9種非特異性免疫因子在2個年齡組大鯢中的組織分布及活性比較

摘要：為探究大鯢非特異性免疫因子的組織分布和活性變化，利用化學比色法和酶聯免疫吸附法對2個年齡組（1齡和2齡）大鯢肝臟、腸道和脾臟中的一氧化氮（NO）、總一氧化氮合酶（TNOS）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、溶菌酶（LYZ）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、補體C3（C3）、補體C4（C4）和轉鐵蛋白（Tf）等9種非特異性免疫因子進行了測定。結果顯示：9種非特異性免疫因子在2個年齡組大鯢的3個組織中均有分布，但其活性在不同年齡組和不同組織中存在一定的差異。1齡大鯢脾臟中LYZ、ACP、AKP和Tf的活性高于肝臟和腸道，肝臟中NO、C3和C4的活性高于脾臟和腸道，腸道中TNOS和iNOS的活性高于脾臟和肝臟；2齡大鯢肝臟中NO、TNOS、iNOS、C3和C4的活性高于脾臟和腸道，腸道中LYZ和AKP的活性高于脾臟和肝臟，脾臟中ACP和Tf的活性高于肝臟和腸道。結果表明，9種非特異性免疫因子在1齡大鯢中主要分布于脾臟和肝臟，而2齡大鯢主要分布于肝臟。

關鍵詞：大鯢；非特異性免疫因子；免疫組織；組織分布；活性變化

大鯢（Chinese giant salamander，Andrias davidianus）是我國珍稀水生兩棲類中的旗艦物種，已被列入國家2級保護動物名錄和CITES公約附錄Ⅰ［1］。除了具有食用和藥用價值外，大鯢在動物進化、物種多樣性保護和動物性別決定分子機制研究等方面也具有重要的科學價值［2］。隨著人工繁育和養殖技術的不斷完善，大鯢養殖業已成為調整山區農業產業結構和增加農民收入的新興產業［3］。近年來，養殖的過速發展及規模化養殖模式下的不規范運作導致大鯢病害頻發，給大鯢養殖業帶來了巨大的經濟損失［4］。

水生動物在長期演化過程中已適應含有多種病原微生物的自然水體環境并進化出強大的免疫防御系統來抵御病原菌入侵［5］。先前的研究發現，兩棲類動物的免疫防御系統包括特異性免疫和非特異性免疫，而其非特異性免疫是由表皮黏液屏障、吞噬細胞的吞噬作用及體內多種非特異性免疫因子共同組成的［6］。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種具有生物信使作用和免疫調節功能的非特異性免疫因子，其在水生動物的免疫防御反應中起重要作用［7］。Villamil等［8］證實，投喂乳酸菌會使大菱鲆（Scophthalmus maximus）血清中NO的濃度顯著提高；梁簫等［9］發現，燦爛弧菌刺激能引起厚殼貽貝（Mytilus coruscus）消化腺中NO的含量升高。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）作為NO生物合成的調節因子，是由構成型一氧化氮合酶（constitutive NOS，cNOS）和誘導型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）組成的，其中iNOS在受到刺激后會產生大量的NO并參與免疫應答反應［10］。先前的研究也證實，病原菌和飼料添加劑都能誘導水生動物體內NOS活性增強［9，11］。溶菌酶（lysozyme，LYZ）是水生動物體內重要的非特異性免疫因子，可作為衡量水生動物機體免疫和養殖水體環境污染程度的重要指標［1213］。王凡等［14］發現，投喂復方中草藥可誘導虹鱒（Oncorhynchus mykiss）血清溶菌酶活性升高，并使魚體免疫力增強。王瑞等［15］報道，重金屬Pb2+的污染會導致青蛤（Cyclina sinensis）血淋巴溶菌酶的活性顯著降低，并使其免疫力降低。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）是磷代謝過程中的一類重要酶，在水生動物對營養物質的消化、吸收、轉運和體內解毒中起重要作用，也是衡量生物體免疫功能和機體狀態的重要指標［16］。Broeg等［17］認為，ACP可成為衡量歐洲川鰈（Platichthys flesus）和隆頭魚（Symphodus melops）肝臟吞噬細胞活性高低的重要指標。田立立等［18］發現，高pH急性脅迫下，克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）血漿中ACP和AKP的活性明顯升高，但其非特異性免疫功能在短時間內會受到一定的影響。作為水生動物免疫系統的非特異性免疫因子，補體由一系列具有酶活性的蛋白和膜受體蛋白構成，對抵御病原菌和維持水生動物內環境穩定具有重要作用［19］。補體C3和C4作為補體關鍵分子在水生動物非特異性免疫防御反應中具有重要功能［20］。孫翰昌等［21］發現，嗜水氣單胞菌滅活疫苗能夠提高大鯢血清中補體C3的活性并增強大鯢非特異性免疫反應。王凡等［14］證實，投喂復方中草藥對提高虹鱒血清中C3和C4的活性，增強魚體的抗病能力也有顯著效果。轉鐵蛋白（transferrin，Tf）是一種重要的β球蛋白，主要參與調節機體內鐵代謝平衡、抗菌抑菌和免疫調控作用［2224］。高明英等［2526］報道，轉鐵蛋白具有抑菌作用并能夠參與黃喉擬水龜（Mauremys mutica）的免疫應答反應。

