鹽度和藻種密度對牟氏角毛藻生長及其用于養殖尾水處理效果的影響

摘要：為探究鹽度以及接種密度對牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）生長的影響，采用單因子試驗方法研究了不同鹽度和接種密度對牟氏角毛藻生長和細胞生化組成的影響以及牟氏角毛藻接種密度對水體中氮、磷元素去除效果的影響。試驗結果顯示，鹽度和接種密度對牟氏角毛藻的生長速率、蛋白質和脂肪質量分數均有顯著影響（P＜0.05）。在鹽度20的培育條件下，牟氏角毛藻的比生長速率最大，達到（0.117±0.001）/d，而鹽度15與鹽度20組的比生長速率相近，兩組之間差異不顯著（P＞0.05）；在鹽度15的培育條件下，牟氏角毛藻的蛋白質和總脂質量分數均最高。當接種密度為0.694×106 cells/mL時，牟氏角毛藻的比生長速率最大，達到了（0.210±0.001）/d，同時，對水體中NH4+N、NO3-N、PO43-P的去除率也最高，且均顯著高于其他接種密度試驗組（P＜0.05），分別為（97.75±0.18）%、（76.64±0.35）%、（96.70±0.35）%。結果表明，牟氏角毛藻大規模培育可以選擇在鹽度15～20、接種密度為0.694×106 cells/mL的條件下進行。

關鍵詞：牟氏角毛藻；鹽度；接種密度；比生長速率；生化組成；養殖尾水

牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）是一種隸屬于硅藻門中的小型海洋浮游硅藻，其細胞壁薄，藻體呈現金黃色，通常單個或2～3個細胞相連成群體生活［1］。牟氏角毛藻具有廣鹽性、耐高溫、繁殖周期短、抗污染能力強等特點，并且藻細胞內含有大量脂肪酸、蛋白質等大分子營養物質，因此被廣泛應用于魚類、貝類和蝦類等幼體的人工育苗，作為生物餌料，為養殖動物提供生長所需要的營養物質，促進養殖動物生長，降低其死亡率［24］。另外，牟氏角毛藻在繁殖過程中可以有效降低養殖水體的污染，減少水體中殘留的抗生素，抑制其他有害生物的生長［5］。牟氏角毛藻在水產養殖中的作用較為重要，因此，大規模、穩定高效的藻生產技術是提高養殖成功率的因素之一。已有大量研究表明，牟氏角毛藻與其他海洋浮游植物一樣，其生長繁殖與生活環境密切相關，溫度、鹽度、光照、營養鹽等諸多非生物因素均對其穩定生長產生影響［67］。因此，開展對影響微藻生長、生化組成以及水質處理效果顯著因子的研究極有必要。目前國內外已經有大量關于牟氏角毛藻規模化培養條件優化的研究報道。班劍嬌等［8］研究認為，牟氏角毛藻最適生長鹽度為20，當鹽度為25時，其總脂質量分數可高達29.93%；欒會妮等［9］研究發現，某些耐高溫的角毛藻具有廣溫、廣鹽和廣光照的特性，可以在高鹽和高溫的地區應用規模化培育；曾蓓蓓等［10］認為，溫度、鹽度以及光照強度等因子共同的交互作用對牟氏角毛藻生長有顯著影響；朱昔恩等［11］研究發現，接種初始濃度和各種營養鹽在適宜的濃度下均能高效促進牟氏角毛藻的生長，但濃度過高對牟氏角毛藻的增殖速度和藻細胞密度均會產生明顯的抑制作用［12］。

雖然已有大量研究優化了影響牟氏角毛藻生長的各種因子，但針對接種密度和鹽度對牟氏角毛藻生長、細胞生化組成以及對水質處理效果的研究報道較少。牟氏角毛藻生長受環境因子等多方面非生物影響因素的影響，而且各影響因素在不同氣候區域對牟氏角毛藻的影響效果存在差異。因此，本研究以分離自汕尾海域的牟氏角毛藻為試驗對象，探討了不同鹽度和藻種密度對其生長性能和藻細胞生化組成的影響，以及藻種密度對水質處理效果的影響，以期篩選出最有利于牟氏角毛藻積累蛋白質和總脂質量分數，最適合其生長和水質處理效果好的培育鹽度和接種濃度，為汕尾海域規模化培育牟氏角毛藻提供參考。

