丁香酚誘導(dǎo)煙草抗青枯病的效果及促生作用

關(guān)鍵詞：丁香酚；煙草；青枯病；誘導(dǎo)抗性；酶活性

煙草青枯病是一種由青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的細(xì)菌性病害，是煙草種植過(guò)程中的主要病害之一[1-2]。其初侵染源主要是病殘組織和土壤，種植過(guò)程中的各項(xiàng)農(nóng)業(yè)操作均可能導(dǎo)致煙株根系受損，使病菌從根部傷口進(jìn)行侵染。青枯雷爾氏菌侵染煙草后，會(huì)沿根系向上，進(jìn)入到根系皮層細(xì)胞或薄壁組織，通過(guò)分泌細(xì)胞壁降解酶破壞植物細(xì)胞壁，再侵入到維管束組織，在其中增殖并分泌大量胞外多糖，進(jìn)而阻塞和破壞寄主維管系統(tǒng)影響水分運(yùn)輸，致使寄主枯萎和死亡[3]。傳統(tǒng)的以化學(xué)農(nóng)藥為主的防治方式存在農(nóng)藥殘留、有害物質(zhì)積累等問(wèn)題，因此，需要尋找對(duì)環(huán)境友好的土傳病害防治方式。

丁香酚是從植物中提取的一種有機(jī)酚，該物質(zhì)低毒[4]、無(wú)殘留，對(duì)環(huán)境友好。丁香油的主要成分丁香酚，對(duì)玉米大斑、葡萄炭疽、番茄黑霉等植物常見(jiàn)病原菌存在較為明顯的抑制效果[5]，而且能夠破壞真菌細(xì)胞完整性、抑制真菌細(xì)胞能量代謝以及影響真菌轉(zhuǎn)錄水平，從而有效抑制三七根腐病菌，并提高鮮三七貯藏過(guò)程中的品質(zhì)[6]。Bowers等[7]發(fā)現(xiàn)，丁香油與其他植物提取精油復(fù)配后，加入到接種有含煙草疫霉孢子的土壤中，處理21d后，煙草疫霉的種群數(shù)量減少98.4%，有效抑制煙草病害。余帥[8]通過(guò)抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丁香精油（主要成分為丁香酚）對(duì)青枯菌等5種細(xì)菌具有明顯的抑菌效果。但目前僅有丁香酚對(duì)青枯菌的體外抑菌試驗(yàn)，其對(duì)煙草本身的影響，以及對(duì)煙草青枯病的防控作用和防病機(jī)制尚不明確。本研究擬通過(guò)測(cè)定施加丁香酚與否的盆栽煙草的青枯病發(fā)病率、農(nóng)藝性狀及防御相關(guān)物質(zhì)和酶活性變化，探討丁香酚對(duì)煙草青枯病的防治效果和防控機(jī)理。

1材料與方法

1.1供試藥劑與儀器

丁香酚（純度≥99%），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；甲醇、無(wú)水乙醇、H2SO4均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PBS、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；TTC購(gòu)自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。

恒溫箱（PYX-DHS500）購(gòu)自中國(guó)上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；BIORADimark酶標(biāo)儀購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；組合式高速振蕩培養(yǎng)箱ZQPZ-115S購(gòu)自中國(guó)天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.2煙草品種

供試品種云煙87，由湖北省煙草科學(xué)研究院提供。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1試驗(yàn)菌株分離 取青枯病發(fā)病煙苗莖部0.5g，在無(wú)菌條件下制備為細(xì)菌密度為1×10?1的菌懸液，依次稀釋成1×10?2、1×10?3、1×10?4的菌懸液，吸取合適稀釋度的樣品100μL注入NA固體培養(yǎng)基平皿涂布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1d，重復(fù)3次。取單一菌落劃線分離、培養(yǎng)，將菌落形態(tài)相似且出現(xiàn)頻率多的微生物作為試驗(yàn)菌種進(jìn)行分離純化。

1.3.2試驗(yàn)菌株鑒定 按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒方法提取細(xì)菌DNA，利用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），對(duì)藥物中分離菌落的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為模板DNA1μL，正反向引物各1μL，TaqDNA聚合酶Mix25μL，補(bǔ)充ddH2O至50μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min;95℃30s，53℃30s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物科技（上海）有限責(zé)任公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上使用Blast進(jìn)行同源性比較，下載同源性較高的序列采用MEGA-X軟件的Neighbor-Joining方法，1000次Bootstrap檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3試驗(yàn)濃度確定 用少量無(wú)水乙醇溶解丁香酚再用0.3%吐溫?20的水溶液稀釋，配制成有效濃度為1、5、10μL/mL三種不同濃度的溶液，取每種溶液10mL，對(duì)煙苗進(jìn)行灌根處理，以清水為對(duì)照。將煙苗放置在人工氣候箱（溫度25℃，濕度65%，光照14h/d）培養(yǎng)2d后，拍照并記錄煙苗生長(zhǎng)狀況，確定適宜的濃度用于下一步試驗(yàn)。

