鹽脅迫對不同品種水稻根際土壤細菌多樣性與結構的影響

摘 要：鹽分是制約沿海灘涂鹽漬化土地利用的主要因素之一，水稻（Oryza sativa L.）是鹽漬化土地利用的首選糧食作物，而某些根際微生物可以提高水稻的抗鹽能力。本研究選取不同品種水稻在NaCl 脅迫下進行全生育期培育，采用Illumina Miseq 測序技術，測定并分析不同品種水稻根際土壤細菌群落多樣性和結構，旨在篩選適宜鹽漬化土地種植的水稻品種。結果表明：就根際土壤細菌群落多樣性而言，0.6% NaCl 處理下，B3 和B6 品種的物種豐富度顯著高于B1品種。根際土壤細菌群落結構方面，不同濃度NaCl 處理下，B1、B3 和B6 品種的相對豐度大于10%的優勢細菌門均為綠彎菌門（Chloroflexi）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteriota）；不同品種水稻根際土壤細菌群落結構存在差異，富集的物種數量和種類也不同，0.6% NaCl 處理下B6 品種富集了14 個細菌類群分支，如酸桿菌門（Acidobacteriae）、念珠藻科（Nostocaceae）、Vicinamibacterales、熱微菌目（Thermomicrobiales）、KD4-96 等。因此，沿海灘涂鹽漬化土地種植B6 品種水稻有利于根際土壤優勢細菌群落的形成。

關鍵詞：水稻；鹽脅迫；根際土壤；細菌群落；16S rRNA

中圖分類號：S511；S154.3 文獻標志碼：A

土壤鹽漬化對全球農業生產是一個嚴重的威脅。中國沿海地區同樣受到土壤鹽漬化的困擾，是鹽漬土的主要集中分布區之一[1]。海南島位于中國熱帶沿海，臺風頻繁，海水倒灌現象時有發生。2014 年“威馬遜”超強臺風在海南省文昌市沿海登陸，海水倒灌造成沿海土壤大面積鹽漬化，海水倒灌后0～5 cm 土層平均含鹽量高達9.63 g/kg，20～40 cm 土層平均含鹽量為4.36 g/kg[2]。2024 年海南島再次遭受超強臺風“摩羯”的危害。海水倒灌后土壤中鹽分積累會抑制農作物根系的正常水分吸收功能，阻礙農作物生長發育，進而影響產量；高鹽度海水直接損害農作物根系，使農作物難以有效吸收水分和養分，植物體內的物質運輸功能受阻，從而導致農作物出現枯萎甚至死亡。海水倒灌后的農田在幾年甚至若干年內無法種植常規農作物，大量農田被迫棄耕。水稻是世界上種植最廣泛的糧食作物之一，也是鹽漬化土地開發利用的首選糧食作物[3]，但水稻屬鹽敏感植物，土壤鹽分影響水稻的生長發育和產量[4]。因此，針對鹽漬化土壤條件篩選適應性更強的水稻品種和鹽漬化土地改良途徑是當今農業生產發展中急需解決的問題。

研究表明，根際微生物對作物生長發育、產量和逆境適應性等具有至關重要的作用[5-7]。作物根際微生物群落多樣性和結構組成不僅受土壤鹽分等環境條件的影響[8]，還受作物基因型的影響[9]。細菌是根際微生物的主要組成部分，通過產生植物激素和抗生素等物質，參與物質循環，與植物形成共生關系等方式，增強植物的生長發育和產量[10]。某些細菌能有效減輕鹽脅迫對作物的不利影響，提高作物抗鹽性[11-12]。通過添加耐鹽微生物菌劑可改善微生物環境，提高養分利用率，有效提高作物耐鹽能力[13]。已有關于水稻根際微生物的研究得出，鹽脅迫下，根際細菌類群可能作為關鍵類群參與水稻鹽脅迫[14]。水稻根際微生物中部分細菌能夠顯著促進水稻的生長發育[15]。利用微生物可以改善水稻在鹽脅迫下的生長發育，達到利用鹽漬化土地的目的[16]。但只有通過深入了解水稻在含鹽土壤與正常土壤，以及不同品種水稻的土壤微生物多樣性、種類和群落結構的差異，才能正確判斷微生物的生態功能，使其在提高水稻耐鹽能力中更好地發揮作用。因此，鑒于水稻豐富的遺傳多樣性，不同品種間的耐鹽性存在差異，其根際微生物也可能存在差異。本研究采用Illumina Miseq 測序技術，測定并分析不同品種水稻根際土壤細菌群落的多樣性和結構差異，旨在篩選適宜沿海灘涂鹽漬化土地種植的水稻品種，為利用微生物改良鹽漬化土地提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種：自育品種熱鹽2 號（B1）、從江蘇引種的鹽秈156（B3）和從國際水稻研究所引種的ST002（B6）。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