1材料和方法

1.1藻種來源

本試驗藻種為牟氏角毛藻，分離自汕尾市東方銘海牡蠣繁育場。藻種以f/2培養基進行擴大培養，培養條件為：溫度26 ℃，濕度70%，光照強度3 000～4 000 lx，光暗比為12 h∶12 h，每隔2 h搖勻1次。

1.2試驗時間和地點

試驗于2023年9月1日至2023年11月1日在華南農業大學海洋學院實驗室進行。

1.3試驗用水

試驗用水為自行調配的模擬海水養殖廢水，參照李楨［13］和朱鑫［14］的方法調配，即在f/2培養基的基礎上，添加氯化銨和亞硝酸鈉作為氮源、磷酸二氫鈉（均為分析純）作為磷源調配成模擬海水養殖廢水，然后加入海水鹽結晶將鹽度調至20。配制好的模擬養殖廢水經高壓蒸汽滅菌（121 ℃，30 min）冷卻后備用。滅菌后的模擬海水養殖廢水的初始氮、磷水質指標見表1。

接種密度試驗共設置6個不同的接種密度，即0.694×106、1.156×106、1.619×106、2.081×106、2.544×106、3.006×106 cells/mL以及1個空白對照組，每個密度設置3個平行。對照組與試驗組相同，均在1 000 mL的錐形瓶中裝入500 mL模擬養殖廢水，并放入光照培養箱中。將處于對數生長期的原始藻液經離心（4 000 r/min，5 min）后加入裝有500 mL模擬養殖廢水的錐形瓶中，并調整至相對應的接種密度。接種后，將其放入藻類光照培養箱內進行培養，培養條件為：溫度26 ℃，濕度70%，光照強度3 000～4 000 lx，光暗比為12 h∶12 h。試驗共持續12 d，每隔2 h搖勻1次。每隔24 h取水樣5 mL測定牟氏角毛藻的生物量，每隔48 h取水樣50 mL，經離心（4 000 r/min，5 min）后取上清液進行水質指標測定。取12 d的水樣測定水樣中牟氏角毛藻的總脂和蛋白質質量分數。

1.5測定方法

1.5.1藻細胞生物量測定

藻細胞生物量采用光密度法測定［15］。使用0.1 μL血細胞計數板在光學顯微鏡下計數牟氏角毛藻的細胞數量，并用722可見分光光度計測定樣品的光吸收值OD680，制作標準曲線。測定藻液樣品在OD680的吸光度，通過標準曲線的計算公式計算牟氏角毛藻的細胞密度，并計算比生長速率，計算公式如下。

1.5.2藻干質量測定

第12天時，取搖勻后的藻液50 mL進行抽濾，使用0.22 μm并烘至恒重的濾膜，用去離子水清洗3次，然后將濾膜于85 ℃烘箱中烘干至恒重，使用精密電子天平稱量，計算藻的干質量［16］。

1.5.3總脂和蛋白質質量分數的測定

采用考馬斯亮藍染色法測定角毛藻細胞內的蛋白質質量分數［17］，具體方法為：取搖勻的30 mL藻液于50 mL離心管中離心（4 000 r/min）10 min，去掉上清液，加入去離子水定容至30 mL后搖勻，于冰浴中使用超聲波粉碎機粉碎10 min（700 W，超聲5 s，間隔3 s），再離心（4 000 r/min）10 min，取1 mL上清液，加入考馬斯亮藍染色液5 mL后搖勻，靜置5 min后，使用紫外可見分光光度計測定吸光值OD595，根據標準曲線計算蛋白質含量，然后計算蛋白質質量分數。采用氯仿/甲醇抽提法測定總脂質量分數［18］。取搖勻的藻液50 mL于離心管中離心（4 000 r/min）10 min，去掉上清液，然后加入去離子水搖勻、離心，重復2次。重復結束后，向離心管中加入20 mL體積比為2∶1的氯仿甲醇混合溶劑，搖勻后浸泡過夜。次日使用超聲波粉碎機在冰浴中進行超聲波粉碎10 min（700 W，超聲5 s，間隔3 s），然后放入搖床振蕩10 min（150 r/min），離心（4 000 r/min）10 min，棄去上層水及含有藻細胞碎片的混合水層，收集下面的氯仿層，加入與氯仿層等體積的水后搖勻，離心（4 000 r/min）10 min，收集氯仿層并置于60 ℃烘箱內烘干至恒重，稱量，然后計算總脂質量分數。

