低鹽度下亞硝酸鹽對凡納濱對蝦毒性與抗氧化能力的影響

摘要：為探究低鹽度條件下亞硝酸鹽對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）急性毒性及其氧化應激的影響，在鹽度為1的水體中進行了急性毒性試驗，測定質量濃度4 mg/L和8 mg/L的亞硝酸鹽暴露和換水恢復期間凡納濱對蝦的抗氧化指標，記錄恢復24 h后對蝦的存活率、蛻殼率、攝食時間。結果顯示，當鹽度為1時，亞硝酸鹽對凡納濱對蝦24、48、72和96 h的半致死濃度（LC50）分別為15.96、9.97、7.54和5.25 mg/L，安全濃度（SC）為0.53 mg/L。經不同質量濃度亞硝酸鹽脅迫后，凡納濱對蝦血淋巴超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，顯著高于0 h時（P＜0.05）；暴露3、6 h后，8 mg/L組的肝胰腺SOD活性顯著高于4 mg/L組（P＜0.05）。凡納濱對蝦血淋巴和肝胰腺谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性升高，暴露3、6 h后，8 mg/L組GSHPx的活性均顯著高于4 mg/L組（P＜0.05）；血淋巴過氧化氫酶（CAT）活性下降，4 mg/L組在6、24 h時的CAT活性顯著低于0 h時（P＜0.05），肝胰腺CAT活性則呈現波動，24 h后試驗組CAT活性顯著高于0 h時（P＜0.05），暴露24 h后，8 mg/L組的CAT活性顯著高于4 mg/L 組（P＜0.05）。將試驗蝦轉至不添加亞硝酸鹽的養殖用水中恢復24 h后，其肝胰腺丙二醛（MDA）含量仍顯著高于0 h時（P＜0.05），其中8 mg/L組MDA含量顯著高于4 mg/L組（P＜0.05）；與對照組相比，2個試驗組對蝦（F24）存活率下降，蛻殼率顯著升高（P＜0.05），攝食時間顯著延長（P＜0.05），其中8 mg/L組存活率顯著低于4 mg/L組（P＜0.05），而其攝食時間顯著長于4 mg/L組（P＜0.05）。結果表明，在低鹽度養殖水體中，亞硝酸鹽毒性較強，對凡納濱對蝦抗氧化能力有顯著影響。

關鍵詞：亞硝酸鹽；凡納濱對蝦；低鹽度；毒性；抗氧化能力

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對蝦，隸屬于節肢動物門（Arthropoda）、軟甲綱（Malacostraca）、十足目（Decapoda）、對蝦科（Penaeidae）、濱對蝦屬（Litopenaeus），原產于拉丁美洲地區。該蝦具有生長快、抗逆性強、營養價值高等特點，廣受世界各地消費者青睞，是當今世界養殖產量最高的對蝦種類之一［1］。凡納濱對蝦具有較強的鹽度適應能力，可適應從淡水到鹽度50的水體，最適鹽度為15～25，目前在我國東部沿海到西部內陸等咸水、半咸水、淡水區域均有養殖，也是我國主要的養殖蝦類［23］。

沿海養殖面積不斷擴張所帶來的污染和病害傳播問題已嚴重影響了對蝦產業高質量健康發展［4］。探索內陸鹽堿地對蝦養殖模式，拓展生產空間已成為對蝦產業發展的重要趨勢［5］。本實驗室近年來于遼寧盤錦鹽堿區域稻田，在當地蟹稻種養模式基礎上利用田間工程進行凡納濱對蝦養殖，獲得初步成功［6］。然而，在養殖中后期水體中亞硝酸鹽含量常常會超標，嚴重影響對蝦生長，甚至發生大量死亡現象。目前，關于亞硝酸鹽對對蝦毒性的研究報道較多［79］。在低鹽度水體中亞硝酸鹽對對蝦的毒性危害較大，會影響對蝦的生長、存活、代謝和免疫系統［1012］，但其影響程度與評價指標尚無統一標準。

本試驗選擇在盤錦稻田水體鹽度范圍內開展低鹽度水體中亞硝酸鹽對凡納濱對蝦的毒性研究，檢測了亞硝酸鹽暴露與恢復對蝦的抗氧化能力相關指標，對恢復后對蝦的存活率、蛻殼率和攝食時間進行了記錄，旨在研究對蝦亞硝酸鹽毒性響應機理與毒性評價標準，為低鹽度水體對蝦養殖技術的優化提供參考。

