交配前后雌性橘小實(shí)蠅觸角和腦部組織比較轉(zhuǎn)錄組分析

摘要 橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis是我國(guó)水果產(chǎn)業(yè)的重要害蟲(chóng)，雌蟲(chóng)初次交配后再次交配的行為有明顯變化，這種變化可能受神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)。本研究通過(guò)行為學(xué)試驗(yàn)觀察12日齡的橘小實(shí)蠅成蟲(chóng)初次交配后連續(xù)4d的再交配行為；利用高通量測(cè)序技術(shù)分別對(duì)交配前后橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)的觸角及腦組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析交配前后差異表達(dá)的基因；以Plt;10^-4為標(biāo)準(zhǔn)篩選交配后雌蟲(chóng)腦組織中與交配行為變化相關(guān)的候選基因，并利用qPCR對(duì)候選基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證；利用生物信息學(xué)方法在全基因組中鑒定候選基因的基因家族成員并分析其在外周神經(jīng)組織中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，初次交配后連續(xù)4d橘小實(shí)蠅雄蟲(chóng)交配率均在94%以上，而雌蟲(chóng)在未產(chǎn)卵的情況下交配率均低于11%；與未交配狀態(tài)相比，交配后橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)觸角組織中有1個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，3個(gè)基因顯著下調(diào)；腦組織中有20個(gè)基因顯著上調(diào)，22個(gè)基因顯著下調(diào)。從交配后雌蟲(chóng)腦組織中20個(gè)上調(diào)基因中共篩選到5個(gè)候選差異基因，其中2個(gè)屬于卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）基因家族，3個(gè)屬于類蛻皮素激酶（ecdysteroid kinase-like，EcKL）基因家族；橘小實(shí)蠅全基因組中共鑒定到59個(gè)EcKL基因家族成員和11個(gè)Vg基因家族成員，其中49個(gè)EcKL和9個(gè)Vg在腦和外周神經(jīng)組織中有表達(dá)。本研究結(jié)合行為學(xué)試驗(yàn)及組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)交配后橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)觸角及腦組織中轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，并分析了與交配后再次交配行為相關(guān)的候選基因的基因家族成員和表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究調(diào)控橘小實(shí)蠅交配行為的關(guān)鍵基因及開(kāi)發(fā)相關(guān)防控技術(shù)提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 橘小實(shí)蠅；交配行為；觸角；腦；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)：Q 969.9；S 433 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688／j.zwbh.2024109

交配是大多數(shù)昆蟲(chóng)繁殖后代的關(guān)鍵步驟，昆蟲(chóng)的交配行為在交配后會(huì)發(fā)生顯著變化，這些變化反映了它們?cè)诓煌A段的需求。例如黑腹果蠅Drosophila melanogaster雌蟲(chóng)在交配后應(yīng)產(chǎn)卵需求，會(huì)激活先天免疫，并加速生殖成熟和產(chǎn)卵。神經(jīng)系統(tǒng)是昆蟲(chóng)行為調(diào)控的核心，神經(jīng)系統(tǒng)感知到交配狀態(tài)的變化后會(huì)調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的交配行為。例如，昆蟲(chóng)交配后其嗅覺(jué)外周神經(jīng)對(duì)性信息素的敏感度降低，而對(duì)于植物氣味的敏感度大幅增強(qiáng)，多巴胺信號(hào)通過(guò)多巴胺受體傳遞到P1神經(jīng)元，調(diào)控交配行為，交配后，雄性黑腹果蠅多巴胺能神經(jīng)元的興奮度降低，對(duì)雌性刺激的敏感性下降，導(dǎo)致P1神經(jīng)元的激活被抑制，進(jìn)而減少了求偶行為。

交配行為直接影響昆蟲(chóng)的繁殖行為，尤其是雌蟲(chóng)，交配行為會(huì)刺激其神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)控其產(chǎn)卵行為，而基因在其中發(fā)揮著根本作用。目前研究較多的是性肽，其通過(guò)性肽受體調(diào)控雌性交配后的行為轉(zhuǎn)變，這在黑腹果蠅、棉鈴蟲(chóng)Helicooerpa ar-migera和橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis中均有報(bào)道。在果蠅中，性肽受體通過(guò)關(guān)閉腦部pCl中樞向陰道板傳遞的打開(kāi)信號(hào).使雌蟲(chóng)從接受交配轉(zhuǎn)向拒絕交配。雖然性肽在昆蟲(chóng)中已有較多的研究，但涉及雌性行為轉(zhuǎn)變的基因轉(zhuǎn)錄水平變化的研究相對(duì)較少。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在高通量篩選與尋找與生理狀態(tài)變化相關(guān)的重要基因中發(fā)揮有效的作用，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以獲得某一生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，是研究基因表達(dá)調(diào)控的重要手段。已有的轉(zhuǎn)錄組研究表明，交配狀態(tài)不僅影響與交配和繁殖行為直接相關(guān)的基因，例如與卵子生產(chǎn)和化學(xué)感受相關(guān)的基因，也影響其他功能的基因，例如肌肉發(fā)育、酸堿度調(diào)節(jié)和翻譯起始因子。另外，不同物種間，與交配行為有關(guān)的基因的功能及表達(dá)變化情況均存在差異，例如，黑腹果蠅或意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica交配后雌性體內(nèi)免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata交配后雌性體內(nèi)免疫基因轉(zhuǎn)錄水平并沒(méi)有顯著變化，氣味結(jié)合蛋白的表達(dá)變化也和黑腹果蠅不一樣。因此，對(duì)特定害蟲(chóng)交配前后所涉及重要組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和比較分析，有可能獲得與交配行為相關(guān)的基因。

