大連地區(qū)刺參野生群體和養(yǎng)殖群體腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

摘要：為了解大連地區(qū)刺參野生群體和養(yǎng)殖群體腸道微生物菌群特征，采用16S rRNA高通量測序技術(shù)對野生和養(yǎng)殖條件下刺參腸道微生物的多樣性進行了分析比較。Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，大連金州區(qū)養(yǎng)殖刺參腸道微生物的多樣性和豐富度均高于三山島海域野生刺參。在門水平上，養(yǎng)殖刺參腸道中的主要優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和浮霉菌門（Planctomycetes），其相對豐度分別為54.02%、18.90%、7.45%和6.02%；野生刺參腸道中主要優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門和疣微菌門（Verrucomicrobia），其相對豐度分別為54.69%、28.08%和11.89%。脫硫桿菌門和浮霉菌門在養(yǎng)殖刺參腸道微生物中所占的比例分別為18.90%和6.02%，但在野生刺參腸道中所占的比例均小于0.5%。在屬水平上，養(yǎng)殖刺參腸道中的主要優(yōu)勢菌屬為norank Desulfocapsaceae、norank Caulobacteraceae和羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia），其相對豐度分別為17.26%、8.55%和7.06%；野生刺參腸道中主要優(yōu)勢菌屬為Sedimentitalea、濘桿菌屬（Lutibacter）、Persicirhabdus和亮發(fā)菌屬（Leucothrix），其相對豐度分別為23.52%、18.53%、8.73%和8.37%。Sedimentitalea、濘桿菌屬、Persicirhabdus和亮發(fā)菌屬在野生刺參腸道微生物中所占的比例在8%～24%，但在養(yǎng)殖刺參腸道中所占比例均小于0.5%；norank Desulfocapsaceae、norank Caulobacteraceae和羅爾斯通氏菌屬在養(yǎng)殖刺參腸道中所占的比例在7%～18%，但在野生刺參腸道中所占比例均小于0.1%。結(jié)果表明，不同環(huán)境對刺參腸道微生物組成有較大影響，腸道微生物組成有空間異質(zhì)性。

關(guān)鍵詞：刺參；高通量測序；腸道微生物；多樣性

仿刺參（Apostichopus japonicus）隸屬于棘皮動物門（Echinodermata）、海參綱（Holothuroidea）、盾手目（Aspidochirotida）、刺參科（Stichopodidae）、仿刺參屬（Apostichopus），又名刺參，主要分布于黃、渤海區(qū)，是我國重要的海水養(yǎng)殖種類，具有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益［12］。刺參營底棲生活，以沉積物為食，細菌是刺參腸道內(nèi)容物的重要組成部分，刺參所需70%以上的能量與細菌有關(guān)［34］。刺參腸道菌群與刺參生長及健康狀態(tài)息息相關(guān)，在消化吸收、免疫應(yīng)答和抗病能力等方面均發(fā)揮著重要作用［57］。Bogatyrenko等［8］研究了從刺參腸道中分離出的細菌分解淀粉、海藻酸鈉、幾丁質(zhì)、硫酸軟骨素、吐溫、橄欖油、酪蛋白和明膠的能力，有33%的菌株顯示出不同程度的酶活性，這表明刺參腸道菌群對食物中的有機物具有加工同化作用。王偉等［9］研究發(fā)現(xiàn)，從刺參腸道中的乳酸片球菌屬（Pediococcus）中分離出的菌株HSR13能夠產(chǎn)生多肽類抗菌活性物質(zhì)，這類活性物質(zhì)對多種病原菌具有抑制作用，尤其對李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和大腸桿菌有很強的抑制能力。目前，有關(guān)刺參養(yǎng)殖池塘細菌群落的研究報道已有不少，竇妍等［10］分析了黃海和渤海代表性刺參養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水和沉積物菌群的多樣性，結(jié)果表明，黃海和渤海刺參養(yǎng)殖池塘海水和沉積物中優(yōu)勢類菌群均為變形菌門（Proteobacteria），冬季沉積物細菌多樣性均最高。王姣姣等［11］分析了遼寧省大連市瓦房店刺參養(yǎng)殖池塘海水菌群的結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同時期養(yǎng)殖池塘海水菌群的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，但具體菌種存在差異，其中黃桿菌綱、α變形菌綱和γ變形菌綱在各時期的海水中均有出現(xiàn)，其中黃桿菌綱優(yōu)勢度最高。譚八梅等［12］分析了不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體的菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一優(yōu)勢菌門均為變形菌門，次優(yōu)勢菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes）。春、夏、冬季的特異性菌門分別隸屬于疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）。潘美利等［13］分析了不同沿海地區(qū)冬季養(yǎng)殖池塘仿刺參體表的微生物組成，結(jié)果顯示，地域差異對仿刺參體表微生物組成影響明顯，其中福建省寧德市霞浦縣養(yǎng)殖仿刺參的體表微生物組成與其他４個地區(qū)差異最明顯。彭飛等［14］分析了不同水域水體微生物群落結(jié)構(gòu)組成和特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微生物組成存在空間異質(zhì)性。

