貝萊斯芽孢桿菌與化學(xué)藥劑協(xié)同防治煙草棒孢霉葉斑病

關(guān)鍵詞：煙草；多主棒孢霉；貝萊斯芽孢桿菌；38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑；葉際微生物

多主棒孢霉Corynesporacassiicola可侵染橡膠、黃瓜、木薯、煙草等多種寄主[1]，引起葉斑病。1998年，我國首次在貴州煙區(qū)發(fā)現(xiàn)其侵染煙草葉片[2]，損失率達15%～30%，后相繼在廣西[3]、江西[4]、重慶[5]等煙區(qū)被報道。煙草棒孢霉葉斑病主要發(fā)生于中下部葉，受侵染葉片初期產(chǎn)生暗綠色小點，后擴展成圓形或不規(guī)則帶有黃色暈圈的褐色斑點，嚴重時聯(lián)合成不規(guī)則的褐色大病斑[6]。近年來，煙草棒孢霉葉斑病分布范圍和危害呈擴大和上升趨勢，引起各煙葉產(chǎn)區(qū)的重視。

化學(xué)防治是植物病害防治的重要方式。目前，對棒孢霉葉斑病有良好防治效果的化學(xué)藥劑，主要有氟啶胺、戊唑醇、咪鮮胺、吡唑醚菌酯和啶酰菌胺等[7-8]。然而，化學(xué)藥劑長期不合理使用，易造成農(nóng)藥殘留、生態(tài)系統(tǒng)失衡、病原菌產(chǎn)生耐藥性等問題。相對于化學(xué)防治，生物防治是一種對環(huán)境友好的防治方式，但易受環(huán)境條件的影響，存在防效穩(wěn)定性差、效果不理想、顯效慢等問題。生物-化學(xué)防治的聯(lián)合施用可彌補二者各自的局限性和不足，提高防治效果和穩(wěn)定性，作為一種切實可行的防治策略日益受到重視[9]。目前尚未見針對煙草棒孢霉葉斑病的生物-化學(xué)聯(lián)合防治，因此有必要開展二者之間的復(fù)配篩選，尋找有效控制該病害發(fā)生的生物-化學(xué)復(fù)配劑。

本研究采用菌絲生長速率法測定了5種化學(xué)藥劑對多主棒孢霉的毒力，并與抑菌效果較好的貝萊斯芽孢桿菌Y19復(fù)配，探討其協(xié)同防治煙草棒孢霉葉斑病的效果，篩選出最佳配比，并通過盆栽試驗測定了防治效果；同時采用擴增子測序法分析復(fù)配劑對葉際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為生物防治與化學(xué)藥劑協(xié)同防治煙草棒孢霉葉斑病提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis菌株Y19由本課題組從貴州省遵義市煙草棒孢霉葉斑病發(fā)病區(qū)的健康煙株體內(nèi)分離獲得（CGMCCNo.29165）；煙草棒孢霉葉斑病病原菌多主棒孢霉Corynesporacassiicola，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院提供。

供試煙草品種：云煙87，為貴州煙區(qū)主栽品種。

供試藥劑：38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑（吡唑醚菌酯含量12.8%、啶酰菌胺含量25.2%），河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司；200g/L氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑（苯醚甲環(huán)唑125g/L、氟唑菌酰羥胺75g/L），先正達南通作物保護有限公司；98%氟啶胺TC，揚州遠華化工有限公司；97%戊唑醇TC，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司；97%咪鮮胺TC，湖北晟隆化工有限公司。

培養(yǎng)基：（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1000mL。（2）LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂粉15g，純水定容至1000mL，pH調(diào)整至7.0。（3）NA培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，純水定容至1000mL，pH調(diào)整至7.0。

1.2化學(xué)藥劑對多主棒孢霉的毒力測定

采用菌絲生長速率法[10]測定化學(xué)藥劑對多主棒孢霉菌絲生長的影響。38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑的試驗梯度濃度為0.2、0.6、1、1.5、3、5、8mg/L；200g/L氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑的試驗梯度濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/L；氟啶胺和咪酰胺的試驗梯度濃度為0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2mg/L；戊唑醇的試驗梯度濃度為0.2、0.4、0.6、1、2、4、6mg/L。采用十字交叉法測量各處理菌落直徑，并計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑?處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%（1）

采用DPS軟件建立化學(xué)藥劑抑制煙草棒孢霉菌絲生長的毒力回歸方程，計算藥劑半數(shù)最大效應(yīng)質(zhì)量濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)r值。