橘小實(shí)蠅是全球重大果蔬害蟲(chóng)，可為害150多種水果及蔬菜，其主要通過(guò)雌蟲(chóng)在果實(shí)內(nèi)產(chǎn)卵造成危害。目前化學(xué)防治方法對(duì)橘小實(shí)蠅防控效果有限且存在抗藥性等問(wèn)題。綠色防控使用的高效引誘劑如甲基丁香酚主要針對(duì)雄蟲(chóng)。本研究使用高通量測(cè)序?qū)﹂傩?shí)蠅交配前后觸角和腦部差異轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，采用生物信息學(xué)對(duì)其基因進(jìn)行鑒定和功能注釋，對(duì)上調(diào)最為顯著的基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，挖掘繁殖行為相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和表達(dá)分析，旨在為理解橘小實(shí)蠅交配狀態(tài)介導(dǎo)的行為轉(zhuǎn)變機(jī)制提供分子基礎(chǔ)，同時(shí)獲取干擾雌蟲(chóng)交配行為和繁殖行為的潛在靶標(biāo)，為后續(xù)利用RNA干擾技術(shù)開(kāi)發(fā)核酸農(nóng)藥干擾這些基因的表達(dá)，從而抑制橘小實(shí)蠅的交配和繁殖奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1行為學(xué)試驗(yàn)

橘小實(shí)蠅來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所。橘小實(shí)蠅卵置于幼蟲(chóng)人工飼料中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度25～27℃，相對(duì)濕度50%～60%，光周期L∥D=14h∥10h，幼蟲(chóng)老熟后置于濕沙中化蛹；羽化前將蛹從沙中篩出，放入18cm×25cm×14cm的亞克力材質(zhì)透明養(yǎng)蟲(chóng)籠中，直至羽化；成蟲(chóng)飼料為啤酒酵母和白砂糖1：1混合物，同時(shí)放置水源。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，羽化后12～16d為成蟲(chóng)的交配高峰期。因此選擇12日齡作為研究的初始日齡。將50對(duì)12日齡的雌雄成蟲(chóng)放入18cm×25cm×14cm透明亞克力養(yǎng)蟲(chóng)籠中，于16：30 -20：30（實(shí)蠅交配高峰時(shí)段）放置于50lx光照下觀察其交配情況，小心地挑出30對(duì)正在交配的雌雄成蟲(chóng)單對(duì)放置在潔凈果蠅管內(nèi)，確保不打斷其交配過(guò)程。交配時(shí)長(zhǎng)大于2h視為成功交配，20：30關(guān)閉燈光。第2天9：00將交配成功的雌性和雄性成蟲(chóng)各30頭分別放到兩個(gè)透明亞克力養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi)飼養(yǎng)，于16：30再分別放入30頭相同日齡的異性未交配成蟲(chóng)，置于50 lx光照下，觀察已交配成蟲(chóng)的再次交配情況，記錄交配個(gè)體的數(shù)量，20：30關(guān)閉燈光。第3天至第5天的操作和第2天相同，進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，每重復(fù)用蟲(chóng)數(shù)、時(shí)間和光照條件均相同。統(tǒng)計(jì)雌性和雄性成蟲(chóng)初次交配及之后第2天至第5天的交配率。利用GraphPad Prism（v 9.5.1）進(jìn)行差異顯著分析，對(duì)各天的平均交配率進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)（Brown-Forsythe test），對(duì)雌雄每天的交配率進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有重復(fù)數(shù)據(jù)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.2用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的雌蟲(chóng)樣本采集

