鏈格孢菌粗毒素對煙草抗病相關(guān)生理指標(biāo)的影響

摘要：赤星病是發(fā)病較為嚴(yán)重的煙草病害之一，其主要病原菌為鏈格孢菌（Alternaria alternata）。鏈格孢菌產(chǎn)生的毒素是引發(fā)鏈格孢菌侵染煙草的重要因子之一，為探討不同抗性煙草品種抗病相關(guān)生理指標(biāo)對鏈格孢菌粗毒素脅迫的響應(yīng)，以易感煙草品種NC82和抗病煙草品種凈葉黃（JYH）為試驗(yàn)材料，研究鏈格孢菌粗毒素處理對煙葉葉綠素含量、細(xì)胞膜透性、丙二醛（MDA）含量、幾丁質(zhì)酶活性、β-1，3-葡聚糖酶活性、超氧陰離子自由基（O^-2·）含量和過氧化氫（H2O2）含量的影響。結(jié)果表明，經(jīng)鏈格孢菌粗毒素處理96 h后，易感品種NC82的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量較對照分別顯著降低38.8%、43.8%、28.9%，細(xì)胞膜透性和MDA含量分別顯著升高92.5%、44.8%，幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性分別顯著升高33.6%、47.7%，H2O2和O^-2·含量分別顯著升高67.6%和14.3%；抗病品種JYH的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量較對照分別顯著降低35.2%、41.7%、36.4%，細(xì)胞膜透性升高14.8%，MDA含量降低6.4%，幾丁質(zhì)酶活性顯著增加42.2%，β-1，3-葡聚糖酶活性增加26.3%，H2O2和O^-2·含量分別升高58.3%、10.9%。結(jié)果顯示，鏈格孢菌毒素既是對植物造成傷害的直接因素，也是誘導(dǎo)防御反應(yīng)和信號分子的誘導(dǎo)子；凈葉黃抗病能力高于NC82與其抗病生理機(jī)制關(guān)系密切。研究結(jié)果可為進(jìn)一步探索鏈格孢菌毒素在煙草赤星病致病機(jī)理中的作用提供參考。

關(guān)鍵詞：鏈格孢菌；粗毒素；煙草；生理指標(biāo)；抗病性

中圖分類號：S435.72""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）01-0176-06

植物與病原體相互作用期間，分生孢子萌發(fā)形成菌絲或附著孢直接穿透植物表皮進(jìn)行定殖，病原體分泌大量寄主特異性毒素（HST）和非寄主特異性毒素（nHST）以殺死細(xì)胞，引起植物壞死病變和細(xì)胞程序性死亡^［1］。死體營養(yǎng)型病原微生物分泌一系列次生代謝物（毒素和效應(yīng)物）、細(xì)胞壁降解酶及其他蛋白質(zhì)致使植物組織壞死，直接從死亡細(xì)胞和組織中汲取營養(yǎng)，進(jìn)一步增殖并完成其生命周期^［2］。例如由鏈格孢草莓病原型［Alternaria alternata f. sp. Fragariae （Strawberry pathotype）］引起草莓黑斑病、鏈格孢柑橘病原型［A. alternata f. sp. Citri （tangerine pathotype）］引起柑橘褐斑病和由鏈格孢蘋果致病型［A. alternata f. sp. mali （Apple pathotype）］引起蘋果葉斑病等^［3-4］。病原菌毒素可導(dǎo)致植物發(fā)生葉片黃化、壞死或萎蔫，植物則可以通過激活不同的防御機(jī)制來抑制病原菌的生長^［5］。誘導(dǎo)子與植物細(xì)胞質(zhì)膜之間的相互作用可以誘導(dǎo)編碼參與合成植物抗毒素蛋白質(zhì)的mRNA的轉(zhuǎn)錄^［6］。

鏈格孢菌［A. alternata （Fries） Keissler］屬于半知菌亞門（Deuteromyccotina）絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Hyphomycetales）暗色菌科鏈格孢屬（Alternaria），是一種常見的無性態(tài)屬真菌^［7-8］。煙草赤星病由鏈格孢菌引起，是危害我國優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的主要真菌性病害之一，造成葉片殘破不全、內(nèi)在化學(xué)成分不協(xié)調(diào)、煙葉品質(zhì)差、利用價(jià)值降低，制約著我國煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展^［9-10］。