1.3化學(xué)藥劑與Y19菌株的相容性測定

1.3.1抑菌圈法 挑取Y19單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h；以10%接種量將Y19菌液轉(zhuǎn)接至NA固體培養(yǎng)基中制成含菌平板，凝固后在平板中央滴加入10μL化學(xué)藥劑[濃度為MIC（最小抑菌濃度minimuminhibitoryconcentration）]，以助溶劑為對照，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h后，用十字相乘法測量各含菌平板上抑菌圈的直徑。

1.3.2活菌數(shù)法 參照谷春艷等[11]的方法測定化學(xué)藥劑與生防菌Y19的生物相容性。以化學(xué)藥劑10000mg/L濃度為母液，分別配制成終濃度為25、50、100、150、200mg/L的含藥平板。取10μLY19菌懸液滴加涂布于含藥平板上，37℃恒溫培養(yǎng)12h后觀察計數(shù)。以不加化學(xué)藥劑的PDA平板為對照，每處理重復(fù)3次。

1.4復(fù)配劑對多主棒孢霉的毒力測定

挑取Y19單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)8～10h，用無菌水調(diào)整菌液濃度至1×107CFU/mL，作為備用菌液；用無菌水將38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑配制成15mg/L濃度；按照Y19菌懸液與化學(xué)藥劑（38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑）的體積比=10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10混合形成復(fù)配液。

將多主棒孢霉菌餅（直徑約6mm）接種于PDA平板中央，在距中央2.5cm左右處放置牛津杯，取150μL復(fù)配液于牛津杯中，以無菌水作為對照。置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)7～9d。采用十字交叉法測量各處理菌落直徑，計算菌絲實際抑制生長率、預(yù)期抑制生長率和毒力比率。

毒力比率gt;1，表示增效作用；毒力比率lt;1，表示拮抗作用；毒力比率=1，表示相加作用[12]。其計算公式為：

1.5復(fù)配劑防治煙草棒孢霉葉斑病的室內(nèi)防效測定

根據(jù)1.4試驗結(jié)果，分別以Y19菌懸液（1×107CFU/mL）、38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑（15mg/L）、Y19菌懸液與38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑復(fù)配液（體積比2∶8）進行室內(nèi)防效測定，以清水噴霧為對照，驗證復(fù)配液對煙草棒孢霉葉斑病的協(xié)同防治效果。

將多主棒孢霉菌餅（直徑約6mm）接種于PDA平板中央，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14d左右，無菌水洗脫過濾收集孢子。采用血球計數(shù)法將孢子懸浮液濃度調(diào)整至1×106個孢子/mL備用。

當煙苗長出5～6片真葉時，選取生長一致的健康煙株進行試驗。共設(shè)4個處理組：（1）病原菌處理組，葉面噴施清水；（2）生防菌處理組，葉面噴施Y19菌懸液；（3）化學(xué)藥劑處理組，葉面噴施38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑；（4）復(fù)配劑處理組，葉面噴施復(fù)配劑（Y19+38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑）。上述各處理組的噴施量均為30mL/株。噴施24h后，4組處理葉面均噴施接種多主棒孢霉孢子懸浮液[1×106個（孢子）/mL，30mL/株]。棒孢霉接種14d后，參照GB/T23222—2008[13]調(diào)查記錄煙草棒孢霉葉斑病的發(fā)病情況，計算病情指數(shù)和相對防效。3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)12株煙。

1.6復(fù)配劑對煙草葉際真菌群落的影響

于2024年6月在貴州遵義煙田進行。旺長期施藥，共設(shè)4個處理：38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑、Y19菌懸液、復(fù)配劑（Y19+38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑）和清水對照。采用葉面噴施法，對煙株正、反葉面均勻噴施，噴施程度以葉面潮濕而無液滴落下為準。處理間設(shè)隔離行，避免重噴、漏噴或影響到相鄰處理。施藥15d后，采集煙葉樣品，將全株煙葉分為上、中、下三部分，每部分葉片平均采取1g，三部分葉片混合后裝入50mL離心管中。5次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)6株煙苗。

采用CTAB法提取煙葉葉際微生物基因組DNA。以上述總DNA為模板，以真菌引物ITS1-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2-R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對葉際微生物基因組DNA的ITS1-ITS2區(qū)域進行PCR擴增；PCR產(chǎn)物切膠回收后進行文庫構(gòu)建，并通過IlluminaMiSeqPE300平臺進行測序。以上分析均在上海美吉生物科技有限公司完成。

1.7數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用DPS7.05軟件，計算化學(xué)藥劑的毒力回歸方程及EC50；采用SPSS20.0軟件，進行單因素ANOVA檢驗及數(shù)據(jù)的差異顯著性分析（plt;0.05）。