腸道是水生動物與外界環(huán)境發(fā)生相互作用的主要器官之一，外界環(huán)境中的微生物會隨著水流進入腸道中，而腸道中的微生物也會隨動物的排泄物進入環(huán)境中，形成一個相互作用的狀態(tài)［15］。腸道微生物群是高度特化的微生物群落，其組成復(fù)雜，主要來自水生動物的生存環(huán)境，受到多種因素的相互影響［16］。劉艷霞等［17］通過研究北方吊籠養(yǎng)殖刺參腸道以及養(yǎng)殖環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)特征及其相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，刺參腸道菌群種類與其養(yǎng)殖水體中菌群的種類呈高度相似性，但相對豐度存在顯著性差異。陸振［18］研究發(fā)現(xiàn)，大連養(yǎng)殖仿刺參腸道的主要優(yōu)勢菌群為濘桿菌屬（Lutibacter），福建莆田養(yǎng)殖仿刺參腸道的主要優(yōu)勢菌群為乳球菌屬（Lactococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）。

基于前期的研究基礎(chǔ)和刺參養(yǎng)殖的需求，本研究采用16S rRNA高通量測序技術(shù)，對野生和養(yǎng)殖條件下刺參腸道的微生物多樣性進行分析比較，揭示兩者腸道微生物組成的差異，以期為刺參養(yǎng)殖生產(chǎn)中腸道微生物制劑的合理利用提供理論依據(jù)，為刺參健康養(yǎng)殖提供參考。1材料和方法

1.1試驗材料

試驗用野生和養(yǎng)殖刺參于2023年11月分別采自遼寧省大連市中山區(qū)三山島海域和遼寧省大連市金州區(qū)刺參養(yǎng)殖池塘（見表1）。所有刺參體色正常，整體勻稱，體表無任何損傷。野生刺參（見圖1a）體質(zhì)量為158.68 g；養(yǎng)殖刺參（見圖1b）體質(zhì)量在60～80 g。

1.2試驗方法

1.2.1樣品采集

將采集的刺參從海域及養(yǎng)殖基地捕獲后立即放入加有養(yǎng)殖海水的無菌密封袋中，采用冰袋低溫運輸，于24 h內(nèi)運至農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室進行稱量，并測量其體長，在無菌條件下于冰上解剖分離腸道，取腸道中段及其內(nèi)容物置于5 mL離心管中，用液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒔馄实玫降哪c道樣本送檢。本試驗養(yǎng)殖刺參共采集3個樣本，野生刺參由于外海捕捉困難，只采集了1個樣本。

1.2.2DNA提取

使用E.Z.N.ATMMagBind Soil DNA Kit對刺參腸道樣本進行DNA抽提。取適量樣本DNA于離心管中，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，用于后續(xù)分析。

1.2.3PCR擴增

分別以野生群體和養(yǎng)殖群體刺參腸道DNA為模版，用16S rRNA V3V4通用引物341F（5’CCTACGGGNGGCWGCAG3’）和805R（5’GACTACHVGGGTATCTAATCC3’）［19］對16S rRNA V3V4的基因進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45" ℃退火20 s，65" ℃延伸30 s，共5個循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共20個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，于10 ℃下保存。取6 μL的PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒回收16S rRNA V3V4區(qū)的片段。

1.2.4文庫構(gòu)建和測序

通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，使用Qubit 3.0熒光定量儀進行文庫濃度測定，所有樣本按照1∶1等量混合。使用Illumina MiSeqTM系統(tǒng)（Illumina，美國）進行測序。

1.2.5數(shù)據(jù)處理和分析

Illumina MiseqTM/HiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別（base calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（sequenced reads），將原始數(shù)據(jù)去除引物接頭序列，再根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接（merge）成1條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。

所有數(shù)據(jù)的分析均在生信平臺（ngs.sangon.com）上進行。使用Usearch 11.0.667對有效數(shù)據(jù)進行OTUs（operational taxonomic units）聚類。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，使用RDP classifier 2.12對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。使用Mothur 1.43.0生成Shannon（香農(nóng)）指數(shù)、Simpson（辛普森）指數(shù)、Chao（豐富度指數(shù)）、Ace（豐富度），以反映微生物群落的豐度和多樣性。基于各樣本分類學(xué)豐度表，利用R語言作圖，得出樣品在門和屬水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。

2結(jié)果

2.1野生群體和養(yǎng)殖群體刺參腸道微生物OTU分析

根據(jù)不同的相似度水平，按照97%相似水平為標(biāo)準劃分所有序列的可操作單元（operational taxonomic units，OTU）。結(jié)果顯示，養(yǎng)殖群體（BL組）和野生群體（CL組）分別獲得2 036個和550個OTU，其中養(yǎng)殖群體（BL組）和野生群體（CL組）共有OTU數(shù)319個，占12.34%。養(yǎng)殖群體（BL組）特有OTU數(shù)1 717個，野生群體（CL組）特有OTU數(shù)231個（見圖2）。

