桃蚜幾丁質(zhì)合成酶1基因的分子特征及其生物學(xué)功能分析

摘要 桃蚜Myzus persicae是重要的農(nóng)業(yè)害蟲。本研究分析了桃蚜幾丁質(zhì)合成酶1（chitin synthase 1，CHS1）基因MperCHS1的序列特征，通過實時熒光定量PCR測定了MperCHS1基因在不同發(fā)育階段的表達模式，利用病毒介導(dǎo)的基因沉默（vlrus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)解析了MperCHS1的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，MperCHS1含有19個外顯子，開放閱讀框為4707bp，其編碼的蛋白具有保守的幾丁質(zhì)合成酶結(jié)構(gòu)域，且與豌豆蚜CHS1親緣關(guān)系最近。Mper CH S1在1齡若蟲期表達量最低，而在2齡和3齡若蟲期表達量最高。沉默MperCHS1后48、72、96h和120h，桃蚜存活率分別下降至68.6%、57.1%、50.48%和49.2%。此外，沉默MperCHS1導(dǎo)致41.7%的若蚜無法正常蛻皮，雌成蚜的產(chǎn)蚜量也顯著減少。本論文明確了Mper CHS1在桃蚜生長發(fā)育和生殖中的重要功能，研究結(jié)果為開發(fā)基于MperCHS1基因沉默的桃蚜新型防治技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 桃蚜；幾丁質(zhì)合成酶；序列分析；表達模式；RNA干擾

中圖分類號：S 435. 72 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2024162

桃蚜Myzus perszcae屬半翅目Hemiptera蚜科Aphididae，是世界性分布的重要農(nóng)業(yè)害蟲，能為害桃樹、煙草、蔬菜等400余種植物。桃蚜在植物葉片背面刺吸汁液，造成葉片卷縮失綠，并且分泌蜜露，誘發(fā)煤污病。更為嚴重的是，桃蚜能傳播100余種植物病毒，造成作物減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。目前，化學(xué)防治仍然是控制桃蚜種群數(shù)量的主要手段。但化學(xué)殺蟲劑的長期使用已經(jīng)使桃蚜對多種藥劑（如有機磷類、擬除蟲菊酯類和新煙堿類殺蟲劑）產(chǎn)生了抗性。因此，亟須研發(fā)新型防治技術(shù)，用于桃蚜的可持續(xù)治理。

幾丁質(zhì)是昆蟲體壁和中腸圍食膜的主要組成成分之一，幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase，CHS）是幾丁質(zhì)生物合成途徑的關(guān)鍵酶。在鱗翅目Lepi-doptera、鞘翅目Coleoptera和直翅目Orthoptera等昆蟲中，CHS有2種，其中CHS1（或稱CHS-A）主要合成昆蟲體壁和氣管中的幾丁質(zhì)，而CHS2（或稱CHS-B）主要在圍食膜的幾丁質(zhì)合成中發(fā)揮作用。但是，在褐飛虱Nilaparvata lugens和灰飛虱Laodelphax striatellus中，目前只發(fā)現(xiàn)了CHS1而未發(fā)現(xiàn)CHS2。由于幾丁質(zhì)合成酶基因為無脊椎動物特有，因此被認為是潛在的RNA干擾（RNA interference，RNAi）靶標。例如，利用RNAi沉默東亞飛蝗Locusta migratorisria manilensis、茄二十八星瓢蟲Henosepilachna

vigintiocto punctata和稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis的CHS1或CHS2基因之后，昆蟲不能正常蛻皮，并產(chǎn)生致死表型。在轉(zhuǎn)基因植物中表達靶向昆蟲CHS1基因的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA），昆蟲取食這些植物后存活率顯著降低。此外，通過納米載體介導(dǎo)的CHS1基因沉默也在草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda和德國小蠊Blattella germanica等害蟲的防治中取得了較好效果。

在利用RNAi研究蚜科昆蟲基因功能的研究中，大多采用注射法和飼喂法。但注射法會造成蚜蟲機械損傷，而飼喂法通常使用Parafilm膜包裹液體飼料，無法模擬蚜蟲自然取食行為。病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是近年興起的一種RNAi研究技術(shù)，該技術(shù)利用病毒載體在植物中表達靶向昆蟲特定基因的dsR-NA，具有操作簡單、dsRNA表達量穩(wěn)定、能模擬昆蟲自然取食等特點，已在豌豆蚜Acyrthosiphon pi-sum，、煙粉虱Bemisia tabaci和西花薊馬Fran-kliniella occidentalis基因功能的研究中得到應(yīng)用。

