防治苜蓿小光殼葉斑病室內藥劑篩選及不同苜蓿品種抗性評價

摘要：近年來在內蒙古多地發現由三葉草小光殼（Leptosphaerulina trifolii）造成的苜蓿小光殼葉斑病，為篩選苜蓿（Medicago sativa）小光殼葉斑病的高效化學藥劑和抗病品種，本研究通過室內藥效測定，比較了14種殺菌劑對苜蓿小光殼葉斑病病原菌的抑制作用，并通過盆栽試驗對46份紫花苜蓿品種進行了抗性鑒定。結果表明，嘧菌酯、吡唑醚菌酯和惡醚唑對NM05菌株的菌絲生長有較好的抑制效果，有效抑制中濃度（Median effective concentration，EC₅₀）值分別為0.0091，0.0383和0.1073 mg·L^-1；經抗病性評價，供試品種中有高抗品種4份，中抗品種17份，中感品種23份和高感品種2份，其中高抗品種為‘苜蓿801’、雜花苜蓿、‘賽特’和‘呼倫貝爾’雜花。綜上所述，本研究篩選出3個苜蓿小光殼葉斑病高效殺菌劑和4個苜蓿高抗品種，為苜蓿小光殼葉斑病的田間防治奠定了基礎。

關鍵詞：苜蓿小光殼葉斑?。粴⒕鷦缓Y選；品種抗性；評價

中圖分類號：S435.4 """""""文獻標識碼：A """""""文章編號：1007-0435（2025）03-1001-10

Fungicide Screening and Evaluation of Resistance of Different Alfalfa Varieties to Leptosphaerulina trifolii in Laboratory

HUO Hong-li^1，2，3，"LUO Jin-gang⁴，"ZHAO Yuan-zheng²，"ZHANG Xiao-yu¹，"YANG Yong-qing²，"PEI Xuan-yuan⁵，"ZHANG Dong-mei⁶，"LI Zi-qin^2*，"ZHOU Hong-you^1，3*

（1.College of Horticulture and Plant Protection，"Inner Mongolia Agricultural University，"Hohhot，"Inner Mongolia 010019，"China；"2.Institute of Plant Protection，"Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，"Hohhot，"Inner Mongolia 010031，"China；3.Key Laboratory of Biopesticide Creation and Resource Utilization in Inner Mongolia Autonomous Region，"Hohhot，"Inner Mongolia 010018，"China；"4.Inner Mongolia Electronic Information Vocational Technical College，"Hohhot，"Inner Mongolia 010070，"China；"5.College of Environmental Engineering，"Wuhan Textile University，"Wuhan，"Hubei Province 430200，"China；"6.Hinggan League Institute of Agricultural and Husbandry Sciences，"Ulanhot，"Inner Mongolia 137400，"China）

Abstract：In recent years，"alfalfa leaf spot caused by Leptosphaerulina trifolii"has been found in multiple places in Inner Mongolia. In order to screen highly effective chemical fungicides and alfalfa resistant varieties against this disease，"our study employed laboratory efficacy assay to compare the inhibitory effects of 14 fungicides on the Leptosphaerulina trifolii. Additionally，"resistance identification of 46 alfalfa varieties to Leptosphaerulina trifolii"was conducted by pot test. The results showed that azoxystrobin，"pyraclostrobin and difenoconazole exhibited superior inhibitory effects on the mycelial growth of NM 05 strain，"with EC₅₀"values of 0.0091，"0.0383 and 0.1073 mg·L^-1，"respectively. Based on disease resistance evaluation，"four high resistant varieties were screened out，"they were ‘alfalfa 801’，variegated alfalfa，‘Saite’"and ‘Hulunbuir’"variegated alfalfa. And seventeen medium resistant varieties，"twenty-three medium susceptible varieties and two high susceptible varieties were also screened out. In summary，"our study successfully identified three effective fungicides and four highly resistant alfalfa varieties in laboratory，"laying the foundation for prevention and control of Leptosphaerulina"leaf spot in alfalfa field.

