基于轉錄組研究哈茨木霉WF2誘導的煙草抗病分子機制

摘要 為了深入探究哈茨木霉WF2誘導煙草抗病性的分子機制，利用轉錄組測序技術與熒光定量PCR技術，將經過哈茨木霉WF2處理的煙苗與對照的轉錄組進行對比與分析。結果發現，WF2處理共誘導了377個差異表達基因（DEGs），其中341個DEGs上調表達，36個DEGs下調表達。通過對差異表達基因進行GO和KEGG富集分析，發現WF2主要誘導乙烯（ET）信號通路和MAPK信號通路相關基因的上調表達，其中包括大量植物防御抗性相關基因，如編碼ERF、WRKY、TGA等轉錄因子的基因。此外，哈茨木霉WF2還誘導了非生物脅迫相關的信號調節因子如DREB、CRK、PYL等的上調表達。

關鍵詞 哈茨木霉；轉錄組分析；煙草

中圖分類號：S 476 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2024183

我國是世界上最大的煙草生產國和消費國，在整個國民經濟體系中，煙草占據著重要地位。但隨著區域性環境變化和耕作制度的變遷，威脅煙草安全生產的土傳病害日益嚴重。鐮刀菌Fusariumspp.引起的煙草根腐病是近年來危害我國煙草最嚴重的根莖類病害之一。據報道，煙草根腐病的病原菌主要有尖孢鐮刀菌F.oxysporum、腐皮鐮刀菌F.solani、半裸鐮刀菌F.semitectum、木賊鐮刀菌F.eguiseti和共享鐮刀菌F.commune。不同地域引起該病害的致病菌存在差異。當前針對該類病害的防治手段主要包括農業防治、化學防治和生物防治。其中，生物防治因其高效、安全、無殘留等優點，已逐漸成為防治煙草土傳類病害的研究熱點。

木霉屬Trichoderma spp.真菌是目前國內外研究應用最廣泛的一類生防真菌。木霉對多種作物具有預防病害和促進生長的作用，可有效應用于農業生產實踐。目前已有較多報道證明，木霉可以抑制Fusarium spp.引起的包括煙草、洋蔥、香蕉、花生等作物的根腐病、莖基腐病等多種土傳病害。木霉能夠通過直接作用機制（真菌寄生以及產生裂解酶、抗生物質、爭奪空間或養分）或間接作用機制（誘導植物防御）來減少病原體引起的植物病害。木霉通過與植物互作，可以改變植物基因的表達水平，進而使植物獲得對病害和逆境的抗性。Doris等通過轉錄組分析發現，使用棘孢木霉T.asperellum 7316孢子懸浮液處理蓖麻幼苗后，蓖麻應激和防御相關的基因發生了改變，導致促進茉莉酸（jasmonic acid，JA）介導的誘導系統抗性（induced systemlc resistance，ISR）的相關基因上調。Yan等在對哈茨木霉T.harzianum處理后的花生進行轉錄組分析時發現，處理后的差異表達基因主要富集在苯丙烷生物合成和植物一病菌互作通路和激素信號轉導途徑。

先前的研究大多集中在木霉的真菌寄生、抗菌物質的分泌等直接抑菌作用上，但有關木霉參與植物抗性的信號途徑，特別是其在植物系統抗性中的作用，近年來已成為生物防治基礎研究的熱點。通過轉錄組測序可以獲得菌株在RNA水平基因表達的相關信息，從而獲得不同處理的基因差異表達情況。本實驗室在前期篩選出了1株哈茨木霉WF2，通過對峙試驗表明其對煙草疫霉Phytophthora nicotianae和尖孢鐮刀菌具有較好的拮抗效果，后續盆栽試驗也驗證了該菌株對煙草黑脛病具有較好的生防效果。本研究通過使用哈茨木霉WF2對煙苗進行處理，以無菌水處理的煙苗作為空白對照，并對處理后的煙苗植株的轉錄組數據進行分析，旨在挖掘煙草中的關鍵差異表達基因（differentially ex-pressed genes，DEGs），以明確哈茨木霉WF2與煙草互作從而誘導煙草產生相關防御反應的機理，最大限度地挖掘木霉的應用潛力，為其在生物防治的應用推廣提供理論基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

哈茨木霉WF2，中國典型培養物保藏中心專利微生物保藏號（CCTCC No.）：M 20221307。

1.1.2培養基

馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）培養基：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂18g、蒸餾水1L，pH 7.0。

馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDB）培養基：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1L，pH 7.0。

木霉發酵培養基：麩皮50g、蒸餾水1L，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1木霉孢子粉制備及接種處理

