免疫相關基因對頭頸部鱗狀細胞癌患者預后的影響

[摘要]"目的"通過生物信息學方法對頭頸部鱗狀細胞癌（head"and"neck"squamous"cell"carcinoma，HNSCC）患者的基因表達進行分析，尋找影響HNSCC患者預后的免疫相關基因，探索HNSCC新的治療靶點。方法"本研究基于癌癥基因組圖譜（The"Cancer"Genome"Atlas，TCGA）和基因表達綜合數據庫，下載HNSCC和非腫瘤組織樣本的RNA測序數據。分別對兩數據庫樣本進行差異表達基因分析和加權基因共表達網絡分析，篩選免疫相關基因。采用單因素Cox回歸、Lasso回歸和多因素Cox回歸分析識別出與HNSCC預后顯著相關的基因，并以此為基礎計算每個TCGA樣本的風險評分，構建相關預后模型。根據風險評分中位數將樣本分為高、低風險組；對高、低風險組進行基因差異表達分析，揭示不同免疫狀態下的基因表達變化，并對差異基因進行通路富集分析。結果"篩選發現MS4A1、IL12RB2、DMBT1、LTF是影響HNSCC患者預后的免疫相關基因。其中MS4A1和IL12RB2在HNSCC中高表達，DMBT1和LTF低表達。HNSCC死亡組的風險評分顯著高于生存組。風險評分可作為HNSCC的獨立預后指標。高、低風險組差異基因顯著富集于免疫應答調節細胞表面受體信號通路。結論"MS4A1、IL12RB2、DMBT1、LTF可用于HNSCC的風險評估、疾病監測和療效評估。免疫反應在HNSCC患者的預后中至關重要，進一步的研究有望推動新治療策略的開發。

[關鍵詞]"頭頸部鱗狀細胞癌；免疫；預后；生物信息學

[中圖分類號]"R653；R739.91""""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.07.009

Effect"of"immune-related"genes"in"the"prognosis"of"patients"with"head"and"neck"squamous"carcinoma

SHI"Chenxue1，"XU"Min2，"XU"Yuxin1，"WANG"Jian3，"WU"Zhenhua1

1.Department"of"Otolaryngology，"Head"and"Neck"Surgery，"Affiliated"Lihuili"Hospital"of"Ningbo"University，"Ningbo"315000，"Zhejiang，"China;"2.Department"of"Neurology，"the"Affiliated"Hospital"of"Xuzhou"Medical"University，"Xuzhou"221006，"Jiangsu，"China;"3.Department"of"Otolaryngology，"Head"and"Neck"Surgery，"the"Affiliated"People’s"Hospital"of"Ningbo"University，"Ningbo"315040，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"analyze"the"gene"expression"of"patients"with"head"and"neck"squamous"cell"carcinoma"（HNSCC）"using"bioinformatics"methods，"identifying"immune-related"genes"that"impact"prognosis"and"exploring"new"therapeutic"targets"for"HNSCC."Methods"This"study"was"based"on"The"Cancer"Genome"Atlas"（TCGA）"and"Gene"Expression"Omnibus"database"to"download"RNA"sequencing"data"from"HNSCC"and"non-tumor"tissue"samples."Differential"expression"gene"analysis"and"weighted"gene"co-expression"network"analysis"were"performed"respectively"to"screen"immune-related"genes."Univariate"Cox"regression，"Lasso"regression"and"multifactor"Cox"regression"analyses"were"used"to"identify"the"genes"significantlynbsp;associated"with"HNSCC"prognosis，"and"on"this"basis，"the"risk"score"of"each"TCGA"sample"was"calculated"and"the"correlation"prognosis"model"was"constructed."The"sample"was"divided"into"high"and"low"risk"groups"according"to"the"median"risk"score."Gene"differential"expression"analysis"was"performed"in"high"and"low"risk"groups"to"reveal"gene"expression"changes"under"different"immune"states，"and"pathway"enrichment"analysis"was"performed"for"differential"genes."Results"Screening"identified"MS4A1，"IL12RB2，"DMBT1"and"LTF"as"immune-related"genes"affecting"the"prognosis"of"HNSCC."Among"them，"MS4A1"and"IL12RB2"were"highly"expressed"in"HNSCC，"and"DMBT1"and"LTF"were"lowly"expressed."Risk"score"of"HNSCC"death"group"was"significantly"higher"than"that"of"the"survival"group."Risk"score"could"be"used"as"an"independent"prognostic"indicator"for"HNSCC."Differential"genes"in"high"and"low"risk"groups"were"significantly"enriched"in"immune"response-regulating"cell"surface"receptor"signaling"pathways."Conclusion"MS4A1，"IL12RB2，"DMBT1"and"LTF"can"be"used"for"risk"assessment，"disease"surveillance"and"efficacy"evaluation"of"HNSCC."The"immune"response"is"crucial"in"the"prognosis"of"HNSCC"patients，"and"further"studies"are"expected"to"drive"the"development"of"new"therapeutic"strategies.

