4個熱帶玉米單倍體誘導系利用價值研究

摘要：為系統評價4個云誘系列熱帶玉米單倍體誘導系的誘導和加倍效果，為熱帶亞熱帶地區玉米雙單倍體技術的規模化運用提供新的誘導系和理論依據，以13份溫熱玉米雜交種為母本、4個云誘系列熱帶玉米單倍體誘導系為父本，進行雜交誘導和加倍試驗，對4個誘導系的誘導率、標記鑒定準確率、單穗平均單倍體粒數及14份單倍體材料自然加倍率進行分析。結果表明，4個誘導系的誘導率和標記鑒定準確率之間存在顯著差異，云誘一號的平均實際誘導率（6.45%）和平均標記鑒定準確率（42.92%）最低，與其他3個誘導系之間的差異均達到了極顯著水平，云誘二號、云誘三號、云誘四號的平均實際誘導率分別為12.82%、11.15%、11.69%，平均標記鑒定準確率分別為70.08%、78.08%、80.03%，三者之間差異不顯著；云誘二號誘導母本材料產生的單穗平均單倍體粒數最多（27.75粒），顯著優于其他3個誘導系；14份單倍體材料的授粉率為3.6%～19.6%，加倍結實株率為1.2%～10.7%。在對不同基礎材料進行誘導時，云誘二號誘導產生的單穗平均單倍體粒數最多，平均實際誘導率最高，產生高誘導率組合（實際誘導率gt;15%）的概率最大，誘導獲得的單倍體自然加倍效果好；云誘三號誘導能力強且誘導效果比較穩定。綜上所述，在進行熱帶和溫熱種質育種過程中可加強對熱帶玉米單倍體誘導系云誘二號和云誘三號的利用。

關鍵詞：玉米；單倍體；熱帶單倍體誘導系；誘導率；自然加倍

中圖分類號：S513.03""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）01-0109-08

大量獲取單倍體是運用雙單倍體（double haploid，簡稱DH）技術培育玉米新品種的第一步，人為選育出誘導能力強的高頻誘導系將有助于實現高效生產單倍體，推動DH技術的規模化運用，加快玉米種質的改良和新品種的選育。

自然情況下，單倍體發生的概率一般不超過0.01%^［1］。為了提高獲取單倍體的效率，科研工作者對體外培養花藥（花粉）產生單倍體與雜交誘導孤雌生殖產生單倍體這2個技術方向進行了研究。在實驗室培養花藥（花粉）產生單倍體難度大、效率低，很難運用到玉米育種生產中，而通過誘導系與優良玉米種質材料雜交誘導孤雌生殖產生單倍體在田間即可操作，且簡易高效，使得誘導系成為誘導單倍體產生的必備遺傳工具。自Coe于1959年選育出第1個誘導率達到3%左右的孤雌生殖誘導系——stock6后，國內外科研人員紛紛對誘導系stock6進行了改良，選育出了誘導率大幅提高的EMK（6%～10%）、PHIs（12.1%～14.5%）、農大高誘1號（1.92%～9.25%）及高油誘導系CAUHOI（5.3%～5.8%）等一系列誘導系^［2-5］。從利用這些誘導系誘導產生單倍體到進行單倍體染色體組加倍獲得純合的DH系只需2～3個世代，大幅降低了育種周期和成本，使得玉米DH育種技術進入實質應用階段，成為現代玉米育種的核心技術之一^［6］。美國杜邦先鋒、拜耳（孟山都）、德國KWS等國際公司已經在玉米育種項目中大規模運用DH技術，每年育成DH系高達5 000份以上，實現了規模化DH系育種^［7］。DH育種技術在我國也得到了高速發展，目前，我國生產上應用較多的玉米單倍體誘導系主要是溫帶誘導系，如農大高誘5號（誘導率可達12%）和吉高誘3號（平均誘導率達10.40%）等高頻誘導系^［8-9］。然而溫帶誘導系在熱帶亞熱帶地區應用時，往往表現出誘導率低、顏色標記不明顯、適應性差、花粉量小、難以擴繁等特點，導致DH技術在這些地區難以規模化運用。