本研究利用生物信息學(xué)分析、實時熒光定量PCR和VIGS等技術(shù)，對桃蚜MperCHS1的序列特征、表達模式和生物學(xué)功能進行分析，以期為開發(fā)以Mper CHS1為靶標的桃蚜可持續(xù)治理技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試昆蟲與煙草

桃蚜采集于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)萃園甘藍田，在人工氣候室內(nèi)以盆栽煙草（品種為‘云煙87’）為寄主飼養(yǎng)多代，期間未接觸任何殺蟲劑。飼養(yǎng)條件為溫度（25±2）℃，RH（60±5）%，光周期L∥D=16h∥8h。本氏煙Nicotiana benthamiana在（25±2）℃、RH （60±5）%和光周期L∥D=16h∥8h下培養(yǎng)，挑選6～7片真葉的健康植株試驗。

1.2MperCHS1基因鑒定與序列分析

根據(jù)豌豆蚜CHS1的氨基酸序列，使用tblastn程序，從桃蚜轉(zhuǎn)錄組中檢索Mper CHS1的cDNA序列，使用ORFfinder程序（https：∥www.ncbi.nlm nih.gov／orffinder/）預(yù)測MperCHS1的開放閱讀框。下載桃蚜基因組序列，使用Splign程序（https：∥www.ncbi.nlm.nih. gov／sutils/splign／splign.cgi）分析MperCHS1的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。使用ExPASy （https：∥web.expasy.org／protparam／）和SMART程序（http：∥smart. embl-heidelberg.de／）計算MperCHSl蛋白的理論分子量、等電點并預(yù)測其功能域。多序列連配使用Clustal Omega程序進行（https：∥www.ebi.ac.uk/tools/msa/clusta-lo/），使用MEGA11以鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支置信度使用boot-strap法進行1000次循環(huán)檢驗。

1.3桃蚜幾丁質(zhì)合成酶基因MperCHS1表達模式分析

收集不同齡期桃蚜，分為3組（3次生物學(xué)重復(fù)），每組均包含1齡（100頭）、2齡（60頭）、3齡（30頭）和4齡若蚜（30頭）以及無翅雌成蟲（30頭），使用RNAiso Plus試劑（寶生物，大連）提取桃蚜各蟲態(tài)總RNA。使用4×HifairⅢSuperIix plus反轉(zhuǎn)錄試劑盒（翌圣生物，上海）合成cDNA。

基于MperCH S1開放閱讀框設(shè)計特異性引物（表1），以桃蚜轉(zhuǎn)錄延伸因子la（elongation factor 1α，EF1α）和核糖體蛋白L7（ribosomal protein L7，RPL7）基因作為內(nèi)參基因，進行實時熒光定量PCR（CFX96，Bio-Rad，美國）分析。在預(yù)試驗中，使用梯度稀釋的cDNA模板計算各引物的擴增效率，并通過熔解曲線和凝膠電泳判斷引物的特異性。PCR反應(yīng)體系（20μL）：Hieff qPCR SYBR GreenIaster Mix（翌圣生物，上海）10μL，上、下游引物（10μmol／L）各0.4μL，cDNA模板1μL，無核酸酶的水8.2μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 1 min; 95℃10 s，60℃ 30s，40個循環(huán)。試驗設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，基因的相對表達量使用Pfaffl法計算。

基因表達水平差異倍數(shù)=（E_目的基因）^△Ct_目的基因／（E_參考基因）^△Ct_參考基因，

式中，E_目的基因和E_參考基因分別為目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率，ΔCt_目的基因為對照組目的基因Ct值減去處理組目的基因Ct值的差值，△Ct_參考基因為對照組內(nèi)參基因Ct值減去處理組內(nèi)參基因Ct值的差值。因本試驗使用2個內(nèi)參基因，故（E_參考基因）△Ct_參考基因為2個內(nèi)參基因的平均值。

1.4重組載體構(gòu)建

設(shè)計基因特異性引物（表1），從Mper CHS1的ORF中擴增一段458 bp的片段，經(jīng)凝膠電泳和DNA片段純化等步驟后，使用ClonExpressⅡ一步法同源重組試劑盒（諾唯贊，南京）將其插入本氏煙基因沉默載體pTRV2（本學(xué)院蔣磊實驗室提供）的Xba Ⅰ和BamH Ⅰ限制酶位點之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，提取質(zhì)粒并進行測序驗證后，獲得pTRV2-MperCHS1重組載體。使用同樣的方法，從綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的ORF中擴增一段717 bp的片段，構(gòu)建pTRV2-GFP重組載體，作為后續(xù)試驗的對照組。