由于橘小實(shí)蠅交配會(huì)在夜間持續(xù)進(jìn)行，最長(zhǎng)可由傍晚持續(xù)到次日上午，因此在12日齡的橘小實(shí)蠅成蟲(chóng)完成交配后的第2天上午9：00，將150頭已交配雌性個(gè)體平均分配到3個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)籠中，補(bǔ)充等量的未交配雄蟲(chóng)，當(dāng)日傍晚觀察橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配行為，確定其交配率顯著低于初次交配且交配行為穩(wěn)定后，于第3天（14日齡）上午9：00采集完成了初次交配且無(wú)二次交配行為的雌蟲(chóng)的觸角和腦部組織，同時(shí)采集未進(jìn)行初次交配的同日齡雌蟲(chóng)的相同部位作為對(duì)照。利用二氧化碳麻醉橘小實(shí)蠅，使用鑷子（LA501979-6， World Precision Instruments）從觸角基部拔取完整的觸角；使用微型剪刀（503364，World Precision Instruments）剪開(kāi)橘小實(shí)蠅頭部，使用鑷子剝離完整的腦組織；100對(duì)觸角作為1個(gè)重復(fù)，30個(gè)腦組織作為1個(gè)重復(fù)。上述過(guò)程重復(fù)5次，即5次生物重復(fù)。采集過(guò)程中，將樣本立即浸沒(méi)于液氮中，采集完畢后放入-80℃超低溫冰箱保存。

1.3總RNA提取和檢測(cè)

使用TRIzol試劑提取每個(gè)樣品的總RNA。使用微量紫外分光光度計(jì)（ND ONEC，Gene Company Limited）測(cè)定總RNA的濃度，使用片段分析儀Fragment Analyzer 5400（Agilent，美國(guó)）全自動(dòng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)測(cè)定總RNA的完整性和純度。將檢測(cè)合格的RNA樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。測(cè)序平臺(tái)選用Illumina，策略采用PE150。

1.4測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理和轉(zhuǎn)錄本定量

Illumina高通量測(cè)序儀測(cè)序得到原始圖像文件，進(jìn)行堿基識(shí)別（base-calling）和Bcl2Fastq轉(zhuǎn)化后得到fastq格式的原始測(cè)序序列，使用FastQC（v 0.12.1）對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)檢，然后使用Trimmomatic（v 0.39）過(guò)濾并移除接頭序列，得到高質(zhì)量的有效序列。從國(guó)家生物信息中心GSA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥ngdc.cncb.ac.cn/？ _blank，PRJCA020830）下載橘小實(shí)蠅參考基因組，并使用HISAT2-build（v2.2.1）構(gòu)建索引，用HISAT2軟件（v 2.2.1）將有效序列比對(duì)到參考基因組，得到包含比對(duì)信息的sam文件；使用SAMtools（v 1.16.1）軟件對(duì)sam文件按序列在fastq文件中的順序（即header）和序列從左往右的位點(diǎn)排序，得到bam文件；使用StringTie（v 2.2.1）軟件結(jié)合參考基因組注釋文件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組組裝，之后用StringTie軟件中prep-DE. py腳本進(jìn)行基因和轉(zhuǎn)錄本的定量，得到基因原始表達(dá)矩陣和TPM（transcripts per million）值矩陣。

1.5交配前后橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)觸角和腦組織中差異表達(dá)基因的分析

使用R語(yǔ)言DESeq2包對(duì)交配前后橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)觸角和腦組織分別進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，篩選符合Plt;0.05的差異表達(dá)基因作為顯著差異表達(dá)基因。以橘小實(shí)蠅參考基因組中注釋到的所有基因?yàn)榛A(chǔ)分別對(duì)存在顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG功能富集分析。符合Plt;0.05且qlt;0.2的通路被定義為顯著富集。按照P值對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類，規(guī)定Plt;10^-4的基因?yàn)樽兓瘶O顯著的差異基因。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析驗(yàn)證交配前后雌蟲(chóng)差異基因的轉(zhuǎn)錄變化

使用Premier-BLAST（https：∥blast. ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）設(shè)計(jì)橘小實(shí)蠅交配后腦部轉(zhuǎn)錄上調(diào)極顯著的基因以及內(nèi)參基因Actin的特異性引物（表1）。采用TRIzol試劑分別提取14日齡的30頭已交配雌性和30頭未交配雌性的腦組織總RNA。用HiScriptⅢReverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶（諾唯贊，南京）從2μg總RNA中獲得cDNA。使用熒光定量PCR儀CFX Opus 96（Bio-Rad）設(shè)備進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。10μL反應(yīng)體系包含：cDNA模板1μL，10 mmol／L上、下游引物各0.5μL，2×Taq Pro SYBR（R）uasterMix染料（TaKaRa）5μL，ddH₂O ₃μL。反應(yīng)程序：95℃3 min；95C 10 s，55℃30 s，39個(gè)循環(huán)；65℃5s，95℃ 30 s。所有qPCR試驗(yàn)均進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用2^-ΔΔC_T相對(duì)定量法計(jì)算候選基因的相對(duì)表達(dá)量，利用GraphPad Prism（v 9.5.1）進(jìn)行差異顯著性分析，首先使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，然后使用1g（x+1）對(duì)非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。對(duì)各基因交配前后的表達(dá)水平進(jìn)行t檢驗(yàn)，所有重復(fù)數(shù)據(jù)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.7橘小實(shí)蠅類蛻皮激素激酶（ecdysteroid kinase-like，EcKL）基因家族分析