鏈格孢菌可以產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，統(tǒng)稱為鏈格孢菌毒素。目前，已知鏈格孢菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物超過70種^{［3，11-13］}。鏈格菌產(chǎn)生多種非寄主特異性毒素（nHST）和寄主特異性毒素（HST），其中：非寄主特異性毒素如交鏈孢酚（alternariol，AOH）、騰毒素（tentoxin，TEN）、交鏈孢霉烯（altenuene，ALT）、交鏈孢毒素-Ⅰ、交鏈孢毒素-Ⅱ、交鏈孢毒素-Ⅲ和細(xì)交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）^［14］；寄主特異性毒素如AK-毒素、AF-毒素、AC-毒素和AT-毒素^［15-18］。鏈格孢菌毒素對植物具有破壞性作用，作用于植物細(xì)胞的葉綠體、線粒體、質(zhì)膜蛋白和某些特定的酶，引起DNA斷裂、細(xì)胞毒性、通過線粒體氧化磷酸化干擾植物生理以及影響膜透性^［19］。其中植物在受到生物或非生物脅迫后，細(xì)胞膜會(huì)受到不同程度的損傷；丙二醛（MDA）作為膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量變化作為膜系統(tǒng)受損程度的指標(biāo)^［20］。在病原體脅迫下，植物細(xì)胞組織中發(fā)生活性氧（ROS）積累，ROS可能作為有利于植物抗病性的信號分子^［21-22］。然而，過量的ROS積累可能會(huì)對植物產(chǎn)生有害影響，導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)的氧化，并導(dǎo)致膜脂過氧化^［23］。真菌的細(xì)胞壁組份主要是幾丁質(zhì)和葡聚糖，而植物體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶能夠通過分解二者來保護(hù)自身^［24］。毒素作為鏈格孢菌的代謝產(chǎn)物，是鏈格孢菌侵染寄主的重要效應(yīng)子，且部分毒素具有寄主特異性，存在諸多不明之處。本文通過研究鏈格孢菌粗毒素對煙草赤星病抗病品種凈葉黃（JYH）和易感品種NC82抗病相關(guān)生理指標(biāo)的影響，為探索鏈格孢菌在侵染引起煙草赤星病的致病機(jī)理中的作用提供參考。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)材料

1.1.1"供試品種

赤星病易感煙草品種NC82由貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，抗病煙草品種凈葉黃（JYH）由中國煙草總公司青州煙草研究所提供。將供試品種NC82、JYH種子播種到裝有煙草專用育苗基質(zhì)的12孔托盤中，于25 ℃、16 h光照/8 h 黑暗條件下培養(yǎng)，待長到5葉1心時(shí)開始處理。

1.1.2"供試菌株

鏈格孢菌菌株由貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2"鏈格孢菌粗毒素的制備

將供試菌株在超凈工作臺(tái)接種于PDA固體培養(yǎng)基上，在25 ℃下培養(yǎng)1周，然后用打孔器取菌絲體邊緣直徑5 mm大小菌餅5塊，接種在已滅菌的350 mL PD液體培養(yǎng)基中，在25 ℃黑暗條件下，于150 r/min搖床上培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)液用4層已滅菌的紗布過濾，除去菌絲和孢子，收集濾液，在 6 000 r/min 下離心30 min，吸取上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中溫度為50 ℃蒸發(fā)至干，用10 mL無菌水溶解，得到粗毒素將其保存于4 ℃冰箱備用^［25］。

1.3"處理方法

試驗(yàn)于2023年7月在貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（26.45°N，106.66°E）進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)置CK（無菌水）+NC82、T（粗毒素）+NC82、CK+JYH、T+JYH 4個(gè)處理。取5葉1心煙苗從下至上第3、4葉，將5 μL粗毒素或無菌水均勻滴加到葉片下表面主脈兩側(cè)，每張葉10滴，每個(gè)處理10張葉，重復(fù)3次。將煙葉下表面向上放置在墊有2張濕潤濾紙的方形培養(yǎng)盒中，于溫度25 ℃、相對濕度90%、光照16 h/黑暗8 h下培養(yǎng)。處理前取樣記為0 h，分別于處理后24、48、96 h取樣。每次取樣后將樣品放入液氮冷凍，立即保存于-80 ℃冰箱，待取樣全部完成后，用于測定生理指標(biāo)。