2.2野生群體和養(yǎng)殖群體刺參腸道微生物Alpha多樣性分析

對各組樣本的測序序列數(shù)進行Alpha多樣性分析，得到Alpha多樣性指數(shù)表（見表2）。由表2可知，所有樣品覆蓋率均在99.6%以上，表明各樣品中序列檢測率高，測序結(jié)果符合樣品中微生物的實際情況，能夠反映野生群體和養(yǎng)殖群體的微生物多樣性信息。從Chao和Ace指數(shù)分析得出，養(yǎng)殖群體（BL組）腸道菌群物種豐度高于野生群體（CL組）；養(yǎng)殖群體（BL組）Shannon指數(shù)比野生群體（CL組）高，Simpson指數(shù)比野生群體（CL組）低，表明養(yǎng)殖群體（BL組）腸道菌群多樣性高于野生群體（CL組）。綜合得出，大連金州區(qū)養(yǎng)殖刺參的腸道微生物多樣性和豐富度均高于三山島海域野生刺參。

2.3野生和養(yǎng)殖刺參腸道微生物群落組成分析

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，獲得野生群體和養(yǎng)殖群體樣本腸道微生物在各分類水平上的組成情況，選取相對豐度前10的群落進行分析。在門水平上（見圖4），變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）為2組刺參腸道的共同優(yōu)勢菌門。大連金州區(qū)養(yǎng)殖刺參腸道中主要優(yōu)勢菌門為變形菌門、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、擬桿菌門和浮霉菌門（Planctomycetes），其相對豐度分別為54.02%、18.90%、7.45%和6.02%；三山島海域野生刺參腸道中主要優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門和疣微菌門，其相對豐度分別為54.69%、28.08%和11.89%。進一步比較野生和養(yǎng)殖刺參腸道微生物在門水平上的差異發(fā)現(xiàn)，脫硫桿菌門和浮霉菌門在養(yǎng)殖刺參腸道中所占的比例分別為18.90%和6.02%，但在野生刺參腸道中所占的比例均小于0.5%。

門水平的相對豐度在綱水平上（見圖5），α變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）和擬桿菌綱（Bacteroidia）為2組刺參腸道的共同優(yōu)勢菌綱。大連金州區(qū)養(yǎng)殖刺參腸道菌群在綱水平的優(yōu)勢菌為α變形菌綱、γ變形菌綱和脫硫球狀菌綱（Desulfobulbia），其相對豐度分別為29.75%、24.27%和17.86%；三山島海域野生刺參腸道菌群在綱水平的優(yōu)勢菌為α變形菌綱、擬桿菌綱、疣微菌綱（Verrucomicrobiae）和γ變形菌綱，其相對豐度分別為44.17%、28.08%、11.90%和11.51%。

在目水平上（見圖6），紅桿菌目（Rhodobacterales）和黃桿菌目（Flavobacteriales）為野生群體和養(yǎng)殖群體刺參腸道的共同優(yōu)勢菌目。大連金州區(qū)養(yǎng)殖刺參腸道菌群在目水平的優(yōu)勢菌為Desulfobulbales、紅桿菌目和柄桿菌目（Caulobacterales），其相對豐度分別為17.86%、17.51%和8.56%；三山島海域野生刺參腸道菌群在目水平的優(yōu)勢菌為紅桿菌目、黃桿菌目、疣微菌目（Verrucomicrobiales）和硫發(fā)菌目（Thiotrichales），其相對豐度分別為42.87%、27.98%、11.75%和9.67%。

在科水平上（見圖7），紅桿菌科（Rhodobacteraceae）和黃桿菌科（Flavobacteriaceae）為2組刺參腸道的共同優(yōu)勢菌科。大連金州區(qū)養(yǎng)殖刺參腸道菌群在科水平的優(yōu)勢菌為Desulfocapsaceae、紅桿菌科和柄桿菌科（Caulobacteraceae），其相對豐度分別為17.64%、17.51%和8.55%；三山島海域野生刺參腸道菌群在科水平的優(yōu)勢菌為紅桿菌科、黃桿菌科、Rubritaleaceae和硫發(fā)菌科（Thiotrichaceae），其相對豐度分別為42.8%、27.97%、11.65%和9.67%。

在屬水平上（見圖8），2組刺參腸道微生物組成差異較大，沒有共同優(yōu)勢菌屬。大連金州區(qū)養(yǎng)殖刺參腸道中主要優(yōu)勢菌屬為norank" Desulfocapsaceae、norank" Caulobacteraceae和羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia），其相對豐度分別為17.26%、8.55%和7.06%；三山島海域野生刺參腸道中主要優(yōu)勢菌屬為Sedimentitalea、濘桿菌屬（Lutibacter）、Persicirhabdus和亮發(fā)菌屬（Leucothrix），其相對豐度分別為23.52%、18.53%、8.73%和8.37%。進一步比較野生群體和養(yǎng)殖群體刺參腸道微生物在屬水平上的差異發(fā)現(xiàn)，Sedimentitalea、濘桿菌屬、Persicirhabdus和亮發(fā)菌屬在野生刺參腸道中所占的比例在8%～24%，而在養(yǎng)殖刺參腸道中所占的比例均小于0.5%；norank" Desulfocapsaceae、norank" Caulobacteraceae和羅爾斯通氏菌屬在養(yǎng)殖刺參腸道中所占的比例在7%～18%，但在野生刺參腸道中所占比例均小于0.1%。