為加快熱帶亞熱帶地區DH育種技術的規模化運用，特別是針對熱帶種質材料被誘導率低、顏色標記不明顯等情況，專化型誘導系的選育尤為重要。本研究對4個新選育的熱帶玉米單倍體誘導系的誘導率、單穗平均雜交總粒數、單穗平均單倍體粒數、標記鑒定準確率及自然加倍率等性狀進行系統性評價測定，以期篩選出抗逆性強、花粉量大、誘導率高、顏色標記明顯且適宜在熱帶亞熱帶地區種植的熱帶玉米單倍體誘導系。

1"材料與方法

1.1"試驗材料

選用13份溫熱玉米雜交種為測驗種（表1），以4個云誘系列熱帶玉米單倍體誘導系為被測系（表1）進行雜交誘導，根據雜交后代單倍體產生的頻率評價不同誘導系的誘導率。供試的4個誘導系均由云南省農業科學院玉米遺傳育種及應用創新團隊引進熱帶抗病玉米材料對高誘5號進行連續不斷的測驗、改良、回交和自交選育而成。4個誘導系的籽粒Navajo標記顯色明顯，且具有花粉量大、散粉期

1.2"試驗設計

1.2.1"雜交誘導試驗

2022年夏季在云南省昆明基地種植試驗材料。為使母本的吐絲期與父本的散粉期正常相遇，將13份母本材料一次性播種，4個父本誘導系分2批播種（與母本同期和晚母本 5 d 各播種1批），每份母本材料播種3行，每份父本材料每批次種2行，行長2.5 m，行距0.6 m，株距0.21 m，每行種植14株。在花期，將母本的雌穗套袋，取誘導系花粉，采用NCⅡ遺傳交配設計進行雜交誘導獲得F1代，每個雜交組合誘導3～5穗并在果穗成熟后及時收獲，用于進行準單倍體籽粒鑒選和誘導率統計分析。

1.2.2"準單倍體籽粒鑒選

果穗成熟收獲后，根據籽粒Navajo顏色標記性狀，進行單穗逐粒鑒定。胚乳頂部紫色、胚芽無色的籽粒被確定為準單倍體籽粒；胚乳頂部和胚芽均有紫色或胚乳無色、胚芽紫色的為雜合二倍體籽粒；胚乳和胚芽均無色的籽粒為花粉污染籽粒^［10］。統計準單倍體籽粒數和總雜交籽粒數。

總雜交籽粒數=準單倍體籽粒數+雜合二倍體籽粒數；

準誘導率=準單倍體籽粒數/總雜交籽粒數×100%^［1］。

1.2.3"單倍體田間鑒定、實際誘導率計數與單倍體自然加倍

將挑選出的準單倍體籽粒于2022年10月在云南景洪基地進行田間種植、鑒定和加倍。試驗采用大壟雙行，行距0.6 m，材料按順序排列，每穴播種4粒，穴距0.5 m。在苗期淘汰葉鞘為紫色、葉片寬大、株型披散和生長勢強的雜株，選留生長較慢、植株較矮、葉片直立且葉色較淺的單倍體植株^［11］。統計雜株數和單倍體株數，對準誘導率進行校正以獲得誘導系的實際誘導率并計算籽粒Navajo標記鑒定的準確率。

實際誘導率=（準單倍體籽粒數－雜合植株數）/總雜交籽粒數×100%；

標記鑒定準確率=（準單倍體籽粒數-雜合植株數）/準單倍體籽粒數×100%^［1］。

12月上旬開始對單倍體植株雌穗進行套袋，對雌穗吐絲且雄穗散粉株進行自交授粉，用剪刀剪開雄穗已散粉而雌穗未吐絲植株的雌穗包葉，使其露出花絲進行自交授粉，次年1月上旬結束授粉，2月中旬收獲，記錄授粉株數和結實株數。

授粉率=授粉株數/單倍體株數×100%；

加倍結實株率=結實株數/單倍體株數×100%^［12］。

1.3"數據處理與分析

試驗各測定性狀的描述統計量采用Excel 2016進行分析和制圖，用DPS 7.05進行二因素無重復方差分析和多重比較（LSD法）。

2"結果與分析

2.1"單倍體籽粒鑒定及田間鑒定

以4個熱帶單倍體誘導系云誘一號、云誘二號、云誘三號和云誘四號作父本，13份溫熱玉米雜交種作母本進行雜交誘導，其籽粒鑒定及田間植株鑒定結果見表2。由表2可知，52個雜交組合的總雜交籽粒數介于193～1 694粒之間，平均為872.4粒，獲得的準單倍體粒數介于8～483粒之間，平均為142.8粒，準誘導率介于3.4%～37.7%之間，變化幅度較大，平均準誘導率為16.2%。