Key words：Alfalfa"Leptosphaerulina"leaf spot；Fungicides；Screening；Variety resistance；Evaluation

紫花苜蓿（Medicago sativa）是蝶形花亞科的多年生豆科牧草。盡管存在二倍體，但栽培苜蓿主要是異花授粉的同源四倍體植物^［1］。苜蓿原產于小亞細亞、伊朗、外高加索一帶^［2］，在我國主要分布于西北、華北等干旱或半干旱地區。紫花苜蓿因其營養價值高、適口性好，且對極端氣候和鹽堿具有較強的耐受性，成為家畜重要的蛋白質來源^［3-4］。此外，苜蓿有助于提高土壤有機質含量，改善土壤結構^［5-6］，還可用于修復被潛在有毒元素（potentially toxic elements）污染的土壤^［7］。苜蓿葉被認為是可應用于食品中的一種優質蛋白質，具有相對較高的蛋白質含量和均衡的氨基酸譜^［8］。

病害的發生會導致苜蓿的產量減少，營養成分降低，以及適口性下降，嚴重影響其飼用價值^［9-10］。1956年美國地區發現苜蓿小光殼葉斑病，而后在亞洲、美洲、歐洲和非洲均有報道^［11-12］。前人研究發現能引致苜蓿小光殼葉斑病的病原菌包括苜蓿小光殼（Leptosphaerulina briosiana）、澳大利亞小光殼（L.australis）和三葉草小光殼（L.trifolii）^［13-16］。小光殼葉斑病可危害苜蓿新葉、老葉和莖稈，葉部癥狀隨環境和葉片的生理狀況而變化。病斑在發病初期多為黑色的“胡椒斑”狀，之后擴大成直徑1～3 mm的“眼斑”^［17］。病斑中央呈現淡褐色或黃褐色，且在其外部環繞褪色綠區。在適宜的外部條件下，病斑會隨著紫花苜蓿的生長而不斷擴大，直至匯合成一整片黃化的葉區^［17-18］。苜蓿小光殼葉斑病除導致葉片過早干枯脫落以外，L. briosiana的侵染還會使苜蓿植株體內香豆雌酚（雌激素類似物）含量顯著升高，進而影響草食家畜健康^［19-21］。Leptosphaerulina真菌的菌絲和子囊果在患病組織中越冬，在脫落病葉上形成子囊果，子囊孢子在冷濕條件下被彈射到苜蓿葉上，從而提供初侵染來源^［22］。該病原菌寄主廣泛，通常會感染禾本科剪股穎屬（Agrostis）、黑麥草屬（Lolium）、羊茅屬（Festuca）和早熟禾屬（Poa），同時也可侵染紅三葉（Trifolium pratense）、狗尾草（Setaria viridis）、車軸草（Trifolium）、花生（Arachis hypogaea）、豌豆（Pisum sativum）、大豆（Glycine max）和蠶豆（Vicia faba）等植物^［23-27］。Zhang等^［15］在內蒙古赤峰市首次發現由L.australis引起的苜蓿小光殼葉斑病，該病原菌導致3千多公頃栽培苜蓿田部分苜蓿葉片表面出現大量白斑或葉片干枯。

目前國內外有關該病害防治的研究較少，Barbetti等^{［20，28］}研究了不同一年生苜蓿品種對L. trifolii抗性。環唑醇、粉唑醇、戊唑醇和丙硫菌唑的使用顯著降低了由L. chartarum引起的巨芒草（Miscanthus × giganteus）葉枯病的嚴重程度^［29］。異菌脲、丙森鋅、唑醚·戊唑醇、多菌靈、百菌清、代森錳鋅、異菌·腐霉利和啶酰·肟菌酯的施用可防治苜蓿小光殼葉斑病并提高苜蓿產量^［30-31］。胡進玲等^［32］研究結果表明解淀粉芽孢桿菌和卡那霉素鏈霉菌對苜蓿小光殼葉斑病病原菌抑制率可達60.99%以上，郭釗伶^［33］發現紫花苜蓿對小光殼葉斑病化學防御的次生代謝產物1，2-二乙基苯和腺苷對病原菌有抑制效果。2019年Liu等^［16］首次在我國黑龍江發現由L.trifolii引起的苜蓿小光殼葉斑病，2022—2023年課題組在內蒙古自治區呼倫貝爾及赤峰市多個苜蓿種植區發現由L.trifolii造成的苜蓿小光殼葉斑病。本研究針對病原菌開展殺菌劑室內毒力測定，篩選出多個抑菌效果較好的藥劑，可在田間病害防治時輪換施用防止抗藥性產生，同時研究了不同紫花苜蓿品種對病原菌的抗性，旨在為開展田間病害防控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為苜蓿小光殼葉斑病病原菌（Leptosphaerulina trifolii）NM05，保存于內蒙古自治區農牧業科學院植物保護研究所實驗室。菌株采用燕麥培養基培養（燕麥片30 g，煮沸過濾，加瓊脂15 g，蒸餾水定容至1000 mL，OA）。