3討論

3.1野生和養(yǎng)殖刺參腸道微生物豐富度和多樣性分析

腸道微生物是刺參腸道內(nèi)容物的重要組成部分，與刺參機體之間形成一個相互依賴、協(xié)作共進的整體，影響刺參的生長發(fā)育進程［20］。本研究基于16S rRNA高通量測序分析，比較了野生刺參和養(yǎng)殖刺參的腸道菌群結(jié)構(gòu)。Alpha多樣性指數(shù)分析得出，大連金州區(qū)養(yǎng)殖刺參腸道微生物多樣性和豐度均高于三山島海域野生刺參。阮超嶺等［21］在比較了野生和養(yǎng)殖蘭州鲇（Silurus lanzhouensis）的腸道菌群結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖群體腸道微生物的多樣性指數(shù)高于野生群體；錢逸等［22］發(fā)現(xiàn)，野生和養(yǎng)殖丁魚歲（Tinca tinca） 的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異；張鈺霆等［23］對三沙灣大黃魚（Larimichthys crocea）野生和養(yǎng)殖群體的微生物群落結(jié)構(gòu)進行了研究，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖群體的Alpha多樣性顯著高于野生群體。因此，從多樣性指標(biāo)來看，大連地區(qū)養(yǎng)殖刺參腸道微生物處于健康的狀態(tài)。也有學(xué)者對野生和養(yǎng)殖群體腸道菌群多樣性的研究存在不同的結(jié)果。如王金林等［24］對野生和養(yǎng)殖異齒裂腹魚（Schizothorax o′connori）腸道菌群結(jié)構(gòu)進行分析后發(fā)現(xiàn)，野生和人工養(yǎng)殖條件下的異齒裂腹魚，其腸道菌群多樣性不存在顯著差異。茍妮娜等［25］研究表明，相對于養(yǎng)殖多鱗白甲魚（Onychostoma macrolepis），野生多鱗白甲魚腸道微生物群落豐度較大。這些結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，推測可能是由于物種以及棲息環(huán)境不同造成的。刺參營底棲生活，攝食無選擇性，多以沉積物為食，養(yǎng)殖模式下的刺參被投喂了人工餌料，其養(yǎng)殖區(qū)域的底泥中有豐富的有機物質(zhì)和細菌，而刺參腸道的菌群結(jié)構(gòu)與底泥較為相近，因此其多樣性指數(shù)要高于野生群體［2627］。野生刺參生活在流動的海水環(huán)境中，且在水溫較低的季節(jié)，可供攝食的餌料種類相對較少，這可能是養(yǎng)殖刺參腸道菌群的多樣性和豐度高于野生刺參的原因之一。

3.2野生和養(yǎng)殖刺參腸道微生物群落門水平組成分析

宿主的腸道菌群結(jié)構(gòu)與其生活環(huán)境、食性差異、營養(yǎng)狀態(tài)等密切相關(guān)［2830］。本試驗中，野生刺參和養(yǎng)殖刺參因生活環(huán)境不同，其腸道微生物組成出現(xiàn)了明顯差異。野生和養(yǎng)殖刺參腸道中均為變形菌門占比最高，其相對豐度分別為54.69%和54.02%。潘美利等［13］在沿海5個地區(qū)刺參體表微生物及冬季的微生物組成分析中也發(fā)現(xiàn)，變形菌門是第一優(yōu)勢菌。繆棟［31］對海參養(yǎng)殖池微生物多樣性及其動態(tài)的研究結(jié)果表明，變形菌門也是海參養(yǎng)殖池塘水體中的主要類群。李昌明［32］也發(fā)現(xiàn)，海參腸道中的優(yōu)勢類群是變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，共占腸道菌群的90%左右。眾多研究表明，變形菌門為刺參腸道的第一優(yōu)勢菌門，這與本研究的結(jié)果相一致。變形菌門在原核生物分子生物學(xué)分類中占據(jù)絕對優(yōu)勢，具有較強的適應(yīng)性和豐富的代謝多樣性，在生物化學(xué)物質(zhì)循環(huán)過程中起重要作用［3335］。除此之外，2組刺參其余的共同優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和疣微菌門。研究表明，擬桿菌門也是腸道中重要的優(yōu)勢菌［32］。微生物群落在底棲碳循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)有機物到達沉積物表面時，它們往往是有機物的主要降解者。擬桿菌對于初始有機物的降解非常重要，該菌通常會分解復(fù)雜的聚合物，可以快速調(diào)整碳水化合物的代謝以適應(yīng)可用的營養(yǎng)物質(zhì)［3639］。疣微菌門細菌參與多種物質(zhì)循環(huán)，主要存在于腸道黏膜內(nèi)層，在健康個體中大量存在，可以分解多糖類物質(zhì)，如黏多糖和纖維素等，從而為動物提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)；還可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對腸道健康和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)具有重要作用，影響著元素循環(huán)的動態(tài)平衡，具有十分重要的生態(tài)價值［40］。本研究中，野生群體和養(yǎng)殖群體刺參腸道中主要的優(yōu)勢菌為變形菌門、擬桿菌門和疣微菌門，說明刺參的健康狀態(tài)良好，這一結(jié)果可為刺參健康養(yǎng)殖模式的研究和推廣提供參考。