1.4"生理指標(biāo)的測定方法

采用95%乙醇提取法^［26-27］測定葉綠素含量，參照高俊鳳等的方法^［28-29］測定細(xì)胞膜透性，參照張志良等的方法^［30］測定丙二醛含量，采用DNS法^［31］測定幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性，采用碘化鉀法^［32］測定過氧化氫含量，參照高俊鳳等的方法^{［28，33］}測定超氧陰離子自由基含量。

1.5"數(shù)據(jù)分析

用Excel 2019、SPSS 26.0和Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，采用Duncan，s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2"結(jié)果與分析

2.1"鏈格孢菌粗毒素對不同抗性煙草品種葉綠素含量的影響

由圖1可見，經(jīng)鏈格孢粗菌毒素處理后與對照（CK）相比，在24 h時(shí)，易感品種NC82葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量沒有顯著差異；抗病品種JYH的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著低于CK。48 h時(shí)，易感品種NC82葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量有顯著差異；抗病品種JYH的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量沒有顯著差異。在96 h時(shí)，鏈格孢菌粗毒素處理2個(gè)品種葉綠素含量差異均顯著低于對照，易感品種NC82葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量比對照分別降低38.8%、43.8%、28.9%，而抗病品種JYH的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量比對照分別降低35.2%、41.7%、36.4%。

2.2"鏈格孢菌粗毒素對不同抗性煙草品種細(xì)胞膜透性的影響

由圖2可見，易感品種NC82經(jīng)鏈格孢粗菌毒素處理，與CK相比，葉片細(xì)胞膜透性呈上升的趨勢，在24～96 h，分別顯著高于對照103.9%、101.4%和92.5%；抗病品種JYH葉片的細(xì)胞膜透性呈先升高后下降的趨勢，在24、48 h時(shí)分別顯著高于對照98.1%、62.5%，96 h時(shí)則與對照差異不顯著。綜上所述，在24、48 h時(shí)，鏈格孢菌處理2個(gè)品種相對膜透性顯著高于對照，但品種間的相對電導(dǎo)率差異不顯著；在96 h，易感品種NC82細(xì)胞膜透性顯著高于抗病品種JYH。

2.3"鏈格孢菌粗毒素對不同抗性煙草品種丙二醛含量的影響

由圖3可知，與CK相比，易感品種NC82經(jīng)鏈格孢菌粗毒素處理的葉片丙二醛含量變化呈先下降后上升再下降的趨勢，在48、96 h時(shí)，易感品種NC82 MDA含量顯著高于CK，其含量分別比對照高57.4%和44.8%；抗病品種JYH葉片MDA含量呈先下降后上升再下降的趨勢，與CK相比差異不顯著。 鏈格孢菌毒素處理后，在前48 h，2個(gè)品種MDA含量差異不顯著； 在96 h時(shí)， 易感品種NC82 MDA含量顯著高于抗病品種JYH。

2.4"鏈格孢菌粗毒素對不同抗性煙草品種幾丁質(zhì)酶活性的影響

由圖4可知，與CK相比，經(jīng)鏈格孢菌粗毒素處理后，易感品種NC82葉片幾丁質(zhì)酶活性變化呈先上升后下降的趨勢，抗病品種JYH葉片幾丁質(zhì)酶活性變化呈逐漸上升的趨勢，在24、48、96 h，易感品種NC82幾丁質(zhì)酶活性顯著高于對照，其活性比對照分別高78.2%、29.9%和33.6%；抗病品種JYH幾丁質(zhì)酶活性在48、96 h時(shí)顯著高于對照，其活性比對照分別高49.7%和42.2%。綜上所述，鏈格孢菌粗毒素處理后易感品種NC82幾丁質(zhì)酶活性顯著高于抗病品種JYH。