試驗于 2023 年8 月至11 月在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所儋州水稻試驗基地的防雨大棚進行。根據文獻，耐鹽水稻指在鹽濃度為0.3%以上鹽地生長的水稻品種[17]。海南沿海灘涂地區經臺風海水倒灌后0～20 cm 土層鹽分含量均值為0.5%以上[2]。因此，本研究以自然風干的水稻田土壤為基土，設置對照（CK，基土+淡水）、0.3% NaCl （基土+0.3% NaCl溶液）和0.6% NaCl（基土+0.6% NaCl 溶液）3個處理。供試材料于育苗盤中播種培育至四葉一心期時移栽到種植框（76 cm×56 cm），每框種植16 穴苗。每個處理每個品種設置3 次重復，試驗共種植27 框，432 穴苗。鹽脅迫試驗期間用鹽度計監測鹽分濃度并適時添加NaCl 溶液或淡水，種植框內保持2 cm 左右水層，以保證整個生育期鹽溶液濃度保持相對穩定。

1.2.2 土樣采集

于 2023 年11 月水稻成熟時采集土壤。挖取整株水稻，保持根系完好，抖掉大塊土壤，用無菌毛刷收集與根表面緊密粘附約2 mm 的根際土壤。每個種植框隨機采集3 株水稻根際土壤為1 次重復，共采集27 份土壤樣品。土樣置于干冰內帶回實驗室，置于?80 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3 DNA 提取和PCR 擴增

根據 MJ-soil 土壤DNA 提取試劑盒（Soil DNA Extraction Kit，中國逾華公司）說明書進行根際土壤細菌總基因組DNA 抽提。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 的質量， 使用NanoDrop 2000（ ThermoScientific，美國）測定DNA 濃度和純度。

以 提 取的DNA 為模板， 使用引物338F（5?ACTCCTACGGGAGGCAGCAG?3）和806R（5?GGACTACHVGGGTWTCTAAT?3）對16SrRNA 基因進行PCR 擴增。PCR 擴增采用Trans-Gen AP221-02 ： TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL 反應體系：4 μL 5×FastPfu Buffer緩沖液；2 μL 2.5 mmol/L dNTPs；0.8 μL 上游引物（5 μmol/L）；0.8 μL 下游引物（5 μmol/L）；0.4 μL FastPfu 聚合酶；10 ng 模板DNA；0.2 μLBSA。利用ddH2O 補足至20 μL。PCR 反應參數：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸45 s，27 個循環，然后72 ℃穩定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存（PCR 儀：ABIGeneAmp? 9700 型）。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物，利用DNA 凝膠回收純化試劑盒（PCRClean-Up Kit，中國逾華公司）進行回收產物純化，并使用Qubit 4.0（Thermo Fisher Scientific， USA）對回收產物進行檢測定量。

1.2.4 文庫構建與測序

使用 TruSeqTM DNASample Prep Kit 對純化后的PCR 產物進行建庫。（1）通過PCR 將Illumina 接頭序列添加至目標區域外端；（2）使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產物；（3）利用Tris-HCl 緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；（4）利用氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA 片段，然后利用Illumina PE300 平臺進行測序。

1.2.5 生物信息分析

將 Illumina 測序得到的PEreads 根據overlap 關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾。利用Uparse（v 7.0.1090）軟件將優化后的序列聚類為操作分類單元（OTUs），序列相似度為97%，并對所有樣本的葉綠體序列進行剔除即得到優質序列。

選取OTU 最豐富的序列作為代表性序列。根據稀釋曲線判斷測序數據是否足夠和合理。采用RDP Classifier（v 2.2）軟件與Silva 16S rRNA 基因數據庫（v138）進行比對，對相似度97%的OTU代表序列進行分類學分析，統計各樣本的群落物種組成。使用R 軟件（v3.3.1）繪制組間OTU 的Venn 圖。利用Mothur（v3.3.1）軟件計算Alpha多樣性指數（Chao 和Shannon）[18]。利用R 語言（v 3.3.1）獲得門和屬分類水平的優勢物種組成Bar 圖和Heatmap 圖。采用Kruskal-Wallis 秩方法檢驗組間多樣性指數和物種組成差異，并采用多級物種差異判別分析（linear discriminant analysiseffect size， LEfSe）進行多層級物種差異檢驗[19]。

2 結果與分析

2.1 根際土壤細菌群落多樣性

由根際土壤細菌的香農稀釋曲線（圖1A）和覆蓋度稀釋曲線（圖1B）可以看出，測序數據合理，數據量足夠大，可以反映樣本中絕大多數的細菌多樣性信息。

Alpha 多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性，其中Chao 指數用來反映群落豐富度，Shannon 指數反映群落多樣性。由圖2 和圖3 可知，CK 和0.3% NaCl 處理中，B1、B3 和B6 水稻的根際土壤細菌群落Chao 指數和Shannon 指數均無顯著差異；0.6% NaCl 處理的B3 和B6 水稻的根際土壤細菌群落Chao 指數顯著高于B1 品種。說明0.6% NaCl 高鹽脅迫降低了B1 品種水稻的根際土壤細菌豐富度。