1材料和方法

1.1材料

凡納濱對蝦來自盤錦光合蟹業有限公司。試驗開始前，選取健康活潑、體長（8.03±0.20）cm、體質量（5.50±0.15）g的蝦，置于200 L水槽中暫養5 d。暫養用水為當地稻田灌溉用水，經沉淀、過濾、消毒處理，鹽度為1，水溫（26.6±0.3）℃，pH 為8.33±0.13，溶解氧在6 mg/L以上。暫養期間，每天更換1/2水，每日投喂南美白對蝦配合飼料（廣東恒興集團有限公司）3次。

NaNO2（分析純）配制成質量濃度為1 000 mg/L的母液后，使用重氮偶氮光度法［13］測定其準確濃度，稀釋后備用。

1.2 方法

1.2.1亞硝酸鹽對凡納濱對蝦急性毒性試驗

根據預試驗結果，用NaNO2母液按等對數間距［13］設置5個亞硝酸鹽（以N計）質量濃度組，分別為3.16、5.01、7.94、12.58、19.95 mg/L，試驗水體為30 L，每組設置3個平行。并設置亞硝酸鹽為0的原水對照組。每組放入試驗蝦20尾，每12 h吸污1次，去除死亡個體，記錄對蝦暴露24、48、72、96 h的死亡數量。當對蝦口器及顎舟片不動，觸碰其無反應后，可確認為死亡。

半致死濃度（LC50）通過SPSS 21.0軟件中的Probit回歸法計算。根據以下公式求出安全濃度（SC）［14］。

C1=C2×0.1（1）

式（1）中，C1為安全濃度，mg/L；C2為96 h半致死濃度，mg/L。

1.2.2亞硝酸鹽對凡納濱對蝦抗氧化能力影響的測定

設置亞硝酸鹽質量濃度分別為4 mg/L和8 mg/L的 2個試驗組，同時設亞硝酸鹽質量濃度為0的對照組。每組3個平行。試驗水體為30 L。每組放入健康對蝦30尾，每天換水并及時剔除死亡個體。當亞硝酸鹽暴露0、3、6、12、24 h以及恢復24 h后，隨機取3尾試驗蝦，自圍心腔處取血淋巴液，于-20 ℃保存備用。解剖取試驗蝦的肝胰腺，剪碎后加入9倍生理鹽水，低溫下勻漿，離心后取上清，于-80 ℃保存備用。對蝦組織蛋白質含量、抗氧化指標采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，具體操作方法參照說明書。

2個試驗組的凡納濱對蝦在暴露24 h后，將其分別轉移至不添加NaNO2的新鮮養殖水體中（對照組）恢復24 h（F24），然后按其體質量的1%投喂對蝦配合飼料，每隔10 min觀察其攝食進度，無飼料剩余即為攝食完成，記錄攝食時間、對蝦死亡數和蛻殼數。

1.2.3數據統計分析

試驗數據采用（平均值±標準差）來表示。采用兩獨立樣本t檢驗進行統計分析，2個暴露濃度組不同時間點及恢復后存活率、蛻殼率、攝食時長數據比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），若差異顯著，用Duncun’s檢驗進行多重比較，設P＜0.05為差異顯著。使用Origin 2022軟件作圖。

2結果

2.1亞硝酸鹽對凡納濱對蝦的急性毒性

將凡納濱對蝦從暫養水槽放入各試驗水槽后，對照組對蝦很快恢復正常活動狀態，而各濃度試驗組對蝦則大多有跳動或急游現象。3 h后，7.94 mg/L濃度組對蝦不再游動，易于被捕撈，19.95 mg/L組對蝦鰓部嚴重發黑，軀體變白，側躺于底部，僅游泳足有擺動，6 h后該組對蝦死亡過半，死亡個體鰓蓋外翻。對照組對蝦在96 h后仍正常活動、攝食。亞硝酸鹽對凡納濱對蝦的急性毒性結果見表1。結果可見，隨著亞硝酸鹽質量濃度的增加，中毒死亡的對蝦個體數增加。當亞硝酸鹽質量濃度為3.16 mg/L時，96 h對蝦的死亡率為15％；當亞硝酸鹽質量濃度達到19.95 mg/L時，96 h死亡率達到100％。在同一質量濃度試驗組中，對蝦中毒及死亡的數量隨著暴露時長而增加，呈現出明顯的劑量時間效應關系。