[Key"words]"Head"and"neck"squamous"cell"carcinoma;"Immunity;"Prognosis;"Bioinformatics

頭頸部鱗狀細胞癌（head"and"neck"squamous"cell"carcinoma，HNSCC）是全球高發惡性腫瘤之一，其起源于口腔黏膜、下咽和喉部的上皮組織，臨床表現復雜且預后較差[1]。據報道，2022年HNSCC占頭頸部腫瘤相關死亡人數的78%，發病率和死亡率不斷上升[2]。HNSCC的治療手段包括手術、放療、化療和靶向治療等，但總體生存率較低，尤其是晚期患者。因此，當務之急是探索更為有效的治療策略。隨著腫瘤免疫學的發展，免疫治療逐漸成為HNSCC治療的研究熱點，為HNSCC患者提供維持長期緩解的新選擇[3]。免疫基因在腫瘤的發生、發展及治療中扮演重要角色，而生物信息學可為發現新的免疫治療靶點提供有力工具。本研究通過差異表達基因分析和加權基因共表達網絡分析（weighted"gene"co-expression"network"analysis，WGCNA）篩選HNSCC的免疫相關基因，探討其與預后的關系，并通過通路富集分析深入解析HNSCC潛在的致病機制，為HNSCC個體化治療和新療法開發提供理論依據。

1""資料與方法

1.1""一般資料

本研究使用多種數據進行HNSCC轉錄組分析。從癌癥基因組圖譜（The"Cancer"Genome"Atlas，TCGA）數據庫下載515份HNSCC樣本和44份非腫瘤組織樣本的RNA測序數據，并通過癌癥基因組學數據分析平臺提取患者的年齡、性別、生存時間和生存狀態等臨床信息。同時，從基因表達綜合數據庫獲取包含14例HNSCC和11例非腫瘤組織樣本的GSE143224數據集。

1.2""篩選差異表達基因

使用R語言（版本4.4.1）DESeq2軟件包對TCGA數據庫獲得的515份HNSCC樣本和44份非腫瘤組織樣本進行差異表達基因分析，以Plt;0.05且|logFC|≥1為條件篩選顯著的差異表達基因。

1.3""WGCNA

利用limma軟件包對GSE143224數據集進行差異表達基因分析。通過篩選出|logFC|gt;0.5的基因為后續WGCNA奠定基礎。選取R2"gt;0.9為最佳power值，設定最小模塊基因數為30，采用動態切割樹法對基因模塊進行合并。

1.4""分析篩選免疫預后相關基因

采用ESTIMATE軟件包對GSE143224數據集中腫瘤樣本進行腫瘤微環境基質評分，以評估腫瘤微環境的組成和特征。計算WGCNA構建的模塊特征矩陣與免疫評分之間的相關性及其顯著性水平。為識別關鍵基因，將與免疫評分顯著相關的模塊基因與來自TCGA數據庫的差異表達基因進行交集分析，并通過韋恩圖可視化結果。對這些關鍵基因進行單因素Cox回歸、Lasso回歸和多因素Cox回歸分析，以篩選與生存率顯著相關的基因。通過人類蛋白質圖譜（Human"Protein"Atlas，HPA）數據庫的免疫組織化學數據進一步評估這些基因在癌和癌旁組織間的表達差異。

1.5""風險評分與預后的相關性分析

基于上述方法篩選出影響HNSCC預后的免疫相關基因，計算TCGA數據庫每個樣本的風險評分。采用Wilcoxon檢驗評估風險評分與患者生存狀態的相關性。進一步將風險評分與臨床特征進行單因素、多因素Cox回歸分析，并構建列線圖評估患者預后。

1.6""高、低風險組差異基因的富集分析

根據計算得到的風險評分中位數將TCGA數據庫樣本分為低風險組和高風險組，隨后通過差異表達分析，篩選出在高、低風險組之間差異顯著的基因，篩選標準為Plt;0.01且|logFC|gt;2。使用clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot和ggplot2軟件包，對篩選出的差異表達基因進行基因本體論（gene"ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）通路富集分析。