2.2 根際土壤細菌群落結構

2.2.1 OTU 分析

通過篩選相似性在97%以上的序列，在供試品種水稻根際土壤中共獲得15242 個OTUs。B1、B3 和B6 品種分別有10 086、11 073 和10 349 個OTUs，共有6497 個OTUs，占總OTUs 的42.63%。B1、B3 和B6 品種獨有的OTUs 分別有1741、2194 和1538 個，分別占總OTUs 的11.42%、14.39%和10.09%。說明B1、B3 和B6 品種水稻根際土壤細菌群落既有相似性，也存在一定差異（圖4）。

2.2.2 門分類水平

獲得的基因序列分為60 門、187 綱、460 目、765 科、1493 屬、3192 種。門分類水平上，CK、0.3% NaCl 和0.6% NaCl 處理中，3 個水稻品種根際土壤中細菌群落相對豐度大于1%的優勢細菌門共有12 個，分別為綠彎菌門（Chloroflexi）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、藍菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫桿菌門（ Desulfobacterota ） 、黏菌門（Myxococcota）、髕骨細菌門（Patescibacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota ） 和螺旋體門（Spirochaetota）。其中綠彎菌門、變形菌門和放線菌門相對豐度均大于10%。0.3% NaCl 和0.6%NaCl 處理中，3 個水稻品種根際土壤的浮霉菌門（Planctomycetota）相對豐度均大于1%（圖5）。

2.2.3 屬分類水平

屬分類水平上，CK、0.3%NaCl 和0.6% NaCl 處理中，B1、B3 和B6 水稻品種根際土壤中相對豐度大于2%的優勢細菌屬分別有7、12 和13 個。其中共有優勢細菌屬有5 個，為norank_f__Anaerolineaceae、norank_f__norank_o__SBR1031、norank_f__norank_o__SJA-15、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）和Anaerolinea（圖6）。

2.2.4 物種結構差異分析

門分類水平（相對豐度前20）的聚類分析表明，3 個品種水稻分為兩大類，其中B3 和B6 品種聚集為一類，而B1 品種則單獨聚集為一類（圖7）。說明B3 和B6 品種水稻根際土壤細菌群落結構組成具有相似性，且二者與B1 品種差異性較大。

通過門分類水平組間物種差異分析，根據P值（Plt;0.05）排序取豐度前10 的細菌門得出：CK處理，B3 品種的Entotheonellaeota 門相對豐度極顯著高于B1 和B6 品種；硝化刺菌門（Nitrospinota）和Firestonebacteria 門只存在于B3 品種，B1 和B6 品種中均未發現。0.3% NaCl 處理，暖發菌門（Calditrichota）只存在于B6 品種，B1 和B3 品種中均未發現。0.6% NaCl 處理，WOR-1 門只存在于B3 品種，B1 和B6 品種中均未發現；B3 品種的CK-2C2-2 門豐度顯著高于B6 品種；3個品種的酸桿菌門（Acidobacteriota）豐度差異顯著，依次為B6（8.16%）、B3（5.11%）和B1（2.52%）；B6 品種的芽單胞菌門（Gemmatimonadota）豐度極顯著高于B1 品種（圖8）。

發育樹狀圖直觀反映了不同鹽脅迫處理下不同品種水稻根際土壤細菌群落組成從門到屬水平的差異物種，發現具有顯著優勢的主要細菌類群（Plt;0.05， LDA scoregt;3.5）。CK 處理中，B3 品種富集了Subgroup_7（從綱到屬）細菌類群，B6 品種富集了擬桿菌目（Bacteroidales）細菌類群。0.3% NaCl 處理中，B6 品種富集了SJA-15（從目到屬）和Nostoc_PCC-7524 屬細菌類群。0.6% NaCl 處理中，B3 品種富集了甲基單胞菌屬（Methylomonas）細菌類群，B6 品種富集了14 個細菌類群分支， 分別為酸桿菌門（Acidobacteriae）、Vicinamibacterales（從門到屬）、念珠藻科（Nostocaceae）、熱微菌目（Thermomicrobiales）、Roseiflexaceae 屬、KD4-96（從綱到屬）、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae，從門到科）、拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae）微枝形桿菌屬（Microvirga）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、紅桿菌目紅色桿菌科（Solirubrobacteraceae，從目到科）、Streptomyces（從目到屬）、C0119（從綱到屬）、鞘鞍醇單胞菌屬（Sphingomonas）和TK10（從綱到屬）（圖9）。