1.7.1橘小實(shí)蠅EcKL基因鑒定和命名

從Interpro數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥www.ebi.ac.uk/interpro／）中下載已公布的EcKL的隱馬爾可夫模型（hidden Markov model，HMM）（登錄號(hào)PF02958），根據(jù)該模型利用HMMER（v 2.2.1）對(duì)橘小實(shí)蠅基因組蛋白序列（從實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)序組裝獲得基因組中獲取）進(jìn)行搜索，篩選顯著性閾值（E值）lt;10^-5（期望值）的結(jié)果作為基因集1。利用已報(bào)道的黑腹果蠅EcKL基因蛋白序列，用PSI-BLAST（v 2.14.0）將其與橘小實(shí)蠅基因組蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)，從中篩選Elt;10²的結(jié)果作為基因集2。選取2個(gè)基因集的交集，將其中基因編碼氨基酸序列在Interpro數(shù)據(jù)庫(kù)、CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？）中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證。篩選被預(yù)測(cè)為EcKL的基因作為橘小實(shí)蠅候選EcKL基因。按照基因ID順序?qū)﹂傩?shí)蠅候選EcKL基因進(jìn)行排序，基因ID最小的命名為BdorEcKL1，其他候選EcKL基因按照基因ID大小順次進(jìn)行命名。

1.7.2橘小實(shí)蠅EcKL基因在腦部和外周組織中表達(dá)模式分析

以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的橘小實(shí)蠅雌雄成蟲(chóng)腦和外周組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（已上傳至國(guó)家生物信息中心GSA數(shù)據(jù)庫(kù)https：∥ngdc.cncb.ac.cn/？ _blank，PRJCA020830）作為參考基因組，包括腦、觸角、口器、前足、中足、后足、外生殖器共7種組織。利用StringTie（v 2.2.1）軟件對(duì)比對(duì)到參考基因組的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝，計(jì)算表達(dá)量及TPM值，整合獲得原始表達(dá)矩陣及TPM值矩陣。根據(jù)TPM值的離群程度對(duì)原始表達(dá)矩陣進(jìn)行過(guò)濾。最終將過(guò)濾后的原始表達(dá)矩陣以及樣本分組信息輸入DESeq2，對(duì)每個(gè)組織分別進(jìn)行雌雄間差異表達(dá)分析，設(shè)定閾值為：｜log2 fold change｜gt;1.5，Plt;0.05。提取雌雄成蟲(chóng)不同組織EcKL候選基因表達(dá)矩陣。在R語(yǔ)言中利用Pheatmap構(gòu)建EcKL候選基因在外周神經(jīng)組織的表達(dá)譜。

1.7.3 EcKL在橘小實(shí)蠅和果蠅中的系統(tǒng)發(fā)育分析

收集已發(fā)表的黑腹果蠅EcKL的氨基酸序列，與上述所獲得的橘小實(shí)蠅EcKL氨基酸序列一同使用MAFFT（v 7.515） 進(jìn)行多序列比對(duì)，使用IQ-TREE（v 2.2.0.3）軟件的ModelFinder選項(xiàng)選擇最佳的核苷酸替代模型，以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.8橘小實(shí)蠅卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）基因家族分析

1.8.1橘小實(shí)蠅Vg基因鑒定和命名

收集NCBI公布的雙翅目昆蟲(chóng)，包括墨西哥按實(shí)蠅Anastrepha ludens、西印度按實(shí)蠅Anastrepha obliqua、褐肩果實(shí)蠅Bactrocera neohumeralis、瓜實(shí)蠅Bactrocera cucurbitae、辣椒實(shí)蠅Bactrocera lati-frons、地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata、黑腹果蠅、雙刺果蠅Drosophila biarmipes和銀額果蠅Drosoph-ila albomicans的卵黃原蛋白（Vg）的氨基酸序列，根據(jù)這些序列信息利用HMMER（v 2.2.1）構(gòu)建隱馬爾可夫模型，搜索橘小實(shí)蠅基因組蛋白序列，篩選顯著性閾值Elt;10^-5的結(jié)果作為基因集1。從Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥www.uniprot.org／）中下載黑腹果蠅卵黃原蛋白基因序列，用PSI-BLAST將其與橘小實(shí)蠅基因組蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)，從中篩選Elt;10^-2的結(jié)果作為基因集2。選取2個(gè)基因集的交集，將其中基因的氨基酸序列在Interpro數(shù)據(jù)庫(kù)、CDD數(shù)據(jù)庫(kù)和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證。篩選被預(yù)測(cè)為Vg的基因作為橘小實(shí)蠅候選Vg基因。按照基因ID順序?qū)﹂傩?shí)蠅候選Vg基因進(jìn)行排序，基因ID最小的命名為BdorVg1，其他候選Vg基因按照基因ID大小順次進(jìn)行命名。