2結(jié)果

2.15種化學(xué)藥劑對多主棒孢霉的毒力分析

由表1可知，5種化學(xué)藥劑對多主棒孢霉均有較強的抑制作用，隨著藥劑濃度的增加，其抑制作用逐漸增強；不同藥劑對多主棒孢霉的毒力大小依次為咪鮮胺、氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑、氟啶胺、吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑和戊唑醇，EC50值為0.0782～2.5151mg/L。根據(jù)上述結(jié)果，選擇咪鮮胺、氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑、氟啶胺和吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑共4種藥劑作后續(xù)相容性分析。

2.2化學(xué)藥劑與貝萊斯芽孢桿菌Y19的相容性分析

通過抑菌圈法初步評估4種化學(xué)藥劑與貝萊斯芽孢桿菌Y19的生物相容性。結(jié)果表明，在Y19含菌平板中央，滴加吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑和氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑未形成透明圈，而滴加氟啶胺和咪鮮胺則形成明顯透明圈（圖1），說明吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑和氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑與Y19的生物相容性較好，隨后通過平板計數(shù)法進行分析。由表2可知，貝萊斯芽孢桿菌Y19與吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑的相容性最佳。在吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑含量為25～200mg/L時，Y19均能正常生長，與對照相比含菌量無顯著差異。故選擇吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑與Y19菌株進行復(fù)配。

2.3Y19與吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑復(fù)配劑對多主棒孢霉的室內(nèi)毒力分析

將Y19菌懸液與吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑，以不同體積比復(fù)配進行抑菌試驗。結(jié)果如表3和圖2所示，不同體積比復(fù)配的Y19與吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑復(fù)配劑均具有增效作用。其中VY19∶V吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑=2∶8時，對多主棒孢霉菌絲的抑制效果最佳，增效作用最強，實際抑制效果為72%，毒力比率為1.21。因此，復(fù)配的最佳配比為VY19∶V吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑=2∶8。

2.4Y19與吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑復(fù)配劑對煙草棒孢霉葉斑病的盆栽防效

盆栽試驗結(jié)果表明，病原菌處理組煙草棒孢霉葉斑病發(fā)病嚴重，病斑面積較大，伴有較多帶有黃色暈圈的不規(guī)則褐色病斑，基部葉片變黃萎蔫，病情指數(shù)為74.10（圖3A和表4）。Y19菌懸液處理的煙草表現(xiàn)為葉片發(fā)黃，部分葉片產(chǎn)生褐色病斑和黃色小點（圖3B）；經(jīng)藥劑和復(fù)配劑處理的煙草發(fā)病癥狀較輕（圖3C、D）。生防菌Y19、化學(xué)藥劑和復(fù)配劑各處理組對煙草棒孢霉葉斑病均具有一定的防效，防效為26.70%～57.60%。其中復(fù)配劑（Y19與吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑）的防效最高，為57.60%。以上結(jié)果表明，Y19與化學(xué)藥劑（38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑）復(fù)配施用的防效均高于二者單獨處理的效果。

2.5Y19與吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑復(fù)配劑對煙草葉際真菌群落的影響

采用Illumina高通量測序技術(shù)，對Y19、吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑和復(fù)配劑施藥后的煙株葉際真菌群落進行分析。基于OTU水平進行Alpha多樣性指數(shù)分析，通過Shannon指數(shù)、辛普森指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)對煙草葉際真菌多樣性進行評估。由表5可知，化學(xué)藥劑和復(fù)配劑試驗組的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均明顯高于Y19菌懸液和對照組，而化學(xué)藥劑和復(fù)配劑試驗組的Simpson指數(shù)明顯低于Y19菌懸液和對照組。Simpson指數(shù)值越大表明群落多樣性越低，其他指數(shù)值越大表明相應(yīng)的群落豐富度、均勻度和多樣性越高，這說明化學(xué)藥劑和復(fù)配劑試驗組的煙草葉際真菌群落具有更高的物種多樣性。

Lefse分析結(jié)果（圖4）表明，在屬水平上，化學(xué)藥劑、生防菌Y19和復(fù)配劑施用后煙草葉際真菌高氏白粉菌屬（Golovinomyces）顯著降低，化學(xué)藥劑處理后的煙草葉際線黑粉酵母屬（Filobasidium）、Kondoa、外囊菌屬（Taphrina）、Dothideomycetes和葡萄孢屬（Botrytis）5個真菌屬顯著富集；施用生防菌Y19后的煙草葉際鏈格孢屬（Alternaria）和柱隔孢屬（Ramularia）兩個真菌屬顯著富集；而復(fù)配劑處理的煙草葉際木耳屬（Auricularia）、暗色球菌屬（Phaeococcomyces）兩個真菌屬顯著富集。