2.2亞硝酸鹽脅迫對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響

不同質量濃度亞硝酸鹽脅迫后，凡納濱對蝦血淋巴、肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）活性變化見圖1a～b。由結果可見，在亞硝酸鹽脅迫3 h后，2個試驗組對蝦的血淋巴SOD活性均顯著升高，顯著高于0 h時（P＜0.05）。脅迫6 h，4 mg/L組血淋巴SOD的活性顯著高于8 mg/L組（P＜0.05）。肝胰腺SOD活性則呈現波動狀態，脅迫3、6 h時，8 mg/L組肝胰腺SOD的活性顯著高于4 mg/L組（P＜0.05）。置于養殖用水中恢復24 h（F24）后，2個試驗組對蝦的血淋巴GSHPx活性仍顯著高于0 h（P＜0.05），其中4 mg/L組血淋巴SOD活性顯著高于8 mg/L組（P＜0.05），而肝胰腺SOD活性則顯著低于8 mg/L 組（P＜0.05）。

各試驗組對蝦血淋巴、肝胰腺谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性的變化見圖1c～d。經不同質量濃度亞硝酸鹽脅迫后，試驗組蝦的血淋巴GSHPx的活性均有所升高，除24 h外各時間點的GSHPx的活性均顯著高于0 h時（P＜0.05），8 mg/L組在亞硝酸鹽脅迫3、6、24 h后，其血淋巴GSHPx的活性顯著高于4 mg/L組（P＜0.05）。亞硝酸鹽脅迫后，試驗組蝦肝胰腺的GSHPx活性也發生了一定的變化，其中12、24 h時，2個試驗組的肝胰腺GSHPx活性均顯著高于0 h時（P＜0.05），8 mg/L組在脅迫6 h時，其肝胰腺GSHPx的活性顯著高于4 mg/L組（P＜0.05）。恢復24 h（F24）后， 4 mg/L組血淋巴、肝胰腺的GSHPx的活性GSHPx的活性均顯著高于8 mg/L組（P＜0.05），其中4 mg/L組血淋巴GSHPx的活性顯著高于0 h時，而肝胰腺GSHPx的活性與0 h時接近（P＞0.05），8 mg/L組血淋巴、肝胰腺GSHPx活性與0 h時均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

經亞硝酸鹽脅迫后，各組對蝦血淋巴、肝胰腺過氧化氫酶（CAT）活性的變化見圖1e～f。4 mg/L組試驗蝦血淋巴CAT活性在6、24 h時顯著低于0 h時（P＜0.05），2個試驗組之間CAT活性總體上較接近（P＞0.05）。2個試驗組的肝胰腺CAT活性先下降后又急劇升高，在脅迫12 h時CAT活性顯著低于0 h時（P＜0.05），24 h時又顯著高于0 h時（P＜0.05）而8 mg/L組在亞硝酸鹽脅迫3、24 h時的CAT活性顯著高于4 mg/L組（P＜0.05）。置于養殖用水中恢復24 h（F24）后，8 mg/L組對蝦血淋巴CAT活性顯著低于0 h時（P＜0.05），4 mg/L組血淋巴CAT活性顯著高于8 mg/L組（P＜0.05），而與0 h時沒有顯著性差異（P＞0.05）；8 mg/L組肝胰腺CAT活性顯著高于0 h時（P＜0.05），而4 mg/L組肝胰腺CAT活性與0 h時沒有顯著差異（P＞0.05）。

3討論

3.1亞硝酸鹽對凡納濱對蝦的急性毒性

影響對蝦亞硝酸鹽中毒的因素較多，包含溶解氧、溫度、pH、鹽度等環境因素，以及對蝦個體大小、生理狀態等內在因素［7］。生產中，鹽度與亞硝酸鹽毒性關系緊密，因鹽度變化引起的亞硝酸鹽中毒事件頻發［1415］。亞硝酸鹽在水體中以NO2-、HNO2的形式存在，后者因養殖水體pH較高一般不存在。NO2-通過位于鰓細胞上HCO3-/Cl-離子交換位點和Cl-競爭進入對蝦體內，跨過鰓在血淋巴中積累，致使血淋巴中氧合血藍蛋白變成脫氧血藍蛋白，降低對氧的親和性，機體氧運輸能力下降，蝦體出現損傷，導致死亡［1617］。本試驗亞硝酸鹽對凡納濱對蝦的半致死濃度與日本囊對蝦（Penaeus japonicus）［18］、中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）［19］、斑節對蝦（Penaeus monodon）［20］、墨吉明對蝦（Fenneropenaeus merguiensis）［21］和羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）［22］相近。研究顯示，鹽度以及個體規格不同，亞硝酸鹽對對蝦的半致死濃度也相差較大［2324］。隨著鹽度升高，亞硝酸鹽對對蝦的半致死濃度也升高［25］。本試驗所獲得的安全濃度（0.53 mg/L）與RamírezRochín等［14］在鹽度1條件下凡納濱對蝦毒性試驗所得出的安全濃度（0.45 mg/L）相近。