進一步比較野生和養(yǎng)殖刺參腸道微生物在門水平上的差異發(fā)現(xiàn)，脫硫桿菌門和浮霉菌門在養(yǎng)殖刺參腸道中所占的比例分別為18.90%和6.02%，但在野生刺參腸道中所占的比例均小于0.5%。脫硫桿菌門主要存在于缺氧的有機污染環(huán)境中并參與硫循環(huán)和碳循環(huán)［41］，這說明刺參養(yǎng)殖池塘處于缺氧狀態(tài)并存在豐富的有機物，原因可能是養(yǎng)殖過程中池底沉積了過量的飼料，導(dǎo)致有機物增加，而還原性有機物在氧化過程中需要消耗大量氧氣，大大增加了底棲環(huán)境的耗氧量。在這樣的環(huán)境條件下，脫硫桿菌門占有一定的比例有助于水體中的碳循環(huán)和硫循環(huán)，對刺參養(yǎng)殖有一定的維護作用。解維俊等［42］的研究也表明，隨著養(yǎng)殖年限的增加，長年養(yǎng)殖的網(wǎng)箱沉積物中脫硫桿菌門的豐度顯著提高。浮霉菌門可參與復(fù)雜化合物代謝，在魚體腸道中亦被發(fā)現(xiàn)具有多糖降解能力［43］，它是一類條件致病菌，由浮霉菌導(dǎo)致的上皮囊腫病是魚類的常見疾病［44］。因此推測，養(yǎng)殖刺參腸道中浮霉菌門豐度占比較高，可能與養(yǎng)殖過程中一些疾病的發(fā)生有關(guān)，這為池塘養(yǎng)殖水質(zhì)環(huán)境檢測及健康養(yǎng)殖提供了重要依據(jù)。

3.3野生和養(yǎng)殖刺參腸道微生物群落屬水平組成差異

在屬水平上，野生和養(yǎng)殖刺參腸道微生物組成差異較大，沒有共同優(yōu)勢菌屬。Sedimentitalea、濘桿菌屬、Persicirhabdus和亮發(fā)菌屬在野生刺參腸道中所占的比例較大，但在養(yǎng)殖刺參腸道中所占的比例均小于0.5%。Sedimentitalea隸屬于變形菌門的紅桿菌科，最初是從沙質(zhì)沉積物中分離出來的［4546］，后又在太平洋褶魷魚（Todarodes pacificus）腸道中分離出1個該屬的物種［47］。這些細菌在海洋沉積物中常見，具有對特定底棲有機質(zhì)的降解能力，因此在海洋生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色。濘桿菌屬隸屬于擬桿菌門的黃桿菌科，是常見的與多糖代謝相關(guān)的菌株［20］。Lutibacter aestuarii已被證實可以降解高分子多糖，并具有β半乳糖苷酶活性［18］。同時，濘桿菌屬作為一種兼性厭氧菌［48］，可以利用硝酸鹽作為電子受體進行無氧呼吸［49］，該菌可能是氮循環(huán)的關(guān)鍵一環(huán)，可降低海洋中的NO3-，消除因硝酸鹽積累對海參及其他生物的毒害作用。疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）中的Persicirhabdus已經(jīng)從包括海水、沉積物和海洋動物在內(nèi)的多種海洋環(huán)境中分離到，該屬的細菌廣泛存在于海洋環(huán)境中［5052］。已經(jīng)有研究證明，該屬的細菌對海洋中碳的生物地球化學(xué)循環(huán)十分重要，并且這些細菌有可能影響宿主的健康和生活狀態(tài)［51］。亮發(fā)菌屬隸屬于變形菌門中的硫菌科，具有好氧耐鹽且能降解有機物的特性［53］。該屬的細菌會對底棲甲殼類動物和魚卵造成侵擾，尤其是在蝦類的人工養(yǎng)殖中［54］，推測其有可能對刺參也造成了一定的侵擾。

norank Desulfocapsaceae、norank Caulobacteraceae、羅爾斯通氏菌屬和科爾韋爾氏菌屬（Colwellia）在養(yǎng)殖刺參腸道中所占的比例較大，但在野生刺參腸道中所占比例均小于0.1%。養(yǎng)殖群體中有些未歸類的微生物，其中norank Desulfocapsaceae來自脫硫桿菌門的Desulfocapsaceae，有研究表明，Desulfocapsaceae可以使用無機硫化合物作為電子供體和受體，在硫和碳循環(huán)中發(fā)揮著重要作用［55］。該菌可能是一種硫酸鹽還原菌，參與了硫循環(huán)中的關(guān)鍵過程。norank Caulobacteraceae來自于變形菌門的柄桿菌科，柄桿菌科是好氧細菌，在水體中大量分布，并且可以適應(yīng)高濃度的鹽環(huán)境［56］，這說明刺參養(yǎng)殖池塘的鹽度較高。這些細菌在刺參養(yǎng)殖及生長中扮演著重要角色，通過對有機物的降解能力來參與刺參的養(yǎng)殖過程。諾氟沙星（norfloxacin，NOR）在前些年被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)生物的疾病預(yù)防和治療，直到2015年被我國原農(nóng)業(yè)部列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥品［5758］。近年來，NOR在水環(huán)境中被廣泛檢出。有研究發(fā)現(xiàn)，NOR可能會引起水產(chǎn)生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致過量的活性氧自由基產(chǎn)生，而羅爾斯通氏菌具有多種酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和催化酶等，這些酶能夠降解和清除細胞內(nèi)的活性氧自由基，從而降低水產(chǎn)生物氧化應(yīng)激反應(yīng)的損傷［5961］。夏興龍等［62］的研究表明，隨著環(huán)境中NOR暴露濃度的增加，刺參腸道菌群逐漸被羅爾斯通氏菌所取代。羅爾斯通氏菌在養(yǎng)殖刺參腸道中相對豐度更高，這可能與養(yǎng)殖過程中抗生素等藥物的使用有關(guān)。