2.5"鏈格孢菌粗毒素對不同抗性煙草品種β-1，3-葡聚糖酶活性的影響

由圖5可知，與CK相比易感品種NC82和抗病品種JYH經(jīng)鏈格孢菌粗毒素處理，葉片的β-1，3-葡聚糖酶活性變化均呈先升高后下降的趨勢，在24、48、96 h，易感品種NC82的β-1，3-葡聚糖酶活性分別比對照顯著高22.8%、42.1%和47.7%；在48 h，抗病品種JYH的幾丁質(zhì)酶活性比對照顯著高41.7%。綜上所述， 在24 h， 鏈格孢菌粗毒素處理后易感品種NC82的β-1，3-葡聚糖酶活性顯著高于抗病品種JYH，在48、96 h時(shí)，易感品種NC82和抗病品種JYH的β-1，3-葡聚糖酶活差異不顯著。

2.6"鏈格孢菌粗毒素對不同抗性煙草品種過氧化氫含量的影響

由圖6可知，與CK相比，易感品種NC82經(jīng)鏈格孢菌粗毒素處理后葉片的H2O2含量變化呈上升的趨勢，在48、96 h，易感品種NC82葉片的H2O2含量分別比CK顯著高140.9%和67.6%；抗病品種JYH葉片的H2O2含量與CK相比差異不顯著。在48、96 h，鏈格孢菌粗毒素處理后易感品種NC82 葉片的H2O2含量顯著高于抗病品種JYH。

2.7"鏈格孢菌粗毒素對不同抗性煙草品種超氧陰離子自由基含量的影響

由圖7可知，與CK相比，易感品種NC82經(jīng)鏈格孢菌粗毒素處理后葉片超氧陰離子自由基（O^-2·）含量呈先上升后下降的變化趨勢，在48、96 h，易感品種NC82 O^-2·含量分別比CK顯著高10.6%和14.3%；抗病品種JYH的超氧陰離子自由基（O^-2·）含量與CK相比差異不顯著。

3"討論

鏈格孢菌是一類分布十分廣泛的死體營養(yǎng)型真菌，存在于土壤、各種植物和腐爛的植物碎片中，在腐生到內(nèi)生生命周期的各種重要經(jīng)濟(jì)作物上發(fā)生病害，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失^［34］。病原體侵染植物后，其體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的生理代謝，如活性氧（ROS）、抗氧化酶、葉綠素和抗病蛋白等的含量或活性發(fā)生改變，這些變化與植物抗病性密切相關(guān)^［35］。王育鵬等研究認(rèn)為，植物出現(xiàn)病害癥狀的最敏感部位是光合器官，在病原菌毒素的不斷傷害下會(huì)降低光合作用，光合色素下降，膜脂過氧化作用加劇，能量固定及物質(zhì)合成都將受到不同程度的影響^［36］。在病原體入侵下，大量植物葉綠素含量下降，導(dǎo)致葉片褪綠和抑制光合作用^［37］。本研究中，鏈格孢菌粗毒素處理后，易感品種NC82和抗病品種JYH葉片中的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均表現(xiàn)下降，而易感品種NC82的下降幅度較高。這一結(jié)果與邢會(huì)琴的研究結(jié)果^［38］基本一致。

姚曉華等研究表明，病原微生物侵染引發(fā)植物膜脂過氧化，膜結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外滲^［39-41］。萬佐璽等研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢菌產(chǎn)生的致病毒素能引起紫莖澤蘭離體葉片細(xì)胞膜透性上升，說明致病毒素引起細(xì)胞膜的傷害，造成膜功能的紊亂^［42］。楊雪等用不同抗性青稞品種接種條紋病后，發(fā)現(xiàn)不同抗性品種相對電導(dǎo)率均顯著增加，感病品種Z1141的增加幅度高于抗病品種昆侖14號^{［41，43］}。本研究結(jié)果表明，鏈格孢菌粗毒素處理可使易感品種NC82和抗病品種JYH葉片相對膜透性顯著增加?？共∑贩NJYH增加幅度顯著低于易感品種NC82，說明易感品種NC82的細(xì)胞膜功能受到嚴(yán)重?fù)p傷；而抗病品種JYH能及時(shí)作出應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)細(xì)胞膜損傷程度輕，說明抗病品種能有效減少細(xì)胞液的滲透，這一結(jié)果與楊雪等的研究結(jié)果^［43］基本一致。有關(guān)植物抗性的研究發(fā)現(xiàn)，病原體侵染誘導(dǎo)膜脂損傷，MDA通常作為膜脂過氧化的指標(biāo)，可以直接反映細(xì)胞膜損傷程度和植物抗逆性^［44-45］。在本研究中，經(jīng)鏈格孢菌粗毒素處理后，抗病品種JYH 中的MDA含量低于易感品種NC82，說明其膜系統(tǒng)受傷害程度低于易感品種NC82。