1.5.4蛋白質和總脂質量分數計算

1.5.5水質指標測定

所測水質指標嚴格按照《海洋監測規范 第4部分 海水分析》（GB 17378.4—2007）的方法進行，其中NH4+N采用納氏試劑分光光度法，NO2-N采用萘乙二胺分光光度法，NO3-N采用紫外分光光度法，PO43-P采用磷鉬銨分光光度法。所用儀器為紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司，UV8000）。

1.6數據分析

試驗數據均以（平均值±標準差）表示，使用SPSS 17.0軟件對數據進行處理并進行單因素方差分析，若組間差異顯著（P＜0.05），則進行Duncan’s多重比較分析。采用EXCEL 2016進行繪圖。

2結果和分析

2.1鹽度對牟氏角毛藻培育的影響

2.1.1鹽度對牟氏角毛藻生長的影響

由圖1可見，牟氏角毛藻在鹽度5～25的條件下均能生長，但不同鹽度處理組的生長速率差異顯著（P＜0.05）。在鹽度為5的條件下，牟氏角毛藻生長極度緩慢，并且群體呈現出先死亡再生長的趨勢，表明牟氏角毛藻在超低鹽度條件下需要適應一段時間，然后再開始生長。牟氏角毛藻在15、20、25的鹽度條件下生長極快。

由表2可知，鹽度是影響牟氏角毛藻生長的關鍵性因素。15、20、25鹽度組的比生長速率均處于較高水平，3組之間在各個時期的藻細胞密度和比生長速率差異均不顯著（P＞0.05），均為牟氏角毛藻適宜的培育鹽度，其中鹽度20試驗組的比生長速率最高，達到了（0.117±0.001）/d。鹽度10和鹽度5試驗組的比生長速率均顯著低于15、20、25鹽度組（P＜0.05），其中鹽度5試驗組的比生長速率最低。試驗結果表明，鹽度5、10均不適用于牟氏角毛藻的規模化培育，其最適生長鹽度為20。

2.1.2鹽度對牟氏角毛藻細胞蛋白質和總脂質量分數的影響

由圖2可見，牟氏角毛藻在不同鹽度條件下總脂質量分數差異較大，說明鹽度對牟氏角毛藻細胞中脂肪的積累影響較大。其中在鹽度15的條件下，總脂質量分數處于較高水平，達到了39.35%，鹽度20條件下總脂質量分數也高達35.08%，2組差異不顯著（P＞0.05）；而鹽度5組總脂質量分數最低，僅有22.73%。試驗結果表明，中等鹽度有利于牟氏角毛藻脂肪的積累，對于培育高油脂牟氏角毛藻的最適鹽度為15。

由圖3可見，牟氏角毛藻在不同鹽度條件下蛋白質質量分數差異較大，說明水體鹽度對牟氏角毛藻蛋白質的積累有較大影響，中等鹽度有利于蛋白質的積累。其中在鹽度15的條件下牟氏角毛藻的蛋白質質量分數最高，達到了7.19%；在鹽度10條件下蛋白質質量分數最低，僅有3.91%。因此，對于培育高蛋白牟氏角毛藻的最適鹽度為15。