4結(jié)論

在野生和池塘養(yǎng)殖2種環(huán)境條件下，刺參腸道微生物的豐富度和多樣性呈現(xiàn)明顯差異，池塘養(yǎng)殖環(huán)境下刺參腸道菌群的多樣性和豐富度較高，體現(xiàn)了不同環(huán)境的異質(zhì)性和多樣性。在門水平上的群落組成，野生刺參腸道中的優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門，養(yǎng)殖刺參腸道中優(yōu)勢菌門為變形菌門、脫硫桿菌門、擬桿菌門和浮霉菌門；在科水平上的群落組成，野生刺參腸道中優(yōu)勢菌科為紅桿菌科、黃桿菌科、Rubritaleaceae和硫菌科，養(yǎng)殖刺參腸道中優(yōu)勢菌科為Desulfocapsaceae、紅桿菌科、柄桿菌科；在屬水平上的群落組成，野生刺參腸道中優(yōu)勢菌屬為Sedimentitalea、濘桿菌屬、Persicirhabdus和亮發(fā)菌屬，養(yǎng)殖刺參腸道中優(yōu)勢菌屬為norank Desulfocapsaceae、norank Caulobacteraceae和羅爾斯通氏菌屬。野生和養(yǎng)殖刺參腸道微生物存在較大差異，表明不同環(huán)境對刺參腸道微生物的組成有較大影響，微生物組成存在空間異質(zhì)性。該研究結(jié)果可為刺參養(yǎng)殖生產(chǎn)中腸道微生物制劑的合理利用提供理論依據(jù)，為刺參健康養(yǎng)殖提供參考，以進一步優(yōu)化刺參池塘養(yǎng)殖模式，提高產(chǎn)量。

參考文獻

［1］張春云，王印庚，榮小軍，等.國內(nèi)外海參自然資源、養(yǎng)殖狀況及存在問題［J］.海洋水產(chǎn)研究，2004，25（3）：8997.

［2］王軼南，穆曉虎，封妮莎，等.仿刺參體腔液中酚氧化酶活性的分析［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2013，28（4）：319322.

［3］中國科學(xué)院中國動物志編輯委員會.中國動物志.棘皮動物門.海參綱［M］.北京：科學(xué)出版社，1997.

［4］ZHOU M，HERNANDEZSANABRIA E，GUAN L L.Assessment of the microbial ecology of ruminal methanogens in cattle with different feed efficiencies［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75（20）：65246533.

［5］ZHANG M L，SHAN C J，TAN F，et al.Gnotobiotic models：Powerful tools for deeply understanding intestinal microbiotahost interactions in aquaculture［J］.Aquaculture，2020，517：734800.

［6］ZHANG H X，WANG Q，ZHAO J M，et al.Quantitative microbiome profiling links microbial community variation to the intestine regeneration rate of the sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Genomics，2020，112（6）：50125020.

［7］PEDRON R，ESPOSITO A，BIANCONI I，et al.Genomic and metagenomic insights into the microbial community of a thermal spring［J］.Microbiome，2019，7（1）：8.

［8］BOGATYRENKO E A，BUZOLEVA L S.Characterization of the gut bacterial community of the Japanese Sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Mikrobiologiia，2016，85（1）：9299.

［9］王偉，叢麗娜，黃君，等.海參腸道中乳酸菌的分離鑒定及活性物質(zhì)研究［J］.工業(yè)微生物，2018，48（4）：2429.

［10］竇妍，丁君，曲凌云，等.秋、冬季刺參養(yǎng)殖池塘菌群的多樣性分析［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2015，30（2）：143148.

［11］王姣姣，李丹，宋堅，等.不同時期刺參養(yǎng)殖池塘海水菌群結(jié)構(gòu)分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2015，17（2）：134140.

［12］譚八梅，王犖，裴泓霖，等.不同季節(jié)刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結(jié)構(gòu)與功能特征研究［J］.漁業(yè)科學(xué)進展，2021，42（3）：7788.

［13］潘美利，黨慧鳳，黃宇希，等.我國沿海5個地區(qū)冬季養(yǎng)殖仿刺參體表微生物多樣性比較分析［J］.水產(chǎn)科技情報，2024，51（3）：159168.

［14］彭飛，周彥鋒，王晨赫，等.2019年春季淮河中下游水體微生物的空間異質(zhì)性［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報，2022，37（5）：830840.

［15］鄧智明.野生與養(yǎng)殖圓口銅魚腸道微生物研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

［16］童心語.利用16S擴增子測序探究殺魚愛德華氏菌減毒活疫苗株對大菱鲆腸道微生物的影響［D］.上海：華東理工大學(xué)，2023.