從雜合株數及標記鑒定準確率（表2）來看，52份準單倍體材料中均含有雜合二倍體籽粒，標記鑒定準確率介于8.5%～98.4%之間，平均為69.3%，且標記鑒定準確率偏低的準單倍體材料出苗率均偏高，其中標記鑒定準確率低于50%的13份單倍體材料中的10份出苗率大于82%，而標記鑒定準確率高于90%的13份單倍體材料中的9份出苗率小于65%。表明相較于單倍體籽粒，雜交二倍體籽粒生長勢較旺盛，更容易出苗。

誘導系的準誘導率和實際誘導率的差值受籽粒Navajo標記鑒定準確率的影響，一般來說，標記鑒定準確率越低，準誘導率和實際誘導率的差值越大。將準誘導率和實際誘導率的差值及籽粒Navajo標記鑒定準確率做成組合圖（圖1），由圖1可知，52個雜交組合的實際誘導率比準誘導率降低了0.2～34.5百分點。標記鑒定準確率低于60%的14份單倍體材料平均實際誘導率比平均準誘導率降低了14.7百分點，其中10號材料的降幅最大，為34.5百分點（標記鑒定準確率最低，為8.5%）；標記鑒定準確率高于60%的38份單倍體材料平均實際誘導率比平均準誘導率降低了2.4百分點。

通過田間鑒定計數雜合植株，以此對準誘導率進行校正而獲得實際誘導率。結果（表2）顯示，52個雜交組合實際誘導率介于1.3%～20.1%之間，變化幅度較大，平均實際誘導率為10.5%。將數據分布制作成折線圖（圖2），由圖2可知，實際誘導率小于5.0%的7個雜交組合中有5個是由云誘一號誘導得到的；云誘二號誘導的13個雜交組合的實際誘導率介于5.3%～20.1%之間，其中4個組合實際誘導率大于15.0%；由云誘三號誘導的13個雜交組合中有10個組合的實際誘導率介于8%～14%之間；云誘四號的實際誘導率介于1.3%～17.8%之間。這些結果表明，云誘一號的平均實際誘導率偏低，云誘二號實際誘導率較高且更容易獲得高誘導率組合，云誘三號的誘導效果比較穩定且誘導能力強，云誘四號實際誘導率較高但變幅較大。

2.2"不同誘導系各性狀差異顯著性分析

將13個基礎材料與4個誘導系雜交所得單倍體的準誘導率、實際誘導率、標記鑒定準確率進行方差分析，結果（表3）顯示，準誘導率、實際誘導率和標記鑒定準確率在基礎材料間的差異均達顯著水平；準誘導率在誘導系間的差異不顯著，但實際誘導率和標記鑒定準確率在誘導系間的差異均達極顯著水平。表明單倍體實際誘導率和標記鑒定準確率受基礎材料和誘導系影響均較大。

對4個誘導系中差異達顯著水平的性狀按材料計算均數并作多重比較，結果（表4）表明，云誘二號的平均實際誘導率最高（12.82%），云誘四號的平均標記鑒定準確率最高（80.03%），云誘二號、云誘三號、云誘四號之間的平均實際誘導率和平均標記鑒定準確率差異都不顯著；云誘一號的平均實際誘導率（6.45%）和平均標記鑒定準確率（42.94%）都是最低的，都極顯著低于其他3個誘導系。

2.3"不同誘導系誘導單穗平均雜交總粒數和單穗平均單倍體粒數的統計分析

單穗單倍體粒數能夠直接反映誘導系的誘導能力， 其數量大小受單穗雜交總粒數的影響。 對4個誘導系誘導13份母本材料獲得單穗平均雜交總粒數和單穗平均單倍體粒數進行方差分析，結果（表5）表明，單穗平均雜交總粒數和單穗平均單倍體粒數在基礎材料間的差異均達到極顯著水平，在誘導系間的差異分別達到顯著和極顯著水平。

對單穗平均雜交總粒數和單穗平均單倍體粒數進行多重比較，結果（表6）表明，云誘二號誘導母本材料獲得的單穗平均雜交總粒數最多，為211.11粒，云誘一號和云誘三號次之，三者間差異不顯著；云誘四號誘導母本材料獲得的單穗平均雜交總粒數最少，為150.58粒，顯著低于其他3個誘導系。云誘二號誘導母本材料獲得的單穗平均單倍體粒數最多，為27.75粒，顯著高于其他3個誘導系；云誘一號誘導母本材料獲得的單穗平均單倍體粒數最少，為9.98粒，顯著低于其他3個誘導系。