制備木霉菌劑：使用無菌打孔器（直徑5mm）在WF2菌株的菌落邊緣打取菌餅，在每瓶PDB培養基中放置1塊菌餅，于28℃、150r／min振蕩培養48h，獲得WF2種子液。以10%的接種量將WF2種子液接種于發酵培養基中，于28℃培養箱中培養15d。將發酵完成的培養基于45℃烘箱烘干水分后，粉碎機打碎成粉劑備用，即得到WF2菌劑。

稱取20g的WF2菌劑，加入2000 mL無菌水制備WF2的菌劑稀釋液。待煙苗（‘云煙87’）生長至6葉期時，處理組在煙苗根部灌入20mL WF2菌劑稀釋液，以20 mL無菌水灌根作為對照，每組共設置72株煙苗。生長8d后，采集處理組（WF2）和對照組（CK）同一葉位的葉片，12片，每組進行3次重復，采集共36片葉片，立刻使用干冰保存，交武漢貝納基因科技有限公司進行轉錄組測序。

1.2.2總RNA提取、轉錄組文庫的構建和測序

使用R6827 Plant RNA Kit提取總RNA，采用瓊脂糖電泳檢測樣品是否有降解以及RNA片段大小，用Nanodrop檢測RNA純度，用Qubit對RNA進行精確定量。RNA樣品檢測合格后，使用Oli-godT磁珠富集mRNA，然后進行片段化，之后反轉錄合成cDNA第一鏈，再合成cDNA第二鏈，再經末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。文庫檢測合格后，按照有效濃度及目標下機數據量的需求將不同文庫混合至層流流動腔，cBOT成簇后使用Illumina高通量測序平臺Illumina NovaSeq進行測序。

1.2.3測序結果的處理

由于原始測序數據可能包含低質量序列、接頭序列等，為了保證信息分析結果的可靠性，原始測序數據需要去除N堿基含量超過5%的reads、低質量（質量值≤5）堿基數目達到50%的reads、有接頭污染的reads、長度小于30bp的reads，以及PCR擴增造成的重復序列，得到clean reads，以FASTQ格式存儲。計算Q20、Q30和GC含量。

使用Star軟件（版本：2.7.9a；參數：default）構建基因組索引，將過濾后的轉錄組序列與參考基因比對，并進行統計。使用DESeq2軟件（1.26.0）進行差異表達基因分析。篩選閾值為P_adj＜0.05且｜log2 fold change｜＞1。采用clusterProfiler軟件（版本：3.14.3）對差異表達基因進行GO和KEGG富集分析，以P_adj＜0.05為顯著富集條件。

1.2.4實時熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證

為了進一步驗證轉錄組測序數據的準確性，我們選取了煙草防御基因中具有代表性的7個差異表達基因進行RT-qPCR分析，并且選擇煙草tubulin作為內參基因。所用引物列于表1。使用All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperIix for qPCR （One-Step gDNA Removal）將提取的RNA反轉錄為cDNA，由美國ABI QuantStudio 1實時熒光定量PCR系統進行RT-qPCR反應。反應體系為cDNA模板2μL，正、反向引物（10μmol／L）各1μL，PerfectStart（R） Green qPCR SuperMix（+DyeⅡ）10μL，補足ddH₂O至20μL。反應程序：94℃2 min；94℃5s，60℃30 s，45個循環；65～95℃，每個循環上升0.5℃，持續5s。每個樣品3次生物學重復。

2結果與分析

2.1 RNA-seq數據質量統計與分析

測序結果顯示，每個樣本的測序原始數據在43.33～43.38M不等，對原始數據進行過濾后，獲得42.86～43.00M過濾讀長，Clean reads數據占Raw reads的比例在99%以上，Q20和Q30分別在98%和94%以上，樣品比對參考基因組的唯一分布的讀長也均在72%以上，表明RNA-seq的測序結果質量較好，可用作后續分析（表2）。對樣品的相關性進行分析，結果表明，各組間的Pearson相關性系數都在0.83以上，表明各組內具有較高的重復性。

2.2差異表達基因分析

對木霉處理組（WF2）和對照組（CK）進行了差異表達基因（DEGs）篩選，經閾值（P_adjlt;0.05且｜log2 fold change｜gt;1）篩選一共得到377個DEGs，其中341個基因（占總DEGs的90.5%）上調表達，36個基因下調表達（9.5%）。

2.2.1 GO富集分析

GO （gene ontology）數據庫根據基因功能分為細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物過程（biological process）3個類別。對所有差異基因進行GO功能富集分析，圖1顯示的為顯著富集的前20個條目。結果表明，差異基因表達高度集中在生物過程（共11個條目），其次為分子功能（共6個條目），最后為細胞組分（共3個條目）。在生物過程中，DEGs主要富集在乙烯激活的信號通路（ethylene-activated signaling pathway）、花粉識別（recognltlon of pollen）和蛋白去磷酸化（protein dephosphorylation）等條目上；在分子功能中，DEGs主要富集在序列特異性DNA結合（se-quence-specific DNA binding），鈣離子結合（calci-um ion binding）和絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸蛋白激酶活性（protein-serine/threonine／tyrosine kinaseactivity）等條目上；在細胞組分中，DEGs主要富集在細胞外空間（extracellular space）、膜的錨定成分（anchored component of membrane）和CCR4-NoT核心復合物（CCR4-NoT core complex）等條目。