1.8.2橘小實(shí)蠅Vg基因在腦部和外周組織中表達(dá)模式分析

以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的橘小實(shí)蠅雌雄成蟲(chóng)腦和外周組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為參考基因組，包括腦、觸角、口器、前足、中足、后足和外生殖器共7種組織。利用StringTie（v 2.2.1）軟件對(duì)比對(duì)到參考基因組的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝，計(jì)算原始表達(dá)量及TPM值，整合獲得原始表達(dá)矩陣及TPM值矩陣。根據(jù)TPM值的離群程度對(duì)原始表達(dá)矩陣進(jìn)行過(guò)濾。最終將過(guò)濾后的原始表達(dá)矩陣以及樣本分組信息輸入DESeq2進(jìn)行差異表達(dá)分析，以｜lOg2 fold change｜gt;1.5，Plt;0.05為閾值提取不同性別的顯著差異表達(dá)基因。根據(jù)橘小實(shí)蠅候選Vg基因的基因ID從TPM值矩陣中提取不同組織雌雄Vg候選基因表達(dá)矩陣。在R語(yǔ)言中利用Pheatmap構(gòu)建Vg候選基因在橘小實(shí)蠅外周組織的表達(dá)譜。

1.8.3Vg在雙翅目物種中的系統(tǒng)發(fā)育分析

從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥www. uniprot.org／）下載雙翅目昆蟲(chóng)Vg基因的氨基酸序列（墨西哥按實(shí)蠅、西印度按實(shí)蠅、褐肩果實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、辣椒實(shí)蠅、地中海實(shí)蠅、黑腹果蠅、雙刺果蠅和銀額果蠅），與上述所獲得的橘小實(shí)蠅Vg氨基酸序列一同使用MAFFT（v 7.515）進(jìn)行多序列比對(duì)，使用IQ-TREE（v 2.2.0.3）軟件的ModelFinder選項(xiàng)選擇最佳的核苷酸替代模型，以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1橘小實(shí)蠅雌雄成蟲(chóng)的再交配規(guī)律

30對(duì)12日齡的橘小實(shí)蠅初始交配率達(dá)到100%。但雌雄成蟲(chóng)重復(fù)交配現(xiàn)象表現(xiàn)出不同的規(guī)律。在后續(xù)的4d中，當(dāng)每天都對(duì)已交配雄蟲(chóng)提供充足的未交配雌蟲(chóng)時(shí)，雄蟲(chóng)均仍然有較高的交配率，13日齡為94.7%，14日齡為94%，15日齡為96%，16日齡為97%，與初次交配率（12日齡）均無(wú)明顯差異（F_4，20=2.551，P=0.071），說(shuō)明雄蟲(chóng)具有較強(qiáng)的重復(fù)交配能力（圖1）。但雌成蟲(chóng)的重復(fù)交配率顯著下降，13日齡為9.4%，14日齡為9.8%，15日齡為10.8%，16日齡為10.6%，與初次交配率相比均差異顯著（Plt;0.0001，13日齡vs 12日齡：t= 84.12；14日齡vs 12日齡：t=112.8；15日齡vs 12日齡：t= 103.7；16日齡vs 12日齡：t=149，df=8）。且13、14、15日齡和16日齡之間相比交配率沒(méi)有差異（df=8，13日齡vs 14日齡：t=0.298，P=0.9956；13日齡vs 15日齡：t=1.016，P=0.694 3；13日齡vs 16日齡：t=0.973，P=0.7973；14日齡vs 15日齡：t=0.851，P=0.8825；14日齡vs 16日齡：t=0.8，P=0.9436；15日齡vs16日齡：t=0.191，P=0.9997），說(shuō)明雌蟲(chóng)在交配后4d內(nèi)未產(chǎn)卵的前提下交配率沒(méi)有明顯變化，且雌蟲(chóng)的交配后狀態(tài)變化時(shí)間點(diǎn)在12日齡至13日齡之間（圖1）。

2.2交配前后轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)組裝

對(duì)橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配前后觸角和腦組織共20個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，去除低質(zhì)量的序列后，從觸角中獲得411 779 644條有效序列，從腦中獲得409 750 488條有效序列。數(shù)據(jù)顯示，Q30均不小于91.85%，GC含量為39.45%～40.68%（表2），說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量較好，完整度高。