1.3.4盆栽誘抗效果評(píng)價(jià) 參考劉蕾等[9]方法稍加修改。用1μL/mL丁香酚對(duì)生長(zhǎng)一致的“三葉一心”煙苗進(jìn)行灌根處理，每株灌根10mL，以清水為對(duì)照，每處理重復(fù)6次。在灌根后第3天向煙苗根部加入青枯雷爾氏菌發(fā)酵液10mL，菌含量1×108CFU/mL，然后將煙苗放置在人工氣候箱（溫濕度、光照周期同1.3.3）培養(yǎng)15d，每5天記錄發(fā)病情況，按照公式（1）和（2）計(jì)算病情指數(shù)和相對(duì)防效[10]，標(biāo)準(zhǔn)參考GB/T23222—2008[11]。

其中DI是病情指數(shù)，G是發(fā)病煙株病情級(jí)別，D是G級(jí)別的發(fā)病煙株數(shù)目，T是煙株的總數(shù)目；CE是生防效果，DICK是對(duì)照組病情指數(shù)，DIT是處理組病情指數(shù)。

1.3.5農(nóng)藝性狀測(cè)定 施加丁香酚15d后，測(cè)量煙苗的葉長(zhǎng)、葉寬、株高和莖圍，標(biāo)準(zhǔn)參考YC/T142—2010[12]。

1.3.6生理生化指標(biāo)測(cè)定 煙草處理方法同1.3.4。分別取灌根后0、15d的煙草葉片用于測(cè)定光合色素含量，根系用于測(cè)定根系活力；取灌根后0、5、10、15d的葉片測(cè)定其余生理生化指標(biāo)。

葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量參照劉嫻等[13]方法測(cè)定；根系活力測(cè)定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[14]；葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、硝酸還原酶酶（NR）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、MDA和H2O2含量均采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用Excel2016軟件整理數(shù)據(jù)，使用DPS9.01軟件分析數(shù)據(jù)，LSD（最小顯著性差異）多重比較法（plt;0.05）進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，使用Origin2021軟件作圖。

2結(jié)果

2.1試驗(yàn)菌種分子生物學(xué)鑒定

將純化目標(biāo)菌的16SrDNA序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示與Ralstoniasolanacearum（Genbankaccessionnumber：ON247041.1）聚為一支，自展值達(dá)到99（圖1），確認(rèn)目標(biāo)菌株為青枯雷爾氏菌，命名為R.solanacearumLF-17（Genbankaccessionnumber：PP868-626）。

2.2試驗(yàn)濃度確定

清水和3種不同濃度丁香酚溶液處理后，煙苗生長(zhǎng)情況如圖2所示。清水處理和1μL/mL丁香酚處理后的煙苗差別不大，5μL/mL丁香酚處理后的煙苗莖部出現(xiàn)損傷，10μL/mL的丁香酚處理后煙苗除莖部外，葉片也略有損傷。綜上，確定灌根時(shí)所用丁香酚濃度為1μL/mL。

2.31μL/mL丁香酚對(duì)煙草青枯病的防效

盆栽結(jié)果顯示，1μL/mL丁香酚處理可以顯著降低煙草青枯病的病情指數(shù)（圖3），在接種青枯雷爾氏菌后的第5、10、15天，處理組的病情指數(shù)分別為1.66、22.37和40.09，顯著低于CK組的10.98、62.31和86.15，相對(duì)防效分別達(dá)84.87%、64.10%和53.46%。

2.4丁香酚對(duì)煙草農(nóng)藝性狀的影響

施加丁香酚15d后，煙苗葉長(zhǎng)、葉寬、株高、莖圍較CK組均有提升，分別增加48.80%、35.06%、22.44%、8.98%（表1），說(shuō)明丁香酚可以促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)。

2.5丁香酚對(duì)煙草葉片光合色素的影響

CK組與丁香酚處理組的葉片光合色素含量變化如圖4所示。施加丁香酚15d后，處理組的葉片光合色素含量均顯著高于CK組。其中處理組葉綠素a含量為2.59mg/g，較CK組提高48.06%；葉綠素b含量為1.56mg/g，較CK組提高47.17%；類(lèi)胡蘿卜素含量為0.47mg/g，較CK組提高77.87%。

2.6丁香酚對(duì)煙草根系活力和硝酸還原酶活性的影響

丁香酚處理15d后，煙株根系活力值為277.43μg/（g·h），較CK組提高49.25%。NR酶活性在處理過(guò)程中呈不斷上升趨勢(shì)，且在15d時(shí)達(dá)最大值1.99U/g，相較于CK組顯著提高65.42%（圖5）。