2.4"14份單倍體籽粒自然加倍分析

對14份單倍體材料進行自然加倍處理（由于29號組合單倍體材料的成株數較少，所以不參與授粉率和結實株率分析），自然加倍結果見表7。由表7可知，14份單倍體材料的授粉率介于3.6%～19.6%之間，結實株率介于1.2%～10.7%之間，平均授粉率為10.2%，平均結實株率為3.8%，授粉率和結實株率的變化幅度均較大。14份單倍體材料中的7份結實株數少于授粉株數的一半，較多單倍體植株授粉后不結實，僅2份單倍體材料的加倍結實株率超過10%，說明單倍體自然加倍效率較低。云誘二號誘導產生的單倍體材料自然加倍的平均授粉率（11.72%）和平均結實株率（5.6%）是最高的，說明云誘二號誘導產生的單倍體材料自然加倍效果最好。

3"討論

3.1"誘導系與母本的互作

誘導率高低作為評價玉米單倍體誘導系誘導效果好壞的重要標準，是選育誘導系的首要考慮因素。本研究中52個雜交組合的實際誘導率介于1.3%～20.1%之間，變化幅度較大，表明誘導系與基礎材料的遺傳背景都會影響單倍體誘導率，這與前人的研究結果^［13-14］相一致。4個誘導系對13份基礎材料誘導效果不同，表明云誘系列誘導系存在各自的優勢誘導基礎材料，可根據育種基礎材料血緣選擇最優誘導系。

3.2"影響誘導率評價的因素

依據誘導率計算公式，單倍體誘導率除與果穗上單倍體的數量成正比外，還受果穗雜合籽粒數的影響。受遺傳因素影響，單倍體誘導的過程中伴隨著一定比例的敗育，且籽粒敗育率與誘導率正線性相關^［15-16］。此外，不利的環境條件也會減弱授粉效果導致結實數減少。當雌穗結實籽粒數降低到一定范圍以下時，僅用單倍體誘導率來評價誘導系，可能就無法真實反映誘導系的單倍體誘導性能，應結合單穗單倍體粒數來評估誘導系的誘導能力，而單穗獲得單倍體粒數與其結實籽粒數相關，最佳的單穗結實數在100～300粒之間^［17］。本研究中4個誘導系誘導母本材料獲得的單穗平均總雜交粒數都超過了150粒，具有較好的結實數，且云誘二號、云誘三號和云誘四號誘導母本材料獲得的單穗平均單倍體粒數均超過17粒，此外，這3個誘導系的平均實際誘導率均較高，都達11%以上，表明這3個單倍體誘導系在保證具有高誘導率的同時，亦獲得較高的單倍體產量。

3.3"熱帶玉米單倍體誘導系的選育

目前，生產上使用較多的誘導系是溫帶誘導系，將其應用到熱帶玉米種質資源中，誘導率將大幅降低。吳迅等用4份不同來源的誘導系誘導3個熱帶玉米群體，發現隨著群體中熱帶血緣的增加，誘導率也逐漸降低^［18］。為了選育出適用于熱帶種質和熱帶環境的誘導系，育種家們做了大量努力。廣西壯族自治區農業科學院的科研工作者對農大高誘1號進行改良，選育出了適應亞熱帶環境Y8誘導系（誘導率最高達到6.3%）和平均誘導率介于2.24%～4.64%之間的6個桂誘系列熱帶玉米單倍體誘導系^［19-20］。國際玉米小麥改良中心（CIMMYT）的育種家創制了誘導率達8%～10%的適合熱帶地區應用的誘導系——TAIL（tropical adapted inducer lines），極大地提高了熱帶亞熱帶地區DH育種的效率^［21］。本試驗中使用的4個新選育的云誘系列熱帶玉米誘導系誘導13個溫熱雜交種均獲得較高的誘導率，尤其云誘二號的平均實際誘導率最高（12.82%）且獲得高誘導率組合（實際誘導率gt;15%）概率最大；云誘三號誘導能力強，且受母體遺傳背景的影響最小，誘導效果比較穩定。進行DH技術育種時可以加大對誘導系云誘二號和云誘三號的利用。