1.1.2 供試藥劑 供試藥劑及終濃度設置見表1。

1.1.3 苜蓿品種 供試紫花苜蓿品種46個，包括內蒙古地區常規種植品種和國外培育品種，感病品種‘MOAPA69’^［34］為對照材料。具體參試苜蓿品種及其編號見表2。

1.2 試驗方法

1.2.1 殺菌劑對病原菌的抑制作用測定 供試農藥用二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）配制成濃度為10 000 μg·mL^-1的母液，使用時再稀釋成一定濃度的使用液，加入預先滅菌并冷卻至45～50℃的燕麥瓊脂（Oat agar，OA）培養基，充分搖勻后傾倒平板。培養基殺菌劑的終濃度見表1。使用滅菌的直徑5 mm打孔器打取培養15 d的病原菌菌落邊緣菌絲塊，菌面向下接種于含藥OA培養基上，以含DMSO的OA培養基為對照，20℃黑暗培養，分別在接種后5，10，15 d時，采用十字交叉法測量菌落直徑（mm），每個濃度設置3個重復，并計算各殺菌劑不同濃度處理對病原菌菌絲生長的抑制率。

（1）

以殺菌劑濃度的對數值為橫坐標（x），15 d時抑制率的概率值為縱坐標（y），根據x與y的線性關系得出其毒力回歸方程y=ax+b，計算相關系數（R²）和各藥劑的有效抑制中濃度（Median effective concentration，EC₅₀）。

1.2.2 病原菌接種不同苜蓿品種及接種后培養 播種20粒種子于土壤∶蛭石（1∶1）的營養缽中，每品種4盆重復。刮取生長于OA培養基上的病原菌孢子，制成濃度為1×10⁶"個·mL^-1含0.2% 吐溫-80的懸浮液，均勻噴灑100 mL在生長60 d的每盆不同苜蓿品種葉片上，以接種不加病原菌的0.2% 吐溫-80懸浮液為對照，接種結束后用棚膜罩住保濕48 h后取下棚膜正常培養。接種14 d后，測定所有供試植株的發病率和病情指數。

1.2.3 病情調查及抗性評價 每盆選取10株苜蓿，對苜蓿上每個葉片的病情級別進行調查，根據小葉病斑占葉面積的百分比對葉片進行病害分級。病害分級標準如下^［35］：0級—無病斑；1級—小葉病斑占葉面積的1%～5%；2級—小葉病斑占葉面積的5%～15%；3級—小葉病斑占葉面積的15%～25%；4級—小葉病斑占葉面積的25%～35%；5級—小葉病斑占葉面積的35%以上。

計算各品種的發病率和病情指數，每品種4次重復，每重復統計10株。

（2）

（3）

根據病情指數將46份苜蓿種質材料劃分為4個等級：病情指數小于25的為高抗；25～35之間的為中抗；35～45之間的為中感；大于45的為高感。

1.3 數據統計與分析

試驗數據采用Microsoft Excel進行處理，用平均值±SD表示，并使用IBM SPSS Statistics 26軟件進行平均值的計算和差異顯著性分析（Duncan）。

2 結果與分析

2.1 室內藥劑篩選

2.1.1 殺菌劑對苜蓿小光殼葉斑病菌菌落生長的影響 經過前期研究結果發現，L.trifolii最適溫度為20℃，最適pH值為5～7，最適培養基為OA培養基和V8培養基^［36］，該菌在適宜條件下培養15 d后接近最大直徑。表3表明，隨著殺菌劑濃度的增加，菌落直徑逐漸減小，抑菌率逐漸增加。培養15 d后，98%嘧菌酯抑菌效果最好，其次為98%惡醚唑和97%吡唑醚菌酯，藥劑濃度為1.28 mg·L^-1時，菌落直徑分別為19.10 mm，22.55 mm和23.91 mm，抑制率分別為79.14%，74.05 %和72.04%。98%烯酰嗎啉抑菌效果最差，其次為90%代森錳鋅和70%丙森鋅，藥劑濃度為10.24 mg·L^-1時，菌落直徑分別為70.95 mm，68.84 mm和61.49 mm，抑制率分別為2.47 %，5.59 %和16.46%。