2""結果

2.1""關鍵差異表達基因的篩選

通過TCGA數據庫樣本的差異表達基因分析，共篩選出4810個差異表達基因，其中2414個基因上調，2396個基因下調，見圖1。

2.2""篩選免疫預后相關基因

對GSE143224數據集進行腫瘤微環境基質評分，根據尺度獨立性和平均連通性，選擇軟閾值功率為10，利用該功率共生成16個模塊，并將部分模塊進行合并，模塊特征基因聚類結果見圖2A。腫瘤微環境基質與基因模塊的相關性分析結果表明，綠色模塊與免疫評分呈現最高的正相關（r=0.91），與腫瘤純度呈現最高的負相關性（r=–0.89），見圖2B。將綠色模塊基因與獲取自TCGA數據庫的差異表達基因進行交集分析，鑒定出75個HNSCC的免疫相關基因，見圖2C。通過單因素Cox回歸分析，進一步篩選出22個基因作為影響HNSCC患者預后的潛在危險因素（Plt;0.05），見表1。Lasso回歸分析和多因素Cox回歸分析進一步將基因數量縮減至4個，見表2、圖3。與正常組織相比，腫瘤組織中的MS4A1和IL12RB2表達水平升高，DMBT1和LTF表達水平降低。MS4A1高表達組患者的總生存率顯著高于MS4A1低表達組（Plt;0.001），見圖4。使用HPA數據庫免疫組織化學圖像的定量信息，發現HNSCC組織中DMBT1表達水平高于正常組織，見圖5。

2.3""計算及驗證風險評分與預后的相關性

利用以上4個免疫預后相關基因，依據公式計算每個TCGA數據庫HNSCC樣本的風險評分。風險評分=0.043×LTF?0.271×MS4A1–0.105×IL12RB2–0.140×DMBT1。將風險評分與患者的生存時間和生存狀態進行相關性分析，結果顯示死亡組的風險評分顯著高于生存組（Plt;0.05），較高的風險評分可能與較差的生存預后相關，見圖6。單因素Cox回歸分析顯示，風險評分、性別、年齡與HNSCC患者的預后顯著相關（Plt;0.05），見圖7A。多因素Cox回歸分析顯示，風險評分與年齡可作為生存結局的獨立預測因素，見圖7B。結合風險評分、年齡、性別構建列線圖，估計患者的1年、3年和5年生存率，見圖7C。校準曲線顯示預測結果與實際結果非常匹配，見圖7D～F。

2.4""高、低風險組差異基因的富集分析

GO分析結果顯示，富集程度最高的生物學過程包括免疫應答調節細胞表面受體信號通路、B細胞活化、淋巴細胞增殖、單核細胞增殖、體液免疫反應等。KEGG分析富集到唾液分泌、原發性免疫缺陷、B細胞受體信號通路、造血細胞譜系等通路，見圖8。

3""討論

本研究發現：①MS4A1、IL12RB2、DMBT1和LTF是可能影響HNSCC患者預后的免疫相關基因；②MS4A1和IL12RB2在HNSCC中高表達，DMBT1和LTF在HNSCC中低表達；③風險評分可作為HNSCC的獨立預后指標；④高、低風險組差異表達基因分析得到的顯著基因主要富集通路為免疫應答調節細胞表面受體信號通路。

篩選出的MS4A1、IL12RB2、DMBT1和LTF基因可為后續深入理解HNSCC的免疫微環境及其對預后的影響提供重要線索。研究表明MS4A1在B細胞的激活和功能中有重要作用[4]，IL12RB2是白細胞介素-12信號通路的關鍵成分[5]，且MS4A1和IL12RB2已被證明是治療B細胞惡性腫瘤的靶點[6-8]。本研究顯示，MS4A1和IL12RB2在HNSCC中高表達，提示它們在腫瘤微環境中發揮重要作用，可幫助腫瘤細胞逃避免疫監視，并參與細胞間信號傳遞，從而促進腫瘤細胞的增殖和生存，影響腫瘤進展。然而，DMBT1和LTF在HNSCC中的低表達可能揭示免疫抑制的機制，二者在多種腫瘤中均下調，被視為潛在的抑癌基因，進一步支持免疫逃逸的理論[9-12]。因此，進一步研究MS4A1、IL12RB2、DMBT1和LTF在HNSCC中的作用及其機制是必要的，這可為HNSCC的免疫治療，尤其是針對腫瘤免疫微環境的治療策略提供新思路。