2.3橘小實(shí)蠅雌性交配前后腦部轉(zhuǎn)錄組分析

通過(guò)比較交配前后雌蟲(chóng)的觸角和腦部的轉(zhuǎn)錄組，共獲得45個(gè)差異基因。與未交配的雌蟲(chóng)相比，已交配的雌蟲(chóng)觸角有1個(gè)基因顯著上調(diào)，3個(gè)基因顯著下調(diào)（圖2a）；腦部有20個(gè)基因顯著上調(diào)，22個(gè)基因顯著下調(diào)，其中交配后腦部細(xì)胞色素P450基因（BdorCyp309a2）、葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移酶基因（BdorUD-PGT）等免疫相關(guān)基因顯著上調(diào)，腦部磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因（Bdor PEPCK）交配后下調(diào)最顯著（圖2b）。由此可知，在觸角和腦組織中，橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配前后差異表達(dá)基因主要集中在腦組織，因此選擇了腦部組織的差異基因進(jìn)行后續(xù)分析。

KEGG富集分析表明，雌蟲(chóng)交配后腦組織中顯著上調(diào)基因只顯著富集到抗壞血酸和醛酸鹽的代謝通路；下調(diào)基因共富集到6個(gè)KEGG通路，其中脂肪酸降解通路和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解通路富集最為顯著（圖3）。

以Plt;10-4為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配后腦組織中顯著上調(diào)且具有已知功能注釋的基因進(jìn)行篩選，共獲得5個(gè)上調(diào)極顯著的關(guān)鍵差異基因，其中2個(gè)基因同屬于卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）基因，且這2個(gè)基因在雌性腦組織差異表達(dá)基因中的表達(dá)量最高；另有3個(gè)基因均屬于類蛻皮激素激酶（ecdyste-roid kinase-like，EcKL）基因（表3）。經(jīng)qPCR驗(yàn)證，上述5個(gè)基因在交配后轉(zhuǎn)錄水平均顯著增加（圖4）。

2.4橘小實(shí)蠅蛻皮激素激酶基因家族分析

共獲得59個(gè)橘小實(shí)蠅EcKL候選基因（表4）。為了明確橘小實(shí)蠅與黑腹果蠅間EcKL的進(jìn)化關(guān)系，我們構(gòu)建了59個(gè)橘小實(shí)蠅、50個(gè)黑腹果蠅的EcKL系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，橘小實(shí)蠅EcKL與黑腹果蠅EckL有明確的支系及聚支關(guān)系，進(jìn)化樹(shù)各個(gè)分支具有良好的自展值支持；其中橘小實(shí)蠅有18個(gè)EcKL與黑腹果蠅EcKL一對(duì)一聚支（紅色），暗示這些EcKL在橘小實(shí)蠅和黑腹果蠅間保守；有2個(gè)橘小實(shí)蠅EcKL分別與多個(gè)黑腹果蠅EcKL聚支（紫色），暗示進(jìn)化過(guò)程中這些分支的黑腹果蠅EcKL可能在橘小實(shí)蠅中丟失；有4個(gè)黑腹果蠅EcKL分別和多個(gè)橘小實(shí)蠅EcKL聚支（橙色），暗示這些橘小實(shí)蠅EcKL在進(jìn)化中可能發(fā)生了復(fù)制或擴(kuò)張；有24個(gè)橘小實(shí)蠅EcKL僅在種內(nèi)聚支（藍(lán)色），支系內(nèi)不包括黑腹果蠅EcKL，說(shuō)明這些基因?yàn)殚傩?shí)蠅物種特異性EcKL；另有7個(gè)黑腹果蠅EcKL在其種內(nèi)聚支（綠色），支系內(nèi)不包括橘小實(shí)蠅EcKL（圖5）。

橘小實(shí)蠅59個(gè)EcKL基因中，有49個(gè)在外周神經(jīng)組織和腦組織表達(dá)（TPM≥1），10個(gè)不表達(dá)（TPMlt;1），根據(jù)TPM將這些基因分為高表達(dá)基因（TPM≥20）、中表達(dá)基因（10≤TPM＜20）和低表達(dá)基因（1≤TPM＜10）；在雌性和雄性腦組織中，高表達(dá)EcKL基因分別有28個(gè)和29個(gè)，相較于其他部位占比最高，占腦組織中表達(dá)的全部EcKL基因的62%和63%，暗示EcKL基因在腦組織中可能發(fā)揮重要功能。另外，BdorEcKL39在腦組織中特異性表達(dá)，BdorEcKL36、BdorEcKL38在腦組織中表達(dá)量最高，在外周神經(jīng)組織中低表達(dá)或不表達(dá)。在外生殖器組織中雌雄顯著差異表達(dá)的EcKL基因占比最高，有36個(gè)，占在該部位表達(dá)的全部EcKL基因的82%，暗示EcKL基因在外生殖器組織中可能發(fā)生了性別間功能分化；BdorEcKL4、BdorEcKL13、BdorEcKL41、BdorEcKL42、BdorEcKL44、BdorEcKL45、BdorEcKL49、BdorEcKL50在腦組織及外周神經(jīng)組織中均為高表達(dá)基因，暗示這些基因在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能（圖6）。