［17］劉艷霞，張靖婧，周葉青，等.北方吊籠養(yǎng)殖刺參腸道及其養(yǎng)殖環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)特征及其相關(guān)性分析［J］.漁業(yè)科學(xué)進展，2023，44（6）：190202.

［18］陸振.福建與山東、遼寧養(yǎng)殖仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異分析［J］.漁業(yè)研究，2019，41（3）：187194.

［19］WALTERS W，HYDE E R，BERGLYONS D，et al.Improved bacterial 16S rRNA gene （V4 and V45） and fungal internal transcribed spacer marker gene primers for microbial community surveys［J］.mSystems，2015，1（1）：e00009e00015.

［20］張靖婧.腸道菌群對刺參生長差異影響機制初探［D］.大連：大連海洋大學(xué)，2023.

［21］阮超嶺，賴章龍，肖偉，等.野生和養(yǎng)殖蘭州鲇腸道菌群結(jié)構(gòu)的比較［J］.水生生物學(xué)報，2023，47（11）：17341744.

［22］錢逸，許沁宇，錢龍，等.野生和養(yǎng)殖丁魚歲腸道微生物菌群的比較分析［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2023，42（1）：128135.

［23］張鈺霆，張瑞瑞，潘非斐，等.三沙灣大黃魚野生和養(yǎng)殖群體的幽門盲囊微生物群落結(jié)構(gòu)比較分析［J］.海洋學(xué)報，2024，46（1）：7787.

［24］王金林，王且魯，王萬良，等.野生和養(yǎng)殖的異齒裂腹魚腸道菌群結(jié)構(gòu)分析［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2020，39（4）：585590.

［25］茍妮娜，鐘明智，王開鋒.基于16S rRNA高通量測序的野生和養(yǎng)殖多鱗白甲魚腸道微生物群落組成研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2021，30（7）：963970.

［26］于東祥，孫慧玲，陳四清，等.海參健康養(yǎng)殖技術(shù)［M］.2版.北京：海洋出版社，2010.

［27］王軼南，朱世偉，常亞青.刺參腸道及養(yǎng)殖池塘菌群組成的PCRDGGE指紋圖譜分析［J］.漁業(yè)科學(xué)進展，2010，31（3）：119122.

［28］李可俊，管衛(wèi)兵，徐晉麟，等.PCRDGGE對長江河口八種野生魚類腸道菌群多樣性的比較研究［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2007，19（3）：268269.

［29］XIA J H，LIN G，F(xiàn)U G H，et al.The intestinal microbiome of fish under starvation［J］.BMC Genomics，2014，15：266.

［30］王瑞旋，王江勇，徐力文，等.軍曹魚腸道及水體異養(yǎng)菌和弧菌的周年變化［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（6）：10081015.

［31］繆棟.海參養(yǎng)殖池微生物多樣性及其動態(tài)研究［D］.揚州：揚州大學(xué)，2017.

［32］李昌明.海參腸道微生物多樣性分析及菌株s12T褐藻膠裂解酶研究［D］.濟南：山東大學(xué)，2019.

［33］白潔，李海艷，趙陽國.黃海北部不同站位海洋細菌群落分布特征［J］.微生物學(xué)報，2009，49（3）：343350.

［34］GUPTA R S.The phylogeny of proteobacteria：relationships to other eubacterial Phyla and eukaryotes［J］.FEMS Microbiology Reviews，2000，24（4）：367402.

［35］李思亮，劉叢強，肖化云.地表環(huán)境氮循環(huán)過程中微生物作用及同位素分餾研究綜述［J］.地質(zhì)地球化學(xué)，2002，30（4）：4045.

［36］TEELING H，F(xiàn)UCHS B M，BECHER D，et al.Substratecontrolled succession of marine bacterioplankton populations induced by a phytoplankton bloom［J］.Science，2012，336（6081）：608611.

［37］MCKEW B A，DUMBRELL A J，TAYLOR J D，et al.Differences between aerobic and anaerobic degradation of microphytobenthic biofilmderived organic matter within intertidal sediments［J］.FEMS Microbiology Ecology，2013，84（3）：495509.

［38］TAYLOR J D，MCKEW B A，KUHL A，et al.Microphytobenthic extracellular polymeric substances （EPS） in intertidal sediments fuel both generalist and specialist EPSdegrading bacteria［J］.Limnology and Oceanography，2013，58（4）：14631480.

［39］黃志濤，宋協(xié)法，李勛，等.基于高通量測序的石斑魚循環(huán)水養(yǎng)殖生物濾池微生物群落分析［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2016，32（S1）：242247.

［40］馮希.海洋疣微菌的分離、鑒定及疣微菌門分類體系整理［D］.濟南：山東大學(xué)，2021.

［41］NEALSON K H.Sediment bacteria：who’s there，what are they doing，and what’s new［J］.Annual Review of Earth and Planetary Sciences，1997，25：403434.

［42］解維俊，趙玉庭，劉元進，等.大欽島不同養(yǎng)殖年限深水網(wǎng)箱沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)分析［J］.海洋科學(xué)，2022，46（12）：3140.