1.5農(nóng)桿菌侵染與dsRNA檢測

參考已報道的文獻進行MperCHS1基因沉默試驗，主要步驟見圖1。將pTRV2-MperCHSl和pTRV2-GFP（對照）重組載體分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101菌株，然后接種到含卡那霉素和利福平的YEB培養(yǎng)液中，28℃、200r／min振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達到0.5～0.6。經(jīng)低速離心后，棄上清，用MMA緩沖液（10mmol／L 2-嗎啉乙磺酸、10 mmol／LMgCl2和200μmol／L乙酰丁香酮）重懸沉淀，并稀釋至OD₆₀₀=0.6。將轉(zhuǎn)化pTRV2-MperCHS1和pTRV2-GFP的農(nóng)桿菌懸浮液分別與轉(zhuǎn)化pTRV1（本學(xué)院蔣磊實驗室提供）的菌液按1：1混合，用無菌注射器（去掉針頭）吸取200～300μL混合菌液，從本氏煙葉片背面注射，每株煙草注射3片葉。使用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測葉片中dsMperCHS1和dsGFP表達情況，從注射后10d開始，每天檢測1次，共檢測5d（引物見表1）。試驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)注射6株煙草。

1.6MperCHS1基因沉默效果檢測與生物測定

確認葉片中dsMperCHSl和dsGFP已表達后（即注射農(nóng)桿菌10 d后），每株煙草選擇1個葉片，每個葉片上放置1個葉籠，移入即將產(chǎn)仔的無翅雌成蚜10頭。24 h后移除成蚜，統(tǒng)計新生的若蚜數(shù)量，挑選若蚜數(shù)量超過30頭的葉片進行后續(xù)試驗。將這些帶有若蚜的煙草分為兩組，一組用于分析Mper CHS1基因沉默情況；另一組進行生物測定。分別收集在表達dsMperCHS1和dsGFP的葉片上取食24、48、72 h和96 h的若蚜，所有若蚜混合提取總RNA，使用實時熒光定量PCR檢測MperCHS1基因表達水平（步驟同1.3）；此外，在接人若蚜后，每日記錄取食表達dsMperCHS1和dsGFP的葉片后的死亡蟲數(shù)，計算死亡率，并觀察試蟲表型。存活的若蚜發(fā)育為雌成蚜后，每個葉籠保留10頭雌成蚜，每隔24 h觀察1次，統(tǒng)計新生若蚜數(shù)量，計算單雌產(chǎn)蚜量。試驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)v9.5進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計[28]。數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，不同發(fā)育期MperCHS1基因表達水平的差異使用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey’s HSD檢驗進行比較，基因沉默試驗中Mper CH S1表達水平、桃蚜存活率和產(chǎn)蚜量的變化采用Student ’s t檢驗進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1MperCHS1序列特征

通過檢索桃蚜轉(zhuǎn)錄組，獲得了MperCHS1的cDNA序列（GenBank登錄號：OR813680）。將MperCHS1的cDNA序列與桃蚜基因組序列進行比對，發(fā)現(xiàn)MperCHS1在基因組中的長度為7070bp，有19個外顯子（圖2a）。MperCHS1的cDNA序列包含1個長度為4707bp的開放閱讀框，編碼由1568個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)IperCHS1，該蛋白質(zhì)的相對分子量為180.39kD，理論等電點為6.24，具有11個跨膜區(qū)（圖2b）。MperCHSl與蚜科4種昆蟲CHS1的氨基酸一致性較高，為98%～99%（圖2c），與蚜科以外的昆蟲CHS1的氨基酸一致性相對較低，為67%～73%。24種昆蟲的CHS分為CHS1和CHS2 2簇，桃蚜MperCHS1在CHS1簇中，且與豌豆蚜CHS1的親緣關(guān)系最近（圖3）。

2.2MperCHS1在桃蚜不同發(fā)育階段的表達模式

MrperCH S1在桃蚜不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異（F_4，10=37.27，Plt;0.0001），其中1齡若蚜期的轉(zhuǎn)錄水平最低；進入2齡和3齡若蚜期后，轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，且2齡和3齡間無顯著差異。4齡若蚜期和成蟲期顯著下降，但仍顯著高于1齡若蚜期的轉(zhuǎn)錄水平（圖4）。

2.3MperCHS1的沉默效果

向本氏煙注射農(nóng)桿菌10 d后，葉片中可檢測到dsMperCHS1 （450 bp）和dsGEP（711bp）的表達（圖5），且注射14d后葉片中仍有大量dsRNA。桃蚜取食表達dsMperCHS1的本氏煙葉片后，其MperCHS1的轉(zhuǎn)錄受到顯著抑制，取食48、72h和96h后，MperCHS1的轉(zhuǎn)錄水平分別下降至對照組（取食表達dsGFP的葉片）的42%、26%和13%（48h：t=5.347，P=0.005 9;72 h：t=6.663，P=0.002 6;96h：t=20.90，Plt;0.0001；df均為4）（圖6）。