2.2接種密度對牟氏角毛藻培育的影響

2.2.1接種密度對牟氏角毛藻生長的影響

由圖4可見，不同接種密度的處理組，其每天的生長速率較為接近，其中接種密度為0.694×106 cells/mL試驗組的生長速率相對高于其他組別。經過12 d的培育，除了接種密度為1.156×106 cells/mL組外，不同接種密度試驗組的藻細胞密度差異不顯著（P＞0.05）。其中接種密度為2.544×106 cells/mL組的藻細胞密度相對最高，為（8.943±0.162）×106 cells/mL；接種密度為1.156×106 cells/mL組的最終藻細胞密度最低，為（8.221±0.062）×106 cells/mL。由表3可知，不同接種密度對牟氏角毛藻的比生長速率有顯著影響（P＜0.05）。接種密度為0.694×106 cells/mL組的比生長速率最高，為（0.210±0.001）/d；接種密度為3.006×106 cells/mL組的比生長速率最低，為（0.090±0.001）/d，不同接種密度組的比生長速率隨著接種密度的增加而逐漸減小，且各組之間比生長速率均有顯著差異（P＜0.05）。從結果可見，牟氏角毛藻培育的最適接種密度為0.694×106 cells/mL。

2.2.2接種密度對牟氏角毛藻細胞蛋白質和總脂質量分數的影響

不同接種密度試驗組總脂質量分數見圖5。由圖5可見，接種密度為2.544×106 cells/mL組的總脂質量分數最大，達46.66%；其次是接種密度為0.694×106、1.156×106、1.619×106、2.081×106 cells/mL的試驗組，其總脂質量分數分別為36.44%、37.89%、32.74%、35.49%，這4組之間總脂質量分數接近，差異不顯著（P＞0.05）；總脂質量分數最小的是接種密度3.006×106 cells/mL組，僅有15.64%，是質量分數最大組的1/3。因此，要培育高油脂牟氏角毛藻，最適的接種密度為2.544×106 cells/mL。

不同接種密度試驗組蛋白質質量分數見圖6。由圖6可見，接種密度0.694×106 cells/mL組的蛋白質質量分數最大，達11.06%；接種密度為2.081×106 cells/mL組的蛋白質質量分數最小，僅有7.22%。因此，從培育高蛋白質牟氏角毛藻的角度來說，最適接種密度為0.694×106 cells/mL。

2.2.3接種密度對水質的影響

由圖7可見，各試驗組水體中NH4+N的質量濃度均顯著低于對照組（P＜0.05）。試驗開始后，各試驗組NH4+N的質量濃度開始迅速降低，前4 d，各組降解速率均處于較高水平，其中接種密度為3.006×106 cells/mL的組在前2 d的降解速率達4.39 mg/（L·d），接種密度為0.694×106 cells/mL的組降解速率相對較低，為3.64 mg/（L·d）。在試驗的第4天，6個試驗組水體中NH4+N的質量濃度處于相近的水平，4 d后，各試驗組的降解速率開始下降，藻類開始緩慢地去除NH4+N。培育時間達到12 d時，各試驗組水體中NH4+N的質量濃度均處于極低的水平，幾乎為零。各試驗組對NH4+N的去除率見圖8。當培育時長達到12 d時，各試驗組對NH4+N的去除率均在95%以上。其中接種密度為0.694×106cells/mL的組對NH4+N的去除率最高，達到（97.75±0.18）%，接種密度為3.006×106cells/mL的組對NH4+N的去除率最低，為（96.20±0.09）%。

由圖9可見，各試驗組水體中NO2-N的質量濃度與對照組差異顯著（P＜0.05），但降解率較低。各試驗組水體中的NO2-N質量濃度均在培育第6天達到最低點，其中接種密度為2.544×106 cells/mL的組水體中的NO2-N質量濃度最低，為（1.19±0.02）mg/L。由圖10可見，除了接種密度為0.694×106 cells/mL與1.156×106 cells/mL的試驗組水體中NO2-N的質量濃度有顯著差異（P＜0.05）外，其他各組差異均不顯著（P＞0.05）。其中1.156×106 cells/mL接種密度組對NO2-N的去除率最高，為（14.09±1.44）%，0.694×106 cells/mL密度組對NO2-N的去除率最低，為（11.22±1.77）%。