2.5橘小實(shí)蠅卵黃原蛋白基因家族分析

橘小實(shí)蠅全基因組中共注釋到11個(gè)Vg候選基因，獲得了完整的開(kāi)放閱讀框（表5）。與黑腹果蠅相比，實(shí)蠅Vg基因家族有明顯的擴(kuò)張。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)可將實(shí)蠅Vg分為5個(gè)亞類，其中只有2個(gè)亞類與黑腹果蠅Vg聚支。在實(shí)蠅科物種中，同一物種的多數(shù)Vg在進(jìn)化樹(shù)中分布較分散，表明種內(nèi)保守型不高。在橘小實(shí)蠅中，BdorVg5、BdorVg9和BdorVg10單獨(dú)聚為一支，未與黑腹果蠅及其他實(shí)蠅物種的Vg聚支，表明這3個(gè)Vg同源性較高且具有物種特異性；除上述3個(gè)Vg外，其他橘小實(shí)蠅Vg均與實(shí)蠅物種的Vg良好聚支（圖7）。

橘小實(shí)蠅外周神經(jīng)組織和腦組織中共有9個(gè)Vg基因表達(dá)。對(duì)于雌成蟲(chóng)，觸角、口器、前足、外生殖器中高表達(dá)的Vg基因占比最高，達(dá)到67%。其中Bdor Vg1.1、Bdor Vg1.2、Bdor Vg2、Bdor Vg3、Bdor Vg9在雌成蟲(chóng)腦及外周神經(jīng)組織中均為高表達(dá)基因。雄性成蟲(chóng)在口器組織中高表達(dá)Vg基因有6個(gè)，其他部位僅有1～3個(gè)；其中BdorVg3在兩性腦及外周神經(jīng)組織中均為高表達(dá)基因，BdorVg6、Bdor Vg7和Bdor Vg8僅在雄蟲(chóng)口器組織中表達(dá)（圖8）。

3結(jié)論與討論

昆蟲(chóng)交配后雌蟲(chóng)會(huì)產(chǎn)生一系列明顯的行為變化，如性接受程度降低、趨向性發(fā)生變化、產(chǎn)卵量增加等，本研究中，雌成蟲(chóng)初次交配后次日再次交配的成功率顯著下降，雄性生殖因子進(jìn)入雌性體內(nèi)是導(dǎo)致這些行為變化的主要原因。有研究表明，多數(shù)橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)一生僅交配1～2次。實(shí)蠅雌蟲(chóng)完成一次交配后往往存在一段時(shí)間的生理不應(yīng)期，在這一段時(shí)間內(nèi)雌蟲(chóng)會(huì)拒絕雄蟲(chóng)的求偶，不與其發(fā)生交配。而雄蟲(chóng)通常可以連續(xù)進(jìn)行多次交配，且雄蟲(chóng)獲得后代的數(shù)量與其交配過(guò)的雌蟲(chóng)的數(shù)量密切相關(guān)。在實(shí)蠅類昆蟲(chóng)中，往往會(huì)存在雌雄間的性沖突問(wèn)題，即雄蟲(chóng)渴望與更多的雌蟲(chóng)交配，而雌蟲(chóng)則因?yàn)椴荒軓亩啻蔚慕慌渲蝎@益，會(huì)拒絕多余的交配。有研究發(fā)現(xiàn)，橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)產(chǎn)卵后可以再次交配。本研究?jī)H對(duì)雌性交配后產(chǎn)卵前的行為進(jìn)行觀察，雌性產(chǎn)卵后行為變化機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配后腦部細(xì)胞色素P450基因、葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移酶基因等免疫相關(guān)基因顯著上調(diào)，這表明橘小實(shí)蠅雌性交配后免疫反應(yīng)可能增強(qiáng)，這種現(xiàn)象在黑腹果蠅中也有報(bào)道，其原因是交配過(guò)程中相關(guān)性肽的轉(zhuǎn)移可以激活雌性的免疫反應(yīng)。因此我們推測(cè)橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配后免疫相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)同樣是由性肽調(diào)控的。這類免疫基因的上調(diào)被認(rèn)為是雌性的交配成本之一，可能是來(lái)源于兩性之間的性拮抗作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，雌蟲(chóng)腦組織中交配后下調(diào)最顯著的基因?yàn)榱姿嵯┐急狒燃っ福≒EPCK）基因，該基因編碼的酶參與糖異生途徑，介導(dǎo)非糖物質(zhì)向糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化。另外，雌蟲(chóng)交配后腦組織中顯著下調(diào)的基因顯著富集到多個(gè)糖類物質(zhì)代謝通路，例如半乳糖代謝通路、戊糖和葡萄糖鹽酸的相互轉(zhuǎn)化通路（圖3）。這些基因的表達(dá)量顯著下調(diào)暗示橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配后腦組織對(duì)糖分的需求下降，我們推測(cè)交配后雌蟲(chóng)可能需要將更多的能量分配到腹部來(lái)維持胚胎形成以及產(chǎn)卵，導(dǎo)致了腦部對(duì)糖類的需求量降低。