3.2亞硝酸鹽對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響

甲殼動物的進化地位低，在面臨環境脅迫或者病原攻擊時主要依靠先天免疫系統來進行防御［26］。已有研究表明，蝦類在應對亞硝酸鹽脅迫時機體抗氧化系統發揮了重要作用［27］。其中SOD活性反映了機體清除超氧自由基的能力，它可將氧化損傷產生的超氧自由基（O2-）轉化為H2O2供CAT、GSHPx反應，協同參與H2O2和脂質過氧化物的解毒過程。在H2O2濃度較低的情況下，GSHPx首先參與反應，它可將脂質中的過氧化物還原為醇類，防止脂質過氧化，從而保護細胞免受氧化損傷；在高H2O2濃度下，GSHPx被CAT代替。MDA作為脂質過氧化物的最終產物，其含量反映了機體受超氧自由基攻擊的嚴重程度［2830］。研究發現，亞硝酸鹽脅迫后，對蝦肝胰腺和血淋巴中MnSOD等抗氧化酶基因表達量上調，相應的抗氧化活性升高［1011］。本試驗中，在高質量濃度亞硝酸鹽脅迫后，凡納濱對蝦血淋巴SOD活性受到了抑制，而肝胰腺SOD活性升高。也有研究表明，亞硝酸鹽脅迫使墨吉明對蝦肝胰腺SOD活性降低［31］。產生這種不同結果的原因可能是在亞硝酸鹽脅迫下，對蝦血淋巴會在短時間內產生大量的自由基，抑制SOD活性，而在肝胰腺中則通過提高SOD活性來達到去除自由基的目的，保護對蝦肝胰腺免受損傷。對蝦血淋巴和肝胰腺GSHPx的活性升高，可能是亞硝酸鹽脅迫后，誘導GSHPx基因的表達量增加［11］ 。血淋巴CAT活性未出現明顯變化，而肝胰腺CAT活性后期升高，這可能是由于脅迫前期主要參與反應的是GSHPx，而后期肝胰腺受到脅迫產生的活性氧大量轉化為H2O2，誘導CAT活性升高，替代GSHPx參與反應［3233］。當凡納濱對蝦轉到新鮮養殖水體恢復后，高亞硝酸鹽濃度組肝胰腺SOD活性和MDA含量仍然較高，也說明肝胰腺受到氧化損傷較為嚴重，隨著MDA含量增加，SOD活性升高，才能達到去除自由基保護機體的目的［10］。

對蝦受到外界環境刺激時，也會出現異常蛻殼現象［34］。本試驗中，凡納濱對蝦在恢復過程中頻繁蛻殼，表現出明顯的應激反應。蛻殼需要消耗大量氧氣，而受損的呼吸機能未得到充分恢復，蛻殼不遂，會導致死亡現象加劇。8 mg/L（F24）組試驗蝦在轉移至新鮮養殖用水后，其存活率顯著降低，推測高質量濃度的亞硝酸鹽脅迫對蝦體造成的損傷有不可逆性，很難修復。此外，對蝦在亞硝酸鹽脅迫至中毒的過程中，其自身抵御病原入侵的能力下降，也是養殖對蝦在中后期易發病的主要原因。攝食時間和攝食量反映對蝦的攝食能力。在亞硝酸鹽暴露初期，對蝦攝食能力會有所減弱，即使在新鮮養殖用水中恢復后，其攝食能力仍受到影響，若亞硝酸鹽脅迫導致對蝦的肝胰腺受到損傷，則其恢復攝食的過程會較長。因此，在凡納濱對蝦養殖過程中，可以通過攝食量和攝食時間及時判斷對蝦的生存狀態，并配合實施水質調控、精準投飼等預防性策略，避免水體亞硝酸鹽中毒的發生。

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