2.1.2 14種殺菌劑對苜蓿小光殼葉斑病菌的室內毒力測定 如表4和圖1所示，14種殺菌劑對L. trifolii NM05菌株的菌絲生長均有抑制作用。根據殺菌劑對病原菌的抑制中濃度EC₅₀值，嘧菌酯、吡唑醚菌酯和惡醚唑對NM05菌株菌絲生長有較好的抑制效果，EC₅₀值分別為0.0091，0.0383和0.1073 mg·L^-1；而烯酰嗎啉對NM05菌株菌絲生長的抑制效果最差，EC₅₀值僅為1081.4169 mg·L^-1。各藥劑毒力排名為嘧菌酯gt;吡唑醚菌酯gt;惡醚唑gt;咪鮮胺gt;戊唑醇gt;多菌靈gt;甲基托布津gt;腐霉利gt;啶酰菌胺gt;異菌脲gt;三唑酮gt;丙森鋅gt;代森錳鋅gt;烯酰嗎啉。

2.2 紫花苜蓿品種對小光殼葉斑病抗性評價

不同病級下苜蓿小光殼葉斑病發病情況如圖2所示，根據病級計算各個品種的病情指數并統計發病率。表5表明，供試品種對L. trifolii的抗性存在較大差異。接種后第14天，各苜蓿品種發病率介于72.16%～98.98%之間，其中‘AGATE’和‘甘農1號’的發病率和病情指數較高，分別為96.49%，45.85和97.43%，47.16。根據苜蓿品種抗性類別劃分標準，‘苜蓿801’、雜花苜蓿、‘賽特’和‘呼倫貝爾’雜花為高抗品種，發病率分別為80.22%，91.28%，92.97%和72.16%，病情指數分別為21.93，23.07，24.25和24.44，顯著低于中感和高感品種（Plt;0.05），同時篩選出17份中抗品種、23份中感品種和2份高感品種。

3 討論

現代農業集約化管理加劇了真菌對農作物的危害，殺菌劑目前仍然是我們對抗植物病害最有力的武器^［37］。異菌脲和丙森鋅之前被用于防治L.trifolii^［31］，在本研究中異菌脲和丙森鋅EC₅₀值為15.2247和89.3491，對L.trifolii的抑制效果低于篩選出的3個殺菌劑。肖鈺瑩等^［38］室內藥劑毒力測定表明，30%吡唑醚菌酯對紫花苜蓿葉枯病病原菌抑菌作用最強，易健^［39］研究發現25%吡唑醚菌酯對花生焦斑病病原菌L.arachidicola具有較好的抑制效果，而在本研究中吡唑醚菌酯的抑菌效果也較好。篩選出的嘧菌酯和吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，該類殺菌劑具有廣譜、快速、高效的特點^［40］，惡醚唑屬于三唑類殺菌劑，主要抑制病菌細胞麥角甾醇的生物合成。抑菌效果最差的藥劑是98%烯酰嗎啉，該藥劑屬于殺卵菌綱真菌殺菌劑，不適用于L.trifolii的防治。在室內采用菌絲生長速率法測定殺菌劑對病原菌的毒力是篩選有效殺菌劑的重要方法，本試驗通過室內毒力測定研究了不同藥劑對L. trifolii的抑制效果，為進一步在田間進行藥劑防治試驗提供數據支撐。