近年來，隨著人工養殖大鯢病害的日趨嚴重，有關大鯢免疫防御機制的研究備受關注。本研究通過對2個年齡組大鯢肝臟、腸道和脾臟中非特異性免疫因子NO、TNOS（總一氧化氮合酶，即cNOS和iNOS含量的總和）、iNOS、LYZ、ACP、AKP、C3、C4和Tf的組織分布及活性比較，分析這9種重要的非特異性免疫因子在大鯢不同年齡和不同組織中的分布和活性變化規律，以期為大鯢養殖過程中的病害防控提供理論依據。

1材料和方法

1.1試驗材料

試驗用大鯢來自河南省欒川輝煌大鯢養繁有限公司，分別為1齡（體質量50 g，體長15 cm）和2齡（體質量1 000 g，體長45 cm）大鯢各3尾。正式試驗前暫養1周，暫養期間不投飼，水溫保持在20 ℃左右。

1.2樣品收集

將健康的活體大鯢用漁用麻醉劑MS222麻醉處死后置于冰盤上解剖，分別剪取1齡和2齡大鯢的部分肝臟、腸道和脾臟組織樣本，于-80 ℃冰箱中冷凍保存待用。

1.3非特異性免疫因子的測定

NO、TNOS、iNOS、LYZ、ACP和AKP采用南京建成生物有限公司的生化試劑盒進行測定；C3、C4和Tf采用上海鈺博生物科技有限公司的Elisa試劑盒進行測定。

1.3.1組織蛋白濃度測定

準確稱取超低溫凍存的1齡和2齡大鯢的肝臟、腸道和脾臟組織的質量，按照質量（g）∶體積（mL）為1∶9的比例，加入9倍體積的無菌生理鹽水，4 ℃下機械勻漿（2 500 r/min）離心10 min，取上清液待測。各組織蛋白濃度采用考馬斯亮藍法進行測定，具體操作步驟參照南京建成生物有限公司的蛋白測定試劑盒進行。

1.3.2NO測定

組織待測上清液獲取方式與1.3.1相同。參照南京建成生物有限公司的NO測定試劑盒說明書對各組織中的NO進行測定。

1.3.3TNOS和iNOS測定

組織待測上清液獲取方式與1.3.1相同。參照南京建成生物有限公司的NOS分型測定試劑盒說明書對各組織中的TNOS和iNOS進行測定。

1.3.4LYZ測定

組織待測上清液獲取方式與1.3.1相同。參照孫金輝等［27］的方法對各組織中的LYZ進行測定。

1.3.5ACP和AKP測定

組織待測上清液獲取方式與1.3.1相同。參照南京建成生物有限公司ACP和AKP測定試劑盒說明書對各組織中的ACP和AKP進行測定。ACP活力單位定義為：每克組織蛋白在37 ℃與基質作用30 min產生1 mg酚為1個金氏單位。AKP活力單位定義為：每克組織蛋白在37 ℃與基質作用15 min產生1 mg酚為1個金氏單位。