本研究基于MS4A1、IL12RB2、DMBT1和LTF的表達，計算樣本的風險評分，為評估患者預后風險提供量化方法。結果表明風險評分越高，預后越差，高風險評分意味著更復雜的免疫微環境，并提示免疫逃逸機制的存在。此外，通過低風險組和高風險組基因的差異分析，揭示不同免疫狀態下的基因表達變化，探索與疾病發展相關的生物學機制。盡管差異分析基于風險分組，但觀察到的基因表達變化仍與免疫相關基因密切相關。富集分析顯示這些差異基因主要參與免疫應答調節細胞表面受體信號通路。大量研究表明細胞表面受體在免疫應答中發揮關鍵作用。如CD28受體的激活可誘導T細胞在表觀遺傳、轉錄和翻譯后水平發生變化，促進T細胞的激活和增殖，而其與B7共刺激分子的相互作用是T細胞活化的必要條件[13]。此外，研究表明細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic"T"lymphocyte-associated"antigen-4，CTLA-4）、程序性死亡受體-1（programmed"death-1，PD-1）可通過不同機制負向調節T細胞的活化[14]。這些免疫調節細胞表面受體不僅對支持免疫系統的正常功能至關重要，在腫瘤免疫微環境中也尤為重要。

在HNSCC中，LAG-3在調節性T細胞上高表達，且與不良的無進展生存期和總生存期相關[15]；同時亦與病理類別升高、腫瘤大小和淋巴結轉移有關[16]。PD-1與其配體相互作用，可抑制T細胞反應，導致腫瘤免疫逃逸。正常生理狀態下，CTLA-4的免疫抑制功能有助于平衡免疫反應，但在腫瘤微環境中，腫瘤細胞釋放轉化生長因子β可增加CTLA-4表達，導致T細胞耗竭，進一步發揮免疫抑制作用。研究表明免疫抑制是HNSCC發生的主要危險因素之一，且與較差的預后相關[17]。因此，免疫調節細胞表面受體被視為免疫療法的潛力靶點。免疫檢查點抑制劑療法就是通過阻斷這些細胞表面受體，解除對T細胞的抑制，從而增強宿主對腫瘤細胞的免疫應答。美國食品藥品監督管理局已批準納武利尤單抗和帕博利珠單抗（PD-1抑制劑）用于治療復發/轉移性HNSCC患者[18]。帕博利珠單抗在晚期HNSCC患者中顯示出高生存率且無治療相關死亡事件[19]。一項隨機Ⅱ期臨床試驗顯示，度伐利尤單抗（PD-1抑制劑）與伊匹木單抗（CTLA-4抑制劑）聯合治療對復發/轉移性HNSCC患者有臨床益處且毒性可控[20]。此外，納武利尤單抗與伊匹木單抗聯合治療復發/轉移性HNSCC患者也顯示出良好的安全性[21]。本研究支持這些研究結果，提示免疫調控細胞表面受體的機制影響HNSCC患者的預后。

本研究主要依賴公共數據庫數據進行分析，可能受到樣本選擇偏倚和數據質量的影響。盡管生物信息學分析方法強大，但無法完全替代實驗驗證。因此，未來研究需在更大樣本量和多中心背景下驗證這些發現的可靠性。雖然本研究提供免疫基因與HNSCC預后關系的初步證據，但基因表達的復雜性和腫瘤微環境的多樣性可能影響預后結果。未來的研究應考慮更全面的生物標志物組合，結合臨床數據驗證這些基因在HNSCC中的功能及其作為潛在治療靶點的可行性。重點應放在三個方面：①探索MS4A1、IL12RB2、DMBT1和LTF在HNSCC中的生物學功能及相互作用機制；②結合實驗驗證這些基因在腫瘤微環境中的作用；③考慮到免疫應答的復雜性，將這些基因與其他免疫檢查點結合使用以評估其在免疫治療中的潛在應用價值。

綜上所述，本研究結果支持免疫調控細胞表面受體在HNSCC免疫應答中的關鍵角色，提供新的生物標志物用于臨床預后評估，并揭示免疫相關基因對HNSCC預后的影響，為HNSCC免疫學領域的進一步研究提供重要理論依據和實踐方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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