3 討論

3.1 鹽脅迫對不同品種水稻根際土壤細菌群落多樣性的影響

已有研究表明，鹽脅迫降低了根際土壤細菌群落的豐富度[20]。本研究中3 個品種水稻在CK和0.3% NaCl 處理中的根際土壤細菌群落多樣性指數均無顯著差異，但0.6% NaCl 處理中，B3 和B6 品種水稻的根際土壤細菌群落Chao 指數顯著高于B1。說明無鹽脅迫或低鹽脅迫對不同品種水稻的根際土壤細菌群落豐富度和多樣性影響不明顯；但0.6% NaCl 高鹽脅迫下，不同品種水稻根際土壤細菌對鹽脅迫的響應存在差異，鹽脅迫可能導致某些品種水稻根際土壤細菌群落豐富度下降。

3.2 鹽脅迫對不同品種水稻根際土壤細菌群落結構的影響

門水平上，不同濃度鹽脅迫下3 個品種水稻根際土壤細菌群落優勢門基本相同，相對豐度由大到小依次為綠彎菌門、變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和酸桿菌門等，這與其他學者關于水稻田根際土壤及其他農田土壤細菌群落優勢菌門的研究結果[21-24]相似。屬水平上，3 個品種水稻根際土壤共有的5 個優勢菌屬norank_f__Anaerolineaceae、norank_f__norank_o__SBR1031、norank_f__norank_o__SJA-15、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）和Anaerolinea 均屬于綠彎菌門。綠彎菌門在水稻根際土壤細菌群落中相對豐度最高，這可能與試驗稻田土壤偏酸性和長期淹水導致甲烷含量較高有關。因為綠彎菌門是一種甲烷氧化菌，可以進行有氧和無氧呼吸，在稻田土壤甲烷轉化和碳循環中起著重要作用。研究證實，綠彎菌門喜低鹽和高鹽土壤[25]。0.3% NaCl 和0.6% NaCl處理中，3 個品種水稻根際土壤中的浮霉菌門相對豐度大于1%，這可能與鹽脅迫下水稻根際土壤厭氧氨氧化和反硝化作用增強有關。已有研究表明，浮霉菌門屬生態友好型微生物，其某些屬的細菌能夠在缺氧環境下利用亞硝酸鹽（NO2?）氧化銨離子（NH4+）生成氮氣來獲得能量，被稱作厭氧氨氧化菌[26-27]。浮霉菌門還具有反硝化功能，ZHOU 等[28]研究發現農田系統浮霉菌門群落增加，可能與其參與反硝化作用有關系。鹽度是影響浮霉菌門種群分化的關鍵因素[29]，正向驅動浮霉菌門種群分布[30]。

根際土壤微生物的數量和種類是影響植物生長發育和健康狀況的重要因素[31-32]。研究認為，作物根際廣泛分布著各類能夠提高作物耐鹽能力的益生菌，但可能具有高度的宿主特異性[33]。本研究中不同鹽脅迫處理下，B1、B3 和B6 品種水稻根際土壤細菌群落結構組成存在差異，且富集的物種不同，其中B6 品種水稻根際土壤細菌群落豐富度較高，且富集物種相對較多，這些差異菌群可能是耐鹽水稻適應高鹽惡劣環境的重要菌群。如0.6% NaCl 處理下B6 品種根際土壤豐度較高或富集的暖發菌門是厭氧菌，嗜熱、嗜鹽；酸桿菌門大多為嗜酸菌，具有特定的驅動作用及生態功能，對環境因子響應較為敏感[34]；芽單胞菌門參與有機物分解、固氮、抑制有害微生物等，且在高鹽土壤中占主導地位[35]； 熱微菌目和KD4-96 屬綠彎菌門參與有機物分解、碳氮循環等重要生態過程；鞘鞍醇單胞菌屬能產生一些激素和代謝物，促進植物生長發育和提高植物對鹽脅迫的耐受性[36]。

4 結論

研究表明，鹽脅迫尤其高鹽脅迫（0.6% NaCl）影響水稻根際土壤細菌群落的豐度和結構組成，不同品種水稻根際土壤細菌群落的豐度和結構存在差異，富集的物種數量和種類亦不同，其中B6品種根際土壤細菌群落豐度較高，且富集物種相對較多，認為沿海灘涂鹽漬化土地種植B6 品種水稻有利于根際土壤優勢細菌群落的形成。本研究篩選出適宜沿海灘涂鹽漬化土地種植的水稻品種，可為利用微生物改良鹽漬化土地提供科學依據。

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基金項目 海南省自然科學基金項目（No. 323RC533， No. 320RC727）；海南省水稻產業技術體系“種質資源創制與品種選育崗”（No. HNARS-RICE）。