2.7丁香酚對(duì)煙草抗逆相關(guān)酶活性、MDA和H2O2含量的影響

施加丁香酚后，POD、SOD、PPO和PAL的酶活性隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)呈不斷上升趨勢(shì)，且均顯著高于CK組。在15d時(shí)各酶的活性達(dá)到最大值，POD活性為25.99U/（g·min），高出CK組123.44%；SOD活性值為8.53U/（g·min），高出CK組46.89%；PPO活性值為1.00U/（g·min），高出CK組104.20%；PAL含量為11922mg/（g·h），高出CK組46.89%。

MDA和H2O2的含量在丁香酚處理過(guò)程中也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但均顯著低于CK組。在15d時(shí)處理組的MDA含量為1.51μmol/g，較CK組降低30.43%；H2O2含量為0.84μg/g，較CK組降低55.58%（圖6）。

3討論

丁香酚具有抗癌、抗炎、抗病毒等作用，還對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等細(xì)菌以及鏈格孢菌、灰霉菌等真菌具有廣譜且較強(qiáng)抑制作用[15]。林勇等[16]從常見(jiàn)中藥材中發(fā)現(xiàn)丁香提取液對(duì)青枯雷爾氏菌有明顯的抑菌效果，通過(guò)GC-MS鑒定其有效抑菌成分為丁香酚。本研究結(jié)果也表明，丁香酚對(duì)煙草青枯病具有良好的防控作用，1μL/mL的丁香酚灌根處理能顯著降低青枯病的病情指數(shù)，防效達(dá)53.46%。

植物光合色素主要包括葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素，是植物葉片光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量高低能反映植物的生長(zhǎng)狀況和葉片光合能力[17]。本研究中施加丁香酚后煙葉的葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素含量均顯著增加，說(shuō)明丁香酚可以通過(guò)提高光合色素含量來(lái)增強(qiáng)葉片對(duì)光能的利用效率，從而促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育。

根系活力是植株根系生理活性強(qiáng)弱的直接表征[18]；NR是植物體內(nèi)硝態(tài)氮還原的限速酶，其活性會(huì)影響煙草的氮代謝能力，而根是吸收硝態(tài)氮的主要器官，根吸收的硝態(tài)氮通過(guò)NR轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮供給植物生長(zhǎng)[19]。本研究表明，丁香酚可以提高煙草的根系活力和NR活性，促進(jìn)煙株根系發(fā)育。

當(dāng)青枯雷爾氏菌侵染煙草時(shí)，煙草體內(nèi)活性氧和自由基的合成與分解平衡被打破，活性氧和自由基在煙草細(xì)胞內(nèi)累積[20]。H2O2是一種活性氧分子，對(duì)植物體同時(shí)具有保護(hù)和毒害的雙重作用，低濃度時(shí)可以作為信號(hào)分子參與植物脅迫響應(yīng)，而當(dāng)植物細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度較高時(shí)則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，會(huì)氧化細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞膜造成損害，氧化的最終產(chǎn)物為MDA[21]。有研究報(bào)道丁香酚具有氧自由基的清除作用[22]，本研究也發(fā)現(xiàn)施加丁香酚后，可以提高煙草抗氧化相關(guān)酶POD和SOD的活性，減少煙草細(xì)胞內(nèi)H2O2和MDA的含量，消除煙草在青枯雷爾氏菌侵染壓力下產(chǎn)生的過(guò)量自由基和活性氧，有效保護(hù)細(xì)胞膜，提高植物的抗氧化能力。

PPO和PAL是植物體內(nèi)重要的防御酶，酚類(lèi)物質(zhì)經(jīng)PPO氧化為醌類(lèi)而發(fā)揮抗菌作用[23]。PAL是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸，然后在其它酶的作用下轉(zhuǎn)化為香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)和木質(zhì)素等次生產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在抵抗病原體和植食性昆蟲(chóng)的侵害方面具有重要的作用[24]。本研究中煙草葉片的PPO和PAL活性在施加丁香酚后均顯著提高，這與臍橙經(jīng)丁香提取液處理后的結(jié)果相似[25]，表明丁香酚能夠明顯誘導(dǎo)煙草對(duì)青枯雷爾氏菌的抗性。

4結(jié)論

使用濃度為1μL/mL丁香酚處理煙草3d后接種煙草青枯菌，接種15d時(shí)對(duì)煙草青枯病的防效達(dá)53.46%。丁香酚處理通過(guò)提高煙株葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素的含量來(lái)促進(jìn)光合作用，通過(guò)提高根系活力和NR活性來(lái)促進(jìn)根系發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，可以誘導(dǎo)煙草對(duì)青枯雷爾氏菌的抗性，提高煙草POD、SOD、PPO和PAL的活性并降低MDA和H2O2的含量。