由圖11可見，牟氏角毛藻不同接種密度各試驗組水體中的NO3-N質量濃度與對照組差異顯著（P＜0.05）。各試驗組水體中NO3-N的質量濃度在前6 d均處于平緩上升趨勢，從第6天開始，NO3-N質量濃度呈現快速下降的趨勢。經過12 d的培育，各試驗組水體中的NO3-N質量濃度均處于較低水平，其中接種密度為0.694×106 cells/mL的試驗組NO3-N質量濃度最低，為（3.71±0.06）mg/L。由圖12可見，除了接種密度為0.694×106 cells/mL的試驗組與其他試驗組差異顯著（P＜0.05）外，其他各試驗組對NO3-N的去除率沒有顯著差異（P＞0.05），各試驗組去除率均處于較高水平，其中0.694×106 cells/mL接種密度組對NO3-N的去除率最高，達到了（76.64±0.35）%，接種密度為3.006×106 cells/mL的組去除率最低，但也達到了（53.46±0.47）%。

由圖13可見，牟氏角毛藻不同接種密度的各試驗組，水體中的PO43-P質量濃度均顯著低于對照組（P＜0.05）。各試驗組在培育的前2 d對水體中PO43-P的去除速度極快，之后即開始緩慢去除PO43-P。在培育12 d后，各試驗組水體中的PO43-P質量濃度均處于較低的水平，顯著低于對照組（P＜0.05）。其中接種密度為0.694×106 cells/mL的試驗組，水體中的PO43-P質量濃度最低，為（0.12±0.01）mg/L。由圖14可見，牟氏角毛藻對水體中的PO43-P去除效果明顯，各試驗組去除率均在80%以上，但不同接種密度組PO43-P的去除率有差異。其中，接種密度0.694×106 cells/mL的試驗組對PO43-P的去除率最高，達到了（96.70±0.35）%；接種密度為3.006×106 cells/mL的試驗組去除率最低，但也達到了（84.47±0.54）%。隨著接種密度的提高，牟氏角毛藻對水體PO43-P的去除率也顯示出逐漸降低的趨勢。

3討論

3.1鹽度、接種密度對牟氏角毛藻生長的影響

水體鹽度是影響海洋生物滲透壓、生長和發育等的顯著性因素，因此，鹽度升降對于海洋微藻會產生較大的影響［20］。相關研究表明，鹽度會對藻細胞的滲透壓、營養吸收率以及細胞懸浮性等產生直接影響，如果超出藻細胞所能承受的范圍，就會對其造成傷害，甚至導致藻類細胞大量死亡［2122］。本研究結果表明，適合牟氏角毛藻生長的鹽度范圍是15～25，其中最適鹽度為20，這一結果與朱昔恩等［11］報道的牟氏角毛藻生長的最佳鹽度為20一致；張平等［20］研究表明，牟氏角毛藻穩定培育的適宜鹽度范圍為21～26，也與本研究結果基本一致。此外，分析本試驗數據發現，在培育的前10 d，鹽度5試驗組的藻細胞密度處于緩慢降低的趨勢，表明在此階段有藻細胞死亡，水體透明度增加；之后，該組的藻細胞密度又呈現上升的趨勢，推測可能是由于牟氏角毛藻需要較長的時間來適應低鹽度環境，待其調整自身的生理狀態后才逐步恢復增殖生長。

接種密度是影響微藻生長和繁殖的重要因子。朱藝峰等［23］研究表明，不同接種密度是影響三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）生長速率的顯著因子，當接種密度為1.431×106 cells/mL時，三角褐指藻的藻細胞密度可高達8.679×106 cells/mL。李鋒等［24］研究認為，亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）在控溫和常溫時的最佳接種密度分別為1.2×106、2.3×106 cells/mL。本研究結果同樣表明，接種密度是影響牟氏角毛藻生長的顯著性因素（P＜0.05）。牟氏角毛藻的最適接種密度為0.694×106 cells/mL，在此較低的接種密度下比生長速率達到最高，為（0.210±0.001）/d。這可能是因為牟氏角毛藻在高接種密度情況下，短時間內藻細胞的生存空間小于低接種密度情況，導致藻細胞之間的相互競爭。朱昔恩等［12］的研究結果表明，牟氏角毛藻的最佳接種密度為0.7×106 cells/mL，與本試驗結果一致。