3討論

芽孢桿菌（Bacillusspp.）是一類對植物生長有促進作用、對環(huán)境和人畜安全的有益細菌[14]，不僅可以通過提高營養(yǎng)元素的可利用性，降低乙烯含量或者分泌吲哚乙酸、分裂素、亞精胺、揮發(fā)性化合物等方式，促進植物生長，還能夠合成抗菌物質(zhì)，直接殺死病原菌或抑制病原菌生長[15-16]；此外，其合成的脂肽化合物能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，進而提高植物抗病性[17]。目前已將芽孢桿菌與殺菌劑復(fù)配，包括枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等多個菌種，這些研究經(jīng)過驗證能成功用于防治多種植物病害。如甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌TA-1菌株與氟醚菌酰胺復(fù)配施用，對番茄灰霉菌菌絲生長的抑制效果顯著高于單劑處理，且二者聯(lián)合施用的室內(nèi)防效可達到70.16%，明顯高于單劑施用組[18]；短小芽孢桿菌AR03與噻菌銅復(fù)配劑在體積比為5∶5時，對青枯雷爾氏菌的抑制效果顯著，室內(nèi)防效達到68.77%，明顯優(yōu)于單劑噻菌銅和生防菌AR03[19]。本研究通過室內(nèi)毒力測定和活菌數(shù)計數(shù)法，篩選出相容性最佳的復(fù)配組合（貝萊斯芽孢桿菌Y19與38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑），Ｖ菌∶Ｖ藥=2∶8時，對多主棒孢霉菌落生長的抑制效果最好，實際抑制效果為72%，毒力比率為1.21，盆栽試驗防效為57.6%，高于兩單劑防治效果。本研究利用生物-化學(xué)協(xié)同防治策略，為煙草棒孢霉葉斑病的防治提供了一種有效可行的方法，也為今后開發(fā)新型復(fù)配藥劑防治煙草病害提供了理論依據(jù)。

葉際微生物是植物生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有促進植物生長和防御病害等重要生態(tài)功能。煙草葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與病害發(fā)生密切相關(guān)[20]。化學(xué)藥劑直接噴施植物葉片，殺死病原菌的同時也會影響葉際微生物群落結(jié)構(gòu)。如波爾多液施用后，煙草葉際真菌群落的多樣性顯著增加，且波爾多液不僅作用于鏈格孢屬等植物病原菌，對鞘脂單胞菌屬、Kosakonia等有益菌群也產(chǎn)生了抑制作用[21]。郭沫言等[22]在多抗霉素對煙草靶斑病的研究中發(fā)現(xiàn)，多抗霉素通過作用于立枯絲核菌、尾孢屬、枝孢屬、甲基桿菌屬等葉際真菌和細菌，影響微生物菌群變化。本研究中，38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑和復(fù)配劑試驗組的煙草葉際真菌群落，具有更高的物種多樣性。38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑和復(fù)配劑處理后，葉際高氏白粉菌屬（Golovinomyces）顯著降低。其中38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑處理的煙草葉際優(yōu)勢真菌為線黑粉酵母屬（Filobasidium）、Kondoa、外囊菌屬（Taphrina）、Dothideomycetes和葡萄孢屬（Botrytis），而復(fù)配劑處理的煙草葉際優(yōu)勢真菌為木耳屬（Auricularia）和暗色球菌屬（Phaeococcomyces）。本研究結(jié)果顯示，化學(xué)藥劑和復(fù)配劑的施用會導(dǎo)致煙草葉際微生物群落的變化，這與前人研究結(jié)果一致[23]。本研究采用Illumina高通量測序技術(shù)對煙草葉際微生物群落進行了初步分析，為進一步驗證結(jié)果，后續(xù)還需對葉際微生物進行分離和鑒定。

本研究打破單一使用化學(xué)藥劑防控病害的局限，嘗試將生防菌與化學(xué)藥劑復(fù)配達到協(xié)同防治煙草棒孢霉葉斑病的作用，并運用高通量測序技術(shù)檢測其對煙草葉際真菌群落的影響，為該病害的菌藥聯(lián)用防治提供理論參考。

4結(jié)論

本研究篩選出具有較好生物相容性的復(fù)配組合（貝萊斯芽孢桿菌Y19與吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑）。貝萊斯芽孢桿菌Y19（1×107CFU/mL）與38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑（15mg/L）體積比為2∶8時，增效作用最強，菌藥復(fù)配劑的室內(nèi)防效達到57.60%，優(yōu)于化學(xué)藥劑38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑和生防菌Y19的防效。同時，菌藥復(fù)配劑處理能提高煙草葉際真菌群落多樣性和豐富度。因此，貝萊斯芽孢桿菌Y19與38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺懸浮劑聯(lián)用可用于防治煙草棒孢霉葉斑病。