本研究發(fā)現(xiàn)，橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配后腦部上調(diào)最顯著的5個(gè)基因有3個(gè)屬于EcKL基因家族。昆蟲(chóng)EcKL參與昆蟲(chóng)對(duì)植物次生代謝物的解毒代謝。例如，黑腹果蠅EcKL基因與咖啡因耐受性有關(guān)，可能通過(guò)磷酸化介導(dǎo)黑腹果蠅對(duì)咖啡因的解毒代謝。咖啡因存在于多種植物中，包括橘小實(shí)蠅的寄主植物如柑橘，被認(rèn)為是一種昆蟲(chóng)拒食劑。橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配后需要在寄主植物上進(jìn)行產(chǎn)卵，雌成蟲(chóng)產(chǎn)卵刺傷寄主果實(shí)并從中獲取食物，腦部作為神經(jīng)中樞，其中多個(gè)EcKL基因顯著上調(diào)，可能與橘小實(shí)蠅響應(yīng)寄主植物次生代謝物有關(guān)。另外有研究發(fā)現(xiàn)，EcKL介導(dǎo)蛻皮類固醇的可逆磷酸化，這與昆蟲(chóng)胚胎發(fā)生和繁殖過(guò)程中的蛻皮類固醇循環(huán)有關(guān)。此外，蛻皮激素與雙翅目昆蟲(chóng)卵黃蛋白合成有關(guān)，影響卵的數(shù)量和質(zhì)量。因此我們推測(cè)EcKL基因還可能參與橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)交配后卵的發(fā)生和發(fā)育過(guò)程。

昆蟲(chóng)的卵黃原蛋白（Vg）是胚胎發(fā)育的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，它在胚胎發(fā)生時(shí)分解為小分子多肽和氨基酸，為胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)和功能性物質(zhì)。研究表明，昆蟲(chóng)的交配行為會(huì)影響Vg基因的表達(dá)，例如蜱蟲(chóng)Dermacentor variabilis和黑毛蟻Lasius niger蟻后在交配后Vg基因表達(dá)量上調(diào)。Vg主要由脂肪體合成，該組織主要分布在昆蟲(chóng)的腹部、胸部和頭部，其中腹部脂肪體最為發(fā)達(dá)。在黑腹果蠅和家蠅Musca domestica中，卵巢是合成Vg的主要部位。本研究在橘小實(shí)蠅中也發(fā)現(xiàn)了交配后Vg基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，不同的是，這種上調(diào)發(fā)生在腦部。此外，Vg基因可能通過(guò)其他途徑參與行為調(diào)控，例如在Vg受體基因被敲除的雌性寄生蜂中，產(chǎn)卵和寄生率下降，與嗅覺(jué)感受相關(guān)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄組顯著下調(diào)。這些研究表明，雌性交配后腦部Vg基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)可能有多種原因：Vg在腦部的脂肪體中合成后經(jīng)血淋巴輸送到卵巢，為胚胎提供營(yíng)養(yǎng)；另外，保幼激素介導(dǎo)Vg的合成，交配后腦部Vg表達(dá)上升，而Vg又可以抑制保幼激素水平，兩者形成動(dòng)態(tài)平衡，這種激素水平的變化可能與橘小實(shí)蠅交配前后的行為差異有關(guān)。因此，未來(lái)研究應(yīng)進(jìn)一步探索Vg在特殊組織中的潛在功能，為發(fā)現(xiàn)新的機(jī)制和應(yīng)用目標(biāo)提供基礎(chǔ)。

本研究利用基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)橘小實(shí)蠅交配后觸角和腦部表達(dá)量變化的基因進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，并對(duì)EcKL和Vg兩類關(guān)鍵差異表達(dá)基因的基因家族成員、作用和表達(dá)模式進(jìn)行了分析，并討論這些基因和繁殖的潛在關(guān)系。本研究為進(jìn)一步研究調(diào)控橘小實(shí)蠅交配行為的關(guān)鍵基因及開(kāi)發(fā)相關(guān)防控技術(shù)提供了基礎(chǔ)，并有可能促進(jìn)更加有效和生態(tài)友好的害蟲(chóng)防治策略的發(fā)展。