3.4"Navajo標記鑒定單倍體對誘導率的影響

R-nj標記基因在胚和胚乳的表達可以幫助區分單倍體和雜合二倍體籽粒，但南方育種常使用的熱帶亞熱帶種質中往往含有花青素抑制基因C1-I，會弱化或抑制R-nj標記基因表達，使誘導所得籽粒的Navajo標記顯色較弱，依據籽粒Navajo標記篩選單倍體效率較低^［21-22］。江禹奉等用6個桂誘系列熱帶玉米誘導系誘導9個不同的熱帶玉米種質，得到的平均Navajo標記鑒定準確率為 28.16%～50.52%^［20］。本研究用4個云誘系列熱帶玉米誘導系誘導13份溫熱雜交種，得到的52份單倍體的標記鑒定準確率介于8.5%～98.4%之間，實際誘導率比準誘導率降低了0.2～34.5百分點，可能是由于基礎材料所含熱帶血緣的比例不同導致 R-nj 基因表達顯色強度不同，進而影響肉眼篩選單倍體的準確率。其中有12個雜交組合的標記鑒定準確率低于40%，可能是由于誘導籽粒胚標記顯色弱，導致準單倍體大量誤選。由于Navajo顏色標記在不同種質資源中的表達強度差異大，可以通過引入額外的標記性狀對4個云誘系列熱帶玉米單倍體誘導系進行改良，提高其單倍體鑒定的準確性和可靠性。

3.5"單倍體的自然加倍

單倍體經過染色體加倍獲得的DH系是直接用于育種的材料，因此單倍體加倍頻率直接影響到DH育種的效率。大多數育種材料自然加倍率僅為0～10%^［10］。本研究中進行自然加倍處理的14份單倍體材料結實株率介于1.2%～10.7%之間，變異幅度大，說明父母本遺傳背景對單倍體加倍頻率有較大影響，與前人研究結果^［1，13］相一致。14份材料的平均授粉率為10.2%，平均結實株率為3.8%，平均結實株率較平均授粉率大幅降低，可能是受到花期不遇以及栽培地氣候環境條件的影響，導致自交結實較差等問題。而云誘二號誘導產生的單倍體材料自然加倍的平均授粉率（11.72%）和平均結實株率（5.6%）是4個誘導系中最高的，說明由云誘二號誘導得到的單倍體自然加倍效果表現突出，可以加大對其的利用。

除通過單倍體加倍獲得DH系作為育種材料外，誘導系在誘導產生單倍體的同時，也會產生一部分早期加倍單倍體，即EH系（early doubled haploid or embryo double haploid，簡稱EH）^［23-24］。相較于DH系，EH系株型高大，花粉量大且全部可育，授粉結實正常，利用其選育新品種時可省略DH系擴繁環節，直接進入測配階段，獲得優良品種的概率也隨之增加^［25］。雖然EH現象廣泛存在，但發生概率不到4%，很難滿足規模化育種需求^［25］。如果能對4個誘導系進行進一步改良，選育出能高頻生產EH系的誘導系，利用前景將非常廣闊。

4"結論

本研究用13份溫熱雜交種作母本對4個云誘系列熱帶玉米單倍體誘導系的誘導能力進行測驗鑒定，發現云誘二號、云誘三號和云誘四號的平均實際誘導率（gt;11%）、單穗平均單倍體粒數（gt;17粒）和平均標記鑒定準確率（gt;75%）都顯著高于云誘一號，其中云誘二號誘導產生的單穗平均單倍體粒數最多，平均實際誘導率最高，產生高誘導率組合（實際誘導率gt;15%）的概率最大，云誘三號的誘導能力強且誘導效果較穩定，有良好的應用前景。在景洪冬季田間種植條件下，對誘導率較高的云誘二號、云誘三號和云誘四號誘導產生的14份單倍體材料進行自然加倍效果測驗，發現云誘二號誘導產生的單倍體材料自然加倍效果最好。此外云誘二號和云誘三號具有花期長、花粉量大、抗逆性強的特點，是優異的熱帶誘導系。4個誘導系的誘導和加倍能力還需要進一步在不同環境下和更多的基因型中進行驗證分析，充分挖掘4個誘導系各自的最優誘導基礎材料，根據育種基礎材料血緣選擇最適誘導系，實現高效育種。

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