene methylation and its association with the development and progression of hepatocellular carcinoma（HCC）.Methods MethSurv and EWAS Data Hub were used to perform the standardized analysis and the cluster analysis of MTIF2 methylation samples，including survival curve analysis，methylation signature analysis，the association of tumor signaling pathways，and a comparative analysis based on pan-cancer database.The independent-samples t test was used for comparison between two groups；a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups.The Cox proportional hazards model was used to perform the univariate and multivariate survival"analyses of methylation level at the CpG site.The Kaplan-Meier method was used to investigate the survival differences between the patients with low methylation level and those with high methylation level，and the Log-likelihood ratio method was used for survival difference analysis.Results Global clustering of MTIF2 methylation showed that there was no significant difference in MTIF2 gene methylation level between different races，ethnicities，BMI levels，and ages.The Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the patients with N-Shore hypermethylation of the MTIF2 gene had a significantly better prognosis than those with hypomethylation（hazard ratio［HR］=0.492，Plt;0.001），while there was no significant difference in survival rate between the patients with different CpG island and S-Shore methylation levels（Pgt;0.05）.The methylation profile of the MTIF2 gene based on different ages，sexes，BMI levels，races，ethnicities，and clinical stages showed that the N-Shore and CpG island methylation levels of the MTIF2 gene decreased with the increase in age，and the Caucasian population had significantly lower N-Shore methylation levels of the MTIF2 gene than the Asian population（Plt;0.05）；the patients with clinical stageⅣhad significantly lower N-Shore and CpG island methylation levels of the MTIF2 gene than those with stageⅠ/Ⅱ（Plt;0.05）.Clinical validation showed that the patients with stageⅢ/ⅣHCC had a significantly lower methylation level of the MTIF2 gene than those with stageⅠ/ⅡHCC and the normal population（Plt;0.05）.Conclusion N-Shore hypomethylation of the MTIF2 gene is a risk factor for the development and progression of HCC.

Key words：Mitochondrial Translation Initiation Factor；Methylation；Carcinoma，Hepatocellular；Computational Biology

Research funding：Natural Science Foundation of Sichuan Province（2022NSFSC1415）；Management Project of General Hospital of Western Theater Command（2021-XZYG-C22）

肝細胞癌（HCC）是我國常見的惡性腫瘤，其死亡率逐年升高。HCC的發生發展受一系列遺傳因素和環境因素的共同作用，其致病機制復雜多樣［1］。目前手術切除仍然是HCC最有效的治療方法，但術后的高復發率使得患者的預后并不理想［2］。已知在HCC組織存在全基因組低DNA甲基化和高DNA甲基化區域，DNA甲基化介導的腫瘤抑制基因啟動子失活是HCC發展的重要機制。但HCC中異常表達的長鏈非編碼RNA的DNA甲基化研究仍處于初始階段。研究發現關鍵基因DNA甲基化大量參與生命活動調節、細胞增殖、腫瘤發生等生物進程［3］，并在HCC的發生與術后復發機制中扮演重要角色［4］。研究表明線粒體翻譯起始因子2（mitochondrial translation initiation factor 2，MTIF2）可能通過調節細胞增殖、遷移和凋亡、肝炎病毒激活等過程影響HCC的發生發展，并認為MTIF2在HCC診療過程中有充當生物標志物的潛質，然而其具體的參與機制并不明確［5］。本課題組前期數據表明，MTIF2的蛋白質表達水平與腫瘤的復發具有顯著相關性，同時發現HCC復發與MTIF2的甲基化水平同樣具有相關性。為了進一步分析MTIF2甲基化與HCC的關系，本研究擬通過對已有的關于MTIF2的甲基化研究進行梳理，結合生物信息學分析方法對MTIF2進行分析，探討其參與HCC發生發展的可能機制，以期為今后HCC發病機制的進一步研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1數據庫收集收集TCGA數據庫癌癥數據集25個（LAML、ACC、BCLA、LGG、BRCA、CESC、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUSD、LUSC、MESO、PAAD、READ、SARC、SKCM、STAD、UCS、UCEC、UVM）。應用MethSurv軟件、EWAS Data Hub軟件對MTIF2甲基化樣本進行標準化分析和聚類分析［6］。參考數據庫包括GEO、ArrayExpress和Encode數據庫。