2.4沉默MperCHS1對桃蚜存活率與產(chǎn)蚜量的影響

在表達dsMperCHS1的本氏煙葉片上取食24h后，桃蚜的存活率（97.1%）與取食dsGFP的對照組的存活率（99.2%）差異不顯著（df=4，t=0.0212，P=0.9841）。但取食48 h后，桃蚜的存活率（68.6%）顯著低于對照組（df=4，t=8.230，P=0.0012）。隨著取食的持續(xù)，桃蚜存活率進一步下降，取食72、96h和120h后，桃蚜存活率降至57.1%、50.8%和49.2%，而對照組桃蚜存活率均超過97%，兩者差異顯著（72h：t=8.495，P=0.0011；96h：t=8.832，P=0.000 9;120 h：t=9.759，P=0.000 6;df均為4）（圖7a）。在試驗中觀察到，取食dsGFP的若蚜幾乎都能正常蛻皮并發(fā)育為成蚜（圖7b），而取食dsMperCHSl死亡的若蚜中，有41.7%出現(xiàn)不能正常蛻皮的表型（圖7c）。同時發(fā)現(xiàn)，沉默MrperCHS1顯著降低了雌成蟲的產(chǎn)蚜量。取食dsMperCHS1后120h，單雌產(chǎn)蚜量為11.0頭，而對照組為17.2頭，兩者差異顯著（df=4; t=11.65，P=0.0003）（圖8）。

3結(jié)論與討論

本文從桃蚜中鑒定了MperCHS1，分析了該基因的分子特征。同時，在桃蚜基因組只發(fā)現(xiàn)了CHS1而未發(fā)現(xiàn)CHS2，此結(jié)果與已報道的褐飛虱、豌豆蚜和大豆蚜等半翅目昆蟲的研究結(jié)果一致。在東亞飛蝗、稻縱卷葉螟和褐飛虱等昆蟲中，CHS1能夠通過可變剪接產(chǎn)生2個不同的剪接體CHSla和CHS1b，但本研究未發(fā)現(xiàn)MperCHS1存在可變剪接現(xiàn)象。在其他蚜科昆蟲中，也未見到關(guān)于CHS1基因可變剪接的報道。因此，蚜科昆蟲CHS1可能只存在單一類型的轉(zhuǎn)錄本。基于不同昆蟲CHS1的多序列連配結(jié)果，MperCHSl包含一個CHS結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在不同昆蟲中高度保守，具有催化幾丁質(zhì)合成的作用。

MperCHS1在桃蚜1齡若蚜期表達量最低，2齡和3齡若蚜階段表達量顯著增加，4齡若蚜與成蟲階段又顯著下降。這一表達模式與豌豆蚜和大豆蚜CHS1類似，但與白背飛虱Sogatella fur-cifera柑橘木虱Diaphorina citri CHS1等半翅目昆蟲的表達模式存在差異。前人研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲CHS1的表達水平與蛻皮激素含量有關(guān)。桃蚜Mper CHS1是否也具有類似的表達調(diào)控機制，有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，桃蚜取食表達dsMperCHS1的本氏煙葉片能導(dǎo)致MperCHS1沉默，同時MperCHS1被沉默后，桃蚜存活率顯著下降，且出現(xiàn)不能正常蛻皮的表型。這些結(jié)果表明MperCHS1在桃蚜體壁合成及蛻皮過程中具有重要作用。本研究結(jié)果與其他昆蟲CHS1的研究結(jié)果一致，如沉默東亞飛蝗CHS1導(dǎo)致若蟲發(fā)育遲緩、蛻皮異常與蟲體畸形；沉默稻縱卷葉螟和德國小蠊的CHS1也出現(xiàn)了相似的致死表型。在本試驗中還觀察到，沉默MperCHS1顯著降低了桃蚜雌成蟲的產(chǎn)蚜量，推測MperCHS1在桃蚜生殖過程具有重要功能。在其他蚜蟲種類中也觀察到類似現(xiàn)象，如沉默CHS1會抑制豌豆蚜胚胎發(fā)育。

本研究明確了桃蚜MperCHS1的序列特征，證明了沉默MperCHS1會阻礙桃蚜蛻皮，顯著降低桃蚜存活率并影響其生殖，表明Mper CHS1可以作為潛在的RNAi靶標，應(yīng)用于新型核酸農(nóng)藥的開發(fā)?？紤]到桃蚜lVIperCHS1與其他昆蟲CHS1序列同源性較高，在設(shè)計dsRNA時，需選擇序列一致性較低的區(qū)域，盡可能地提高對非靶標生物的生態(tài)安全性。