1.3.6C3和C4測定

組織待測上清液獲取方式與1.3.1相同。參照上海鈺博生物科技有限公司的C3酶聯免疫分析試劑盒和C4酶聯免疫分析試劑盒對各組織中的C3和C4進行測定。

1.3.7Tf測定

待測上清液獲取方式與1.3.1相同。參照上海鈺博生物科技有限公司的轉鐵蛋白（Tf）酶聯免疫分析試劑盒對各組織中的Tf進行測定。

1.4數據分析

采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析（oneway ANOVA），采用Duncan’s法進行多重比較，分析各組間的差異顯著性，設Plt;0.05為差異顯著。

2結果

2.12個年齡組大鯢組織中NO的分布及活性比較

2個年齡組大鯢組織中NO的分布及活性見圖1。結果顯示，1齡大鯢各組織中NO的活性大小分布和活性比較依次為：肝臟gt;腸道gt;脾臟，其中肝臟中NO的活性顯著高于腸道和脾臟（Plt;0.05）。2齡大鯢各組織中NO的活性無顯著性差異（Pgt;0.05）。同一組織中NO的活性在2個年齡組大鯢間也存在一定的差異，但只有1齡大鯢組肝臟中NO的活性顯著高于2齡大鯢組（Plt;0.05）。

2.22個年齡組大鯢組織中TNOS和iNOS的分布及活性比較

2個年齡組大鯢各組織中TNOS和iNOS的活性分布見圖2～圖3。圖2結果顯示，1齡大鯢各組織中TNOS的活性大小依次為：腸道gt;肝臟gt;脾臟，其中腸道中TNOS的活性顯著高于肝臟和脾臟（Plt;0.05）。2齡大鯢各組織中TNOS的活性大小依次為：肝臟gt;腸道gt;脾臟，其中肝臟中TNOS的活性顯著高于腸道和脾臟（Plt;0.05）。同一組織中TNOS的活性在2個年齡組大鯢間也存在一定的差異，其中1齡大鯢組肝臟中TNOS的活性顯著低于2齡組（Plt;0.05），1齡組腸道和脾臟中TNOS的活性顯著高于2齡組（Plt;0.05）。

圖3結果顯示，1齡大鯢各組織中iNOS的活性依次為：腸道gt;肝臟gt;脾臟，其中腸道iNOS活性顯著高于肝臟和脾臟（Plt;0.05）。2齡大鯢各組織中iNOS的活性大小依次為：肝臟gt;腸道gt;脾臟，其中肝臟iNOS的活性顯著高于腸道和脾臟（Plt;0.05）。同一組織中iNOS的活性在2個年齡組大鯢間也存在一定的差異，其中1齡大鯢組肝臟中iNOS的活性顯著低于2齡大鯢組（Plt;0.05），而1齡大鯢組腸道中iNOS的活性顯著高于2齡大鯢組（Plt;0.05）。注：柱狀圖上方標注不同大寫字母表示同一年齡組不同組織間差異顯著（Plt;0.05），標注不同小寫字母表示不同年齡組同一組織間差異顯著（Plt;0.05）。

2.32個年齡組大鯢組織中LYZ的分布及活性比較

2個年齡組大鯢各組織中LYZ的活性分布見圖4。結果表明，1齡大鯢各組織中LYZ的活性大小依次為：脾臟gt;腸道gt;肝臟，其中脾臟中LYZ的活性顯著高于肝臟（Plt;0.05）。2齡大鯢各組織中LYZ的活性大小依次為：腸道gt;肝臟gt;脾臟，其中腸道中LYZ的活性顯著高于肝臟和脾臟（Plt;0.05）。同一組織中LYZ的活性在2個年齡組大鯢間也存在一定的差異，其中1齡大鯢腸道和脾臟中LYZ的活性顯著高于2齡大鯢（Plt;0.05）。

2.42個年齡組大鯢組織中ACP和AKP的分布及活性比較

2個年齡組大鯢各組織中ACP和AKP的活性比較見圖5～圖6。圖5結果顯示，1齡大鯢各組織中ACP的活性大小依次為：脾臟gt;肝臟gt;腸道，其中脾臟中ACP的活性顯著高于腸道（Plt;0.05）。2齡大鯢各組織中ACP的活性大小依次為：脾臟gt;肝臟gt;腸道，其中脾臟中ACP的活性顯著高于肝臟和腸道（Plt;0.05）。同一組織中ACP的活性在2個年齡組大鯢間無顯著性差異（Pgt;0.05）。