1.2 MTIF2基因單個CpG聚類分析以LIHC TCGA癌癥數據集為基礎，MTIF2為目標基因單個CpG進行聚類分析，將甲基化水平與可用的患者特征和基因亞區域相關聯。繪制熱圖，甲基化水平顯示為從藍色到紅色的連續變量。

1.3 MTIF2基因甲基化生存曲線分析以LIHC TCGA數據集為基礎數據集，分別查詢基因N-Shore、island和S-Shore，CpG位點選用已知的11個探針（cg27478579、cg15024566、cg18482098、cg05986680、cg27235690、cg20497627、cg22645636、cg05319060、cg18752448、cg00704126、cg10455676）進行匹配［7］。分割點為中線進行高低甲基化分組分析。

1.4 MTIF2基因甲基化特征分析基于不同患者特征（年齡、性別、BMI、人種、種族、臨床分期）分析MTIF2基因N-Shore甲基化譜。納入數據庫檢索人群共377例，繪制小提琴圖用于表示不同樣本組間甲基化差異，用以查詢MTIF2基因CpG位點的甲基化分布、中位數和四分位數范圍與患者特征，包含年齡、性別、BMI、人種、種族、臨床分期。甲基化水平按中值線（Median值）進行劃分，高于該值為高甲基化，反之為低甲基化。

1.5 MTIF2基因甲基化的All Cancer數據庫分析應用MethSurv軟件、EWAS Data Hub軟件分析MTIF2基因CpG位點在其他癌型中的甲基化情況，對癌癥類型、相關性、95%CI、P值進行分析。并以P值大小排序，剔除非顯著性數據（Pgt;0.01）。

1.6 MTIF2基因甲基化臨床樣本驗證選取西部戰區總醫院2024年5月—6月的HCCⅢ/Ⅳ期患者10例，Ⅰ/Ⅱ期患者10例，無合并其他腫瘤，無免疫系統疾病，無糖尿病、高血壓；另選取正常健康者10例作為對照組。采集外周血用于甲基化水平檢測，樣本檢測依托成都元極生物科技公司。

1.7統計學方法采用SPSS 24.0軟件進行數據分析。計量資料采用±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。使用Cox比例風險模型基于患者CpG部位的甲基化水平執行單變量和多變量生存分析，變量包含患者CpG部位的甲基化水平，死亡事件（使用Forward：LR法）。通過Kaplan-Meier圖標識較低和較高甲基化患者之間的生存差異。Log-likelihood ratio法用于組間生存差異分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 MTIF2基因單個CpG聚類分析LIHC TCGA癌癥數據集為基礎，設置目標基因為MTIF2，應用已知的11個探針對單個CpG進行聚類分析，將甲基化水平與患者特征和基因亞區域相關聯。結果表明：在種族、人種、BMI、年齡等方面MTIF2基因甲基化水平沒有明顯差異（圖1）。

2.2 MTIF2基因N-Shore甲基化生存曲線分析依照MTIF2的甲基化密度圖進行分組，中值線（Median=0.056）左側為低甲基化（n=189），右側為高甲基化（n=188）（圖2a）。使用Cox比例風險模型基于患者CpG部位的N-Shore甲基化水平進行單變量和多變量生存分析。Kaplan-Meier生存分析曲線結果顯示，高甲基化患者的預后明顯好于低甲基化患者（HR=0.492，Plt;0.001）（圖2b）。

2.3 MTIF2基因N-Shore甲基化不同特征間的差異隨著年齡增長，患者的甲基化水平逐漸降低（Plt;0.05）；白種人的甲基化水平低于亞洲人（Plt;0.05）；臨床分期Ⅳ期患者的甲基化水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者（P值均lt;0.05）。不同性別、BMI和種族人群的MTIF2基因N-Shore甲基化水平比較，差異無統計學意義（P值均gt;0.05）（圖3）。

2.4 MTIF2基因CpG island甲基化生存曲線分析依照MTIF2的甲基化密度圖進行分組，中值線（Median=0.027）左側為低甲基化（n=189），右側為高甲基化（n=188）（圖4a）。使用Cox比例風險模型基于患者CpG island甲基化水平進行單變量和多變量生存分析。通過Kaplan-Meier生存分析曲線可以看出，MTIF2基因CpG island甲基化的高低與生存率無直接關系（HR=1.016，P=0.93）（圖4b）。

2.5 MTIF2基因CpG island甲基化不同特征間的差異隨著年齡增長，患者的甲基化水平降低（Plt;0.05）；黑人或非洲裔美國人的甲基化水平低于亞洲人和白種人（P值均lt;0.05）；臨床分期Ⅳ期患者的甲基化水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者（P值均lt;0.05）。不同性別、BMI和種族MTIF2基因CpG island甲基化水平不存在明顯差異（P值均gt;0.05）（圖5）。