本研究首次根據發病率和病情指數分析了46個苜蓿品種對L. trifolii的抗性，通過調查發病率和病情指數，發現不同品種間存在差異。接種14 d后，‘苜蓿801’、雜花苜蓿、‘賽特’和‘呼倫貝爾’雜花的病情指數顯著低于中感和高感品種，分別為21.93，23.07，24.25和24.44；‘AGATE’和‘甘農1號’的病情指數最高，分別為45.85和47.16；根據抗性類別劃分標準，各苜蓿品種對L. trifolii的抗性排序為‘苜蓿801’gt;雜花苜蓿gt;‘賽特’gt;‘呼倫貝爾’雜花gt;‘中苜5號’gt;‘中特1號’gt;‘南苜601’gt;‘騎士2’gt;‘中苜1號’gt;‘中苜3號’gt;‘挑戰者’gt;‘中苜2號’gt;‘亮牧’gt;‘普通紫花’gt;‘勇士’gt;‘3010’gt;‘阿迪娜’gt;‘康賽’gt;‘SW3211’gt;‘甘農3號’gt;‘黃花苜?！痝t;‘騎士’gt;‘MOAPA69’gt;‘龍牧808’gt;‘42ZQ’gt;‘敖漢苜?！痝t;‘大富翁’gt;‘東飼3號’gt;‘騎士1’gt;‘WL298HQ’gt;‘草原3號’gt;‘巨能2號’gt;‘龍牧806’gt;‘雪豹’gt;‘甘農6號’gt;‘甘農7號’gt;‘標靶’gt;‘龍牧801’gt;‘俄羅斯雜花’gt;‘WL168HQ’gt;‘甘農8號’gt;‘肇東苜蓿’gt;‘MNGN-1’gt;‘百斯特’gt;‘AGATE’gt;‘甘農1號’。曹師等^［41］研究了不同紫花苜蓿品種對異莖點霉根腐病的抗病性發現‘巨能2號’‘阿迪娜’為高抗，‘中苜1號’‘敖漢’為中抗，‘甘農6號’和‘草原3號’為低抗，在本研究中‘阿迪娜’‘中苜1號’為中抗，其余均為中感，兩者結果存在差異的原因可能是由于前者以健康植株百分率作為評價標準，而后者則以病情指數作為評價標準。陳超超等^［42］在紫花苜蓿種質對黃萎病的抗性評價中發現‘中苜5號’為中抗品種，北美苜蓿協會（NAAIC）認為‘MOAPA69’為感病品種，與本研究結果均一致。雜花苜蓿和‘呼倫貝爾’雜花抗性高于其他品種的原因可能為雜種優勢，即雜合子通常在產量或抗病性方面繼承其近交親本系具有的優異農業性能^［43］。隨著我國種植業和畜牧業產業結構的調整，天然草原改良和優質牧草的種植面積迅速擴大^［44］，選育抗性品種是提高苜蓿產量和品質最經濟有效的策略。目前國內外對苜蓿小光殼葉斑病品種抗病性鑒定的相關報道較少，本試驗結果不僅可發掘優異的苜蓿小光殼葉斑病抗性品種，還能為抗病品種的田間推廣種植和新品種選育提供一定參考價值。

4 結論

苜蓿小光殼葉斑病是我國近年新發生的主要病害之一，可危害葉片及莖稈。本試驗結果表明嘧菌酯、吡唑醚菌酯和惡醚唑對小光殼葉斑病病原菌有較好的抑制作用，苜蓿品種‘苜蓿801’、雜花苜蓿、‘賽特’和‘呼倫貝爾’雜花為高抗品種。該結果為苜蓿小光殼葉斑病的綜合防治提供了理論依據。

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（責任編輯""閔芝智）

引用格式：霍宏麗， 羅金剛， 趙遠征，"等.防治苜蓿小光殼葉斑病室內藥劑篩選及不同苜蓿品種抗性評價[J].草地學報，2025，33（3）：1001-1010

Citation：HUO Hong-li， LUO Jin-gang， ZHAO Yuan-zheng， et al.Fungicide Screening and Evaluation of Resistance of Different Alfalfa Varieties to"Leptosphaerulina trifolii"in Laboratory[J].Acta Agrestia Sinica，2025，33（3）：1001-1010

基金項目：內蒙古自治區農牧業科學院青年創新基金項目（2024QNJJN04）；中科院先導專項（A）“創建生態草牧業科技體系”（XDA26050101-01）資助

作者簡介：霍宏麗（1991-"），女，漢族，內蒙古烏蘭察布人，博士研究生，助理研究員，主要從事植物保護研究，E-mail："huohongli0127@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail："zi.qin.li@hotmail.com；hongyouzhou2002@aliyun.com