圖6結果顯示，1齡大鯢各組織中AKP的活性大小依次為：脾臟gt;腸道gt;肝臟，其中脾臟中AKP的活性顯著高于腸道和肝臟（Plt;0.05）。2齡大鯢各組織中AKP的活性大小依次為：腸道gt;脾臟gt;肝臟，其中腸道中AKP的活性顯著高于肝臟（Plt;0.05）。同一組織中AKP的活性在2個年齡組大鯢間也存在一定的差異，但只有1齡大鯢脾臟中AKP的活性顯著高于2齡大鯢（Plt;0.05）。

2.52個年齡組大鯢組織中C3和C4的分布及活性比較

2個年齡組大鯢各組織中C3和C4的活性比較見圖7～圖8。圖7結果顯示，1齡大鯢各組織中C3的活性大小依次為：肝臟gt;腸道gt;脾臟，其中肝臟中C3的活性顯著高于脾臟（Plt;0.05）。2齡大鯢各組織中C3的活性大小依次為：肝臟gt;脾臟gt;腸道，其中肝臟中C3的活性顯著高于脾臟和腸道（Plt;0.05）。同一組織中C3的活性在2個年齡組大鯢間也存在一定的差異，其中1齡大鯢肝臟和腸道中C3的活性顯著高于2齡大鯢（Plt;0.05）。

分布和活性比較組織中C4的活性大小依次為：肝臟gt;脾臟gt;腸道，其中肝臟和脾臟中C4的活性顯著高于腸道（Plt;0.05）。同一組織中C4的活性在2個年齡組大鯢間存在一定的差異，1齡大鯢3個組織中C4的活性均顯著高于2齡大鯢組（Plt;0.05）。

2.6不同年齡組大鯢組織中Tf的分布及活性比較

2個年齡組大鯢各組織中Tf的分布及活性見圖9。結果顯示，1齡大鯢各組織中Tf的活性大小依次為：脾臟gt;腸道gt;肝臟，其中脾臟和腸道中Tf的活性顯著高于肝臟（Plt;0.05）。2齡大鯢各組織中Tf的活性大小依次為：脾臟gt;肝臟gt;腸道，其中脾臟中Tf的活性顯著高于肝臟和腸道（Plt;0.05）。同一組織中Tf的活性在2個年齡組大鯢間也存在一定的差異，其中1齡大鯢肝臟和腸道中Tf的活性顯著高于2齡大鯢（Plt;0.05）。

3討論

NO廣泛分布于水生動物的血清［28］、血漿［29］、肝臟、脾臟、頭腎和腎臟［30］中，而其濃度的變化與水生動物的生理健康狀況緊密相關［2829］，因此，NO可作為反映水生動物非特異免疫功能的一個重要指標。黃江等［29］發現，未經灌服中草藥的1齡施氏鱘（Acipenser schrenckii），其血漿中NO的活性明顯高于肝臟，而張勝根等［30］卻發現，半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）肝臟和脾臟中NO的活性顯著高于腸道。本試驗發現，1齡和2齡大鯢的肝臟、腸道和脾臟均存在NO，并且2個年齡組大鯢肝臟中NO的活性均較高，結果表明，大鯢肝臟是NO分布的主要組織。NO在大鯢肝臟中的活性較高，可能與肝臟作為大鯢重要的消化和免疫器官有關。

NOS廣泛存在于水生動物的各種組織中，并參與機體循環、呼吸、消化和免疫系統的調節作用［10］。先前有研究表明，iNOS在受到病原菌感染或免疫刺激時會大量誘導表達，但在水產動物正常生理條件下的一些組織內也能檢測到iNOS的存在［3132］。黃江等［29］研究發現，未經中草藥處理的1齡施氏鱘，其血漿中TNOS（包括cNOS和iNOS）活性明顯高于肝臟;而張勝根等［30］卻發現，半滑舌鰨腸道中iNOS的活性高于肝臟和脾臟。本試驗發現，2個年齡組大鯢的肝臟、腸道和脾臟中均檢測出TNOS和iNOS，其中TNOS和iNOS活性在1齡大鯢的腸道中較高，而在2齡大鯢的肝臟中較高，這一結果表明，1齡大鯢腸道和2齡大鯢肝臟是TNOS與iNOS分布的主要組織。TNOS和iNOS在大鯢腸道和肝臟中活性較高，這可能與二者是重要的消化和免疫器官，并富含巨噬細胞有關。