2.6 MTIF2基因S-Shore甲基化生存曲線分析依照MTIF2的甲基化密度圖進行分組，中值線（Median=0.756）左側為低甲基化（n=189），右側為高甲基化（n=188）（圖6a）。使用Cox比例風險模型基于患者S-Shore甲基化水平執行單變量和多變量生存分析。通過Kaplan-Meier生存分析曲線可以看出，MTIF2基因S-Shore甲基化的高低與生存率無直接關系（HR=0.906，P=0.57）（圖6b）。

2.7 MTIF2基因S-Shore甲基化不同特征間的差異BMI在21.7～24.3 kg/m2時甲基化水平較高；黑人或非洲裔美國人的甲基化水平低于亞洲人和白種人（P值均lt;0.05）。不同年齡、性別、種族和臨床分期的MTIF2基因S-Shore甲基化水平不存在明顯差異（P值均gt;0.05）（圖7）。

2.8 MTIF2基因甲基化的All Cancer數據庫分析對MTIF2基因甲基化的所有探針進行All Cancer數據庫分析，得到294個比對項，對結果進行篩選后得到20個符合項（表1）。其中4個數據子集與HCC具有相關性（P值均lt;0.05）。

2.9 MTIF2基因甲基化的驗證分析經MTIF2甲基化檢測，應用單因素方差分析進行差異顯著性分析，結果表明HCCⅢ/Ⅳ期患者MTIF2甲基化水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者（32.66±3.38 vs 37.96±1.36，P=0.001），Ⅰ/Ⅱ期患者MTIF2甲基化水平明顯低于正常人群（37.96±1.36 vs 41.75±2.41，P=0.010），HCCⅢ/Ⅳ期患者MTIF2甲基化水平明顯低于正常人群（32.66±3.38 vs 41.75±2.41，Plt;0.05）。

3討論

研究發現MTIF2的甲基化與子宮頸癌的生存率顯著相關，在宮頸上皮內瘤變和子宮頸癌中，甲基化或羥甲基化水平與體細胞拷貝數變化之間沒有任何相關性［8-9］。本研究發現MTIF2的甲基化與HCC的生存率同樣具有顯著相關性。進一步分析發現，MTIF2基因N-Shore的低甲基化（βlt;0.056）會降低HCC的生存率。MTIF2基因CpG island和S-Shore甲基化沒有表現出生存率的明顯差異。

進一步分析不同患者年齡、性別、BMI、人種、種族、臨床分期等特征繪制MTIF2基因甲基化譜發現，年齡因素是甲基化水平高低的重要因素，隨年齡增長會降低MTIF2基因N-Shore和CpG island的甲基化水平。并且臨床分期Ⅳ期患者的甲基化水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者。臨床驗證結果表明：HCCⅢ/Ⅳ期患者MTIF2甲基化水平明顯低于Ⅰ/Ⅱ期患者和正常人群，驗證結果與前期統計分析結果一致。但受樣本數量影響，未發現Ⅰ期與Ⅱ期之間、Ⅲ期與Ⅳ期患者之間是否存在差異，后期有待進一步探討。

隨著分子診斷方法的進步，DNA甲基化用于評估癌前病變到早期HCC轉變的過程具有重要作用，并具有對肝硬化患者預后評估及預測的潛力［10］。例如RASSF1A、GSTP1、p14、CDH1、APC等基因的DNA高甲基化研究的較為深入，且部分已作為臨床檢驗項目開展，而有關低甲基化的相關研究較少。一項宮頸脫落細胞的表觀遺傳學研究發現，MTIF2基因的低甲基化會導致總體生存率顯著降低（HR=0.48，P=0.048）［11］。HCC中MTIF2的相關研究發現：（1）HCC組織中高表達的MTIF2來源于上皮細胞和肝細胞，MTIF2可能作用于超氧化物歧化酶2，調控活性氧通路，從而影響HCC的進展［12］；（2）MTIF2可抑制HCC細胞中藥物誘導的免疫原性細胞死亡，這些機制可能與MTIF2低甲基化影響HCC發生有關［13］。泛癌數據對比分析表明，MTIF2甲基化與12種腫瘤存在關聯，與HCC關系最為密切。

綜上，MTIF2的低甲基化是HCC發生發展的危險因素。但值得注意的是，在人類癌癥中，MTIF2在遺傳或表觀遺傳水平上的作用尚不清楚，值得進一步地探索。

倫理學聲明：本研究方案于2024年1月15日經由中國人民解放軍西部戰區總醫院倫理委員會審批，批號：2023EC5-ky055。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：謝華杰、常凱、王艷艷負責課題設計，資料分析，撰寫論文；謝華杰、那琬琳、蔡歡、劉霞、江忠勇、胡宗海、劉媛參與收集數據，修改論文；謝華杰、常凱負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

參考文獻：

[1]PANNEERSELVAM S，WILSON C，KUMAR P，et al.Overview of he?patocellular carcinoma：From molecular aspects to future therapeutic options[J].Cell Adh Migr，2023，17（1）：1-21.DOI：10.1080/19336918.2023.2258539.