［43］LI X M，ZHU Y J，YAN Q Y，et al.Do the intestinal microbiotas differ between paddlefish （Polyodon spathala） and bighead carp （Aristichthys nobilis） reared in the same pond［J］.Journal of Applied Microbiology，2014，117（5）：12451252.

［44］李昭宏，謝秀琴，原珂，等.中國邊緣海沉積物中抗生素抗性基因和致病菌的組成特征［J］.環(huán)境化學(xué)，2023，42（3）：805812.

［45］BREIDER S，SCHEUNER C，SCHUMANN P，et al.Genomescale data suggest reclassifications in the LeisingeraPhaeobacter cluster including proposals for Sedimentitalea gen.nov.and Pseudophaeobacter gen.nov［J］.Frontiers in Microbiology，2014，5：416.

［46］SUN F Q，WANG B J，LIU X P，et al.Leisingera nanhaiensis sp.nov.，isolated from marine sediment［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2010，60（2）：275280.

［47］KIM H S，HYUN D W，LEE J Y，et al.Sedimentitalea todarodis sp.nov.，isolated from the intestinal tract of a Japanese flying squid［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2016，66（9）：32933298.

［48］BOHRQUEZ J，MCGENITY T J，PAPASPYROU S，et al.Different types of diatomderived extracellular polymeric substances drive changes in heterotrophic bacterial communities from intertidal sediments［J］.Frontiers in Microbiology，2017，8：245.

［49］LEE S Y，LEE M H，OH T K，et al.Lutibacter aestuarii sp.nov.，isolated from a tidal flat sediment，and emended description of the genus Lutibacter Choi and Cho 2006［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62（Pt 2）：420424.

［50］YOON J，MATSUO Y，MATSUDA S，et al.Rubritalea spongiae sp.nov.and Rubritalea tangerina sp.nov.，two carotenoidand squaleneproducing marine bacteria of the family Verrucomicrobiaceae within the Phylum‘Verrucomicrobia’，isolated from marine animals［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57（Pt 10）：23372343.

［51］YOON J，MATSUO Y，ADACHI K，et al.Description of Persicirhabdus sediminis gen.nov.，sp.nov.，Roseibacillus ishigakijimensis gen.nov.，sp.nov.，Roseibacillus ponti sp.nov.，Roseibacillus persicicus sp.nov.，Luteolibacter pohnpeiensis gen.nov.，sp.nov.and Luteolibacter algae sp.nov.，six marine members of the Phylum‘Verrucomicrobia’，and emended descriptions of the class Verrucomicrobiae，the order Verrucomicrobiales and the family Verrucomicrobiaceae［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2008，58（Pt 4）：9981007.

［52］YOON J，YASUMOTOHIROSE M，MATSUO Y，et al.Pelagicoccus mobilis gen.nov.，sp.nov.，Pelagicoccus albus sp.nov.and Pelagicoccus litoralis sp.nov.，three novel members of subdivision 4 within the Phylum‘Verrucomicrobia’，isolated from seawater by in situ cultivation［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57（Pt 7）：13771385.

［53］ZHANG Z H，GAO X，WANG L，et al.Leucothrix pacifica sp.nov.，isolated from seawater，and emended description of the genus Leucothrix［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2015，65（8）：23972402.

［54］JOHNSON P W，SIEBURTH J M，SASTRY A，et al.Leucothrix mucor infestation of benthic Crustacea，fish eggs，and tropical algae1［J］.Limnology and Oceanography，1971，16（6）：962969.

［55］BELL E，LAMMINMKI T，ALNEBERG J，et al.Active anaerobic methane oxidation and sulfur disproportionation in the deep terrestrial subsurface［J］.The ISME Journal，2022，16（6）：15831593.

［56］WHITE D C，SUTTON S D，RINGELBERG D B.The genus Sphingomonas：physiology and ecology［J］.Current Opinion in Biotechnology，1996，7（3）：301306.

［57］VERNERJEFFREYS D W，SHIELDS R J，BRICKNELL I R，et al.Effects of different water treatment methods and antibiotic addition on larval survival and gut microflora development in Atlantic halibut （Hippoglossus hippoglossus L.） yolksac larvae［J］.Aquaculture，2004，232（1/2/3/4）：129143.

［58］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2292號.（20150901）［20150901］.https：//www.nahs.org.cn/gk/tz/202104/t20210407_375196.htm.

［59］WU Z B，ZHANG Q Q，LIN Y Y，et al.Taxonomic and functional characteristics of the gill and gastrointestinal microbiota and its correlation with intestinal metabolites in NEW GIFT strain of farmed adult Nile Tilapia （Oreochromis niloticus）［J］.Microorganisms，2021，9（3）：617.

［60］BARTOSKOVA M，DOBSIKOVA R，STANCOVA V，et al.Norfloxacin—toxicity for Zebrafish （Danio rerio） focused on oxidative stress parameters［J］.BioMed Research International，2014，2014：560235.

［61］ZIVNA D，PLHALOVA L，PRASKOVA E，et al.Oxidative stress parameters in fish after subchronic exposure to acetylsalicylic acid［J］.Neuro Endocrinology Letters，2013，34（Suppl 2）：116122.

［62］夏興龍，王犖，周葉青，等.諾氟沙星對刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能特征的影響［J］.生態(tài)毒理學(xué)報，2024，19（2）：1226.