3.2 鹽度、接種密度對牟氏角毛藻生化組成的影響

微藻作為優質生物餌料，對養殖動物的營養價值除了與微藻的大小和可消化性有關外，更關鍵在于微藻的細胞生化組成對動物營養需求的滿足程度［25］。很多環境因素均會影響微藻的生長速率以及細胞的生化組成，例如光照強度、光照顏色、溫度、鹽度、接種密度、超聲波處理等。相關研究表明，溫度會影響硅藻的增殖和光合作用，還會對其細胞合成和理化成分積累產生極大的影響［16］。朱松玲等［26］研究表明，在最適培育鹽度條件下，杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的光合速率、生長速率、光合色素增長速率、游離氨基酸總量和不飽和脂肪酸總量均顯著高于在其他鹽度條件下生長的鹽藻；李文權等［27］研究表明，超聲輻射也可以提高牟氏角毛藻的生長速率及主要不飽和脂肪酸質量分數。本研究結果表明，鹽度、接種密度均對牟氏角毛藻蛋白質和總脂質量分數產生較大影響。其中，高鹽度有利于蛋白質和脂肪的累積；牟氏角毛藻在鹽度15條件下的總脂和蛋白質質量分數均高于其他鹽度條件，尤其是總脂質量分數，達到了39.35%。不同接種密度對牟氏角毛藻總脂和蛋白質質量分數的影響相對較小，分析試驗結果可知，低接種密度有利于總脂和蛋白質的累積。綜上所述，從培育高蛋白、高脂肪牟氏角毛藻的角度，最適的鹽度和接種密度分別為15和0.694×106 cells/mL。

3.3 接種密度對模擬廢水中氮、磷的影響

氮、磷是微藻生長增殖的必需營養元素，是微藻細胞合成多蛋白質、脂肪、碳水化合物等物質不可或缺的。微藻通過吸收廢水中的氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽等物質，在滿足自身需求的同時，也起到了凈化水質的作用，實現了營養鹽的循環利用［28］。

本試驗結果表明，不同密度牟氏角毛藻對水體中的NH4+N、NO3-N、PO43-P均有非常明顯的去除作用，各試驗組的NH4+N去除率均達到了90%以上，PO43-P去除率達到了80%以上，NO3-N去除率達到了50%以上，且水體營養鹽濃度還有繼續下降的趨勢，但對NO2-N的去除效果相對較差。葉志娟等［29］研究發現，牟氏角毛藻對海水養殖廢水中NO2-N的去除率均達到了90%以上，分析原因，可能是該研究所選擇的海水養殖廢水中NH4+N的質量濃度偏低，僅為0.016 mg/L。有關學者研究發現，在污水處理中，微藻對氨態氮和其他還原態氮的利用程度要高于亞硝態氮和硝態氮，只有在氨態氮濃度很低或耗盡后才會利用硝態氮和亞硝態氮。本試驗結果與上述結論相一致。本試驗中，不同接種密度的試驗組之間在NH4+N、NO2-N、NO3-N以及PO43-P的去除率上有明顯差異，其中接種密度為0.694×106 cells/mL的試驗組，對NH4+N、NO3-N、PO43-P的去除率最高，分別為（97.75±0.18）%、（76.64±0.35）%、（96.70±0.35）%。綜上所述，牟氏角毛藻水質處理效果最好的接種密度為0.694×106 cells/mL。

4結論

本試驗結果表明，不同鹽度和不同接種密度對牟氏角毛藻的比生長速率、蛋白質和脂肪質量分數均有顯著影響。在鹽度為20的培育條件下，牟氏角毛藻的比生長速率最高，達到（0.117±0.001）/d，因此，要想在短時間內培育大量牟氏角毛藻可選擇此鹽度條件；而在鹽度15的培育條件下，牟氏角毛藻的蛋白質和總脂質量分數最大。因此，可將在鹽度20條件下培育的藻液進行二次淡化處理，降至鹽度15，以培育出營養價值較高的牟氏角毛藻。當接種密度為0.694×106 cells/mL時，牟氏角毛藻的比生長速率最高，達到（0.210±0.001）/d；在此接種密度下，對水體中NH4+N、NO3-N、PO43-P的去除率也達到最高，分別為（97.75±0.18）%、（76.64±0.35）%、（96.70±0.35）%，并且顯著高于其他接種密度試驗組（P＜0.05）。

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