[2]ZENG YY，FU J，LIN KY，et al.Current status and prospects of post?operative adjuvant therapy for hepatocellular carcinoma[J].Chin J Dig Surg，2024，23（2）：221-227.DOI：10.3760/cma.j.cn115610-20231128-00220.

曾永毅，傅俊，林孔英，等.肝細胞癌術后輔助治療的現狀與展望[J].中華消化外科雜志，2024，23（2）：221-227.DOI：10.3760/cma.j.cn115610-20231128-00220.

[3]CHANG K，NA WL，LIU CX，et al.A study on the mechanism of Avila?mycin intervention MTIF2 regulating ribosomal translation process to inhibit hepatitis B virus replication[J].Acta Univ Med Anhui，2022，57（2）：203-207.DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2022.02.008.

常凱，那琬琳，劉晨霞，等.阿維霉素干預MTIF2調控核糖體翻譯進程抑制乙型肝炎病毒復制的機制研究[J].安徽醫科大學學報，2022，57（2）：203-207.DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2022.02.008.

[4]WU DQ，LI YJ.Application of adoptive cell therapy in hepatocellular carcinoma[J].Immunology，2023，170（4）：453-469.DOI：10.1111/imm.13677.

[5]WANG J，WANG FF，WANG N，et al.Diagnostic and prognostic value of protein post-translational modifications in hepatocellular carci?noma[J].J Clin Transl Hepatol，2023，11（5）：1192-1200.DOI：10.14218/JCTH.2022.00006S.

[6]GRASSO DG，CHRISTIAN BE，SPENCER A，et al.Overexpression and purification of mammalian mitochondrial translational initiation factor 2 and initiation factor 3[J].Methods Enzymol，2007，430：59-78.DOI：10.1016/S0076-6879（07）30004-9.

[7]LI XD，CHEN JL，MENG J.Comprehensive analysis of the prognos?tic values and immune implication of ESYT3 in lung adenocarcinoma[J].Medicine（Baltimore），2023，102（35）：e34557.DOI：10.1097/MD.0000000000034557.

[8]XIE ZH，HUANG JP，LI YJ，et al.Single-cell RNA sequencing re?vealed potential targets for immunotherapy studies in hepatocellularcarcinoma[J].Sci Rep，2023，13（1）：18799.DOI：10.1038/s41598-023-46132-w.

[9]HAN YX，JI LY，GUAN YF，et al.An epigenomic landscape of cervi?cal intraepithelial neoplasia and cervical cancer using single-base resolution methylome and hydroxymethylome[J].Clin Transl Med，2021，11（7）：e498.DOI：10.1002/ctm2.498.

[10]XU RH，WEI W，KRAWCZYK M，et al.Circulating tumour DNA methyla?tion markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Nat Mater，2017，16（11）：1155-1161.DOI：10.1038/nmat4997.

[11]CHANG K，WANG YY，JIANG ZY，et al.Proteomic analysis and vali?dation of DNA repair regulation in the process of hepatocellular car?cinoma recurrence[J].J Clin Hepatol，2024，40（2）：319-326.DOI：10.12449/JCH240216.

常凱，王艷艷，江忠勇，等.肝細胞癌復發進程中DNA修復調節的蛋白質組學分析及驗證[J].臨床肝膽病雜志，2024，40（2）：319-326.DOI：10.12449/JCH240216.

[12]WANG Y，ZHANG JQ，YANG Y，et al.Single-cell analysis revealed that MTIF2 could promote hepatocellular carcinoma progression through modulating the ROS pathway[J].Heliyon，2024，10（14）：e34438.DOI：10.1016/j.heliyon.2024.e34438.

[13]XU DF，WANG Y，WU JC，et al.MTIF2 impairs 5 fluorouracil-medi?ated immunogenic cell death in hepatocellular carcinoma in vivo：Molecular mechanisms and therapeutic significance[J].Pharmacol Res，2021，163：105265.DOI：10.1016/j.phrs.2020.105265.

收稿日期：2024-07-18；錄用日期：2024-10-19

本文編輯：王瑩