許多真菌細(xì)胞壁的主要成分為幾丁質(zhì)和葡聚糖^［46］，而植物體內(nèi)幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶能夠降解病原菌細(xì)胞壁，抵抗真菌的侵染和抑制病原菌的生長^［47］。因此，這2種酶的活性提高是植物抗病性增強(qiáng)的體現(xiàn)^［48-49］。胡浩等用灰霉病病原菌接種不同品種亞洲百合后發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性增強(qiáng)，在染病前期感病品種Pearl Melanie高于抗病品種Pearl Melanie^［50］。本研究中，在鏈格孢菌粗毒素處理后易感品種NC82葉片幾丁質(zhì)酶活性變化呈先上升后下降的趨勢，抗病品種JYH葉片幾丁質(zhì)酶活性變化呈上升的趨勢；不同抗性煙草品種葉片的β-1，3-葡聚糖酶活性均呈先升高后下降趨勢；易感品種NC82的幾丁質(zhì)酶和 β-1，3-葡聚糖酶活性均高于抗病品種JYH，這可能是由于粗毒素脅迫前期易感品種NC82受傷害程度高于抗病品種JYH。48 h后，抗病品種JYH酶活性也迅速升高，說明鏈格孢菌入侵后釋放毒素可以刺激植物產(chǎn)生抗病防衛(wèi)反應(yīng)。

有研究表明，ROS發(fā)生是植物在病原體侵染后的常見反應(yīng)，參與抗性相關(guān)基因上調(diào)或與其他信號分子相互作用參與植物抗病過程^［51］，可能有利于植物誘導(dǎo)抗病性，但是，ROS的積累已被證明可以促進(jìn)死體營養(yǎng)型病原體引起的感染過程。H2O2和O^-2·含量的增加可以提高過表達(dá)GhMPK11的煙草對青枯雷爾氏菌和立枯絲核菌侵染的敏感性^［52］。本研究中，在鏈格孢菌粗毒素處理后，易感品種NC82和抗病品種JYH的H2O2和O^-2·含量均增加，但易感品種NC82的 H2O2和O^-2·含量高于抗病品種JYH，說明在鏈格孢菌粗毒素脅迫下NC82中ROS積累較多，這種結(jié)果的發(fā)生有可能是因?yàn)槎舅卮碳ぶ参锛?xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)來抵抗病原體的入侵；造成的ROS累積不僅會(huì)對病原體造成傷害，同時(shí)也會(huì)對植物細(xì)胞本身造成傷害，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，更有利于病原體侵染。

4"結(jié)論

在鏈格孢菌粗毒素處理后，煙草葉片葉綠素含量下降，細(xì)胞膜透性和MDA含量、幾丁質(zhì)酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性、H2O2含量和O^-2·含量上升，表明毒素既是對植物產(chǎn)生傷害的直接因素，也是誘導(dǎo)防御反應(yīng)和信號分子的誘導(dǎo)子。粗毒素處理后，易感品種NC82各項(xiàng)生理指標(biāo)變化幅度均大于抗病品種JYH，說明不同抗病能力的煙草品種在生理機(jī)制上存在一定差異，凈葉黃受傷害程度遠(yuǎn)低于NC82。在生理響應(yīng)過程中，細(xì)胞膜透性和MDA含量、幾丁質(zhì)酶活性和β-1，3-葡聚糖酶活性、H2O2含量和O^-2·含量可作為煙草抗病相關(guān)生理指標(biāo)。

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