LYZ被廣泛發現于水生動物的血清、皮膚黏液和各種組織中，其活性可反映出抑菌作用的強弱［33］。劉金蘭等［34］在對4種養殖魚類的LYZ活性比較研究中發現，黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）和黃鱔（Monopterus albus）脾臟中LYZ的活性高于腸黏膜。劉紅柏等［35］發現，LYZ在史氏鱘腸道中的活性高于肝臟和脾臟。本試驗2個年齡組大鯢的肝臟、腸道和脾臟中均發現LYZ，LYZ分別在1齡大鯢的脾臟和2齡大鯢的腸道中活性較高，這一結果表明，1齡大鯢的脾臟和2齡大鯢的腸道分別是LYZ分布的主要組織。LYZ在大鯢脾臟和腸道中活性較高，這可能與水生動物脾臟和腸道中含有大量的淋巴細胞和吞噬細胞，能夠分泌溶菌酶并發揮非特異性免疫功能有關。

ACP是溶酶體的重要標志酶，其分布區域表明存在大量的溶酶體及其他水解酶。盧彤巖等［36］的研究指出，不同年齡組哲羅魚（Hucho taimen）鰓中ACP的活性均明顯高于肝臟;而原居林等［37］發現，ACP分別在1齡大鯢的肝臟和2齡大鯢的腸道中活性較高。郇志利等［38］在研究黃鱔不同免疫組織的非特異性免疫因子中發現，其脾臟中ACP的活性高于肝臟和腸道。本試驗中，1齡和2齡大鯢的肝臟、腸道和脾臟中均發現ACP，并且在2個年齡組大鯢脾臟中活性均較高，表明其脾臟是ACP分布的主要組織，這可能與脾臟是大鯢重要的免疫功能器官相關。

AKP作為預測水生動物疾病診斷及水體環境污染程度的主要指標，在水產動物免疫防御反應中發揮著重要作用。沈國民等［39］在對中國大鯢24種組織器官AKP活性的初步分析中發現，其心臟中AKP的活性高于肝臟、腸道和皮膚。原居林等［37］研究發現，不同年齡階段的大鯢，其皮膚中AKP的活性較高。郇志利等［38］發現，黃鱔肝臟組織中AKP的活性高于脾臟和腸道。本試驗2個年齡組大鯢的肝臟、腸道和脾臟中均發現AKP，其中1齡大鯢的脾臟和2齡大鯢的腸道中AKP活性較高，表明1齡大鯢的脾臟和2齡大鯢的腸道分別是AKP分布的主要組織，這可能與脾臟和腸道是大鯢重要的免疫功能器官有關。

補體是水生動物重要的非特異性免疫因子，其主要功能是抵御病原菌和增強免疫效應。C3和C4作為補體系統的重要組成成分，在補體途徑激活中起到中樞作用［40］。郇志利等［38］研究發現，黃鱔肝臟中C3和C4的活性顯著高于脾臟和腸道。楊貴強等［40］在3種鱘魚血清及組織中補體活性的比較研究中也發現，C3和C4的活性在3種鱘魚肝臟中均為最高。本試驗發現，1齡和2齡大鯢的肝臟、腸道和脾臟中均存在C3和C4，并且2個年齡組大鯢肝臟中C3和C4的活性均處于較高水平，表明大鯢的肝臟是C3和C4分布的主要組織，這可能與肝臟是大鯢重要的消化和免疫功能器官有關。

作為一種廣泛存在于水生脊椎動物組織中重要的非特異性免疫因子，Tf主要由肝臟細胞合成，在血漿中活性較高并參與機體的免疫防御反應［24，41］。高明英等［26］的研究顯示，黃喉擬水龜肝臟中Tf的活性高于脾臟。本試驗發現，1齡和2齡大鯢的肝臟、腸道和脾臟中均存在Tf， 2個年齡組大鯢脾臟中Tf的活性均較高，表明其脾臟是Tf分布的主要組織。鐵是水生脊椎動物代謝過程中的重要金屬元素，其中鐵離子的含量與調節會直接影響機體生理功能，而大鯢脾臟中含有大量的血細胞和淋巴細胞，具有調控血量和鐵離子濃度的功能，這可能與Tf在大鯢脾臟中活性較高有關。

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