2.2.2KEGG富集分析

在KEGG pathway數據庫中，將生物代謝通路劃分為7類，包括新陳代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic information processing）、環境信息處理（environmental information processing）、細胞過程（cellular processes）、生物系統（organismal sys-tems）、人類疾病（human diseases）和藥物開發（drugdevelopment）。對所有DEGs進行KEGG數據庫富集分析，共富到到36條通路，圖2為DEGs顯著富集的前20條通路。結果表明，DEGs主要富集在MAPK信號通路-植物（MAPK signaling pathway-plant）、肌醇磷酸代謝（inositol phosphate metabo-lism）、抗壞血酸與醛酸代謝（ascorbate and aldarate metabolism）、植物激素信號轉導（plant hormone signal transduction）、倍半萜和三萜生物合成（ses-quiterpenoid and triterpenoid biosynthesis）、β-丙氨酸代謝（beta-alanine metabolism）、精氨酸和脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism）、磷脂酰肌醇信號系統（phosphatidylinositol signaling system）和RNA降解（RNA degradation）等通路。

2.3RT-qPCR驗證

為了驗證RNA-seq數據的準確性，挑選了7個差異表達基因進行RT-qPCR驗證。結果表明，這7個DEGs的表達趨勢與RNA-seq的結果一致，均為上調表達（圖3），表明轉錄組的測序結果可靠。

2.4哈茨木霉WF2誘導煙苗抗性的關鍵通路及基因分析

2.4.1乙烯激活的信號通路

乙烯（ethylene，ET）作為一種植物激素，在植物的抗病反應中起著重要作用。乙烯激素途徑是防御基因表達的重要調節劑。通過植物激素茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯介導，可以誘導植物獲得誘導性系統抗性（induced systemic resistance，ISR）。與對照相比，煙苗經過哈茨木霉WF2處理后，其乙烯激活通路中共有23個差異表達基因，且均為上調表達。主要編碼乙烯響應因子（ethylene response factor，ERF）、脫水響應結合蛋白（dehydration-respon-sive element-binding protein，DREB）、WRKY轉錄因子家族（包括WRKY17、WRKY31、WRKY41、WRKY11、WRKY40）、TGA7轉錄因子、scarecrow-like 14（SCL14）蛋白（推定）等，上調倍數在2.26～22.08倍。

2.4.2MAPK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是真核生物中非常保守且研究比較深入的信號傳導路徑。MAPK信號通路廣泛參與了植物模式識別受體（pat-tern recognition receptors，PRRs）介導的防御反應。與對照（CK）相比，煙苗經過哈茨木霉WF2處理后，其MAPK信號通路中共有20個差異表達基因，且均為上調表達。這些差異表達基因主要集中在編碼WRKY轉錄因子家族（包括WRKY26、WRKY7、WRKY22、WRKY24、WRKY53、WRKY33）、富含半胱氨酸類受體蛋白激酶10（cystelne-rich receptor-like protein kinase 10，CRK 10）、G型凝集素S受體樣絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（G-type lectin S-recep-tor-like serine／threonlne protein kinase， GsSRK）、脫落酸受體PYL4（abscisic acid receptor PYL4，ABAreceptor PYL4）、1-氨基環丙烷-1-羧酸合酶，即ACC合酶（1-minocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACC synthase）、類鈣調蛋白45（calcium-bindingprotein 45，CML45）、MAP3K激酶YODA（mitogen-activated protein kinase kinase kinase YODA，MAP3KYODA），MAP激酶底物1（MAP kinase substrate 1，MS1）等。上調倍數在2.12～35.87倍。

3結論與討論

目前，學者們不斷探索木霉自身的生防機制，例如產生裂解酶（幾丁質酶、葡聚糖酶和蛋白酶）、次級代謝產物、爭奪空間和獲取營養物質等。然而，對木霉衍生分子在植物免疫中的作用的關注相對較少。木霉可以通過多種機制促進植物生長和防御，并且木霉可以分泌類似植物激素的化合物或改變植物中的激素水平，從而改變植物的生長和防御能力。

植物激素介導的信號轉導途徑，包括JA、SA和ET等信號途徑在植物抵抗逆境脅迫中起著非常重要的作用。木霉可以通過激活植物中的JA和ET信號轉導或代謝使植物獲得誘導系統抗性（ISR），有時還可以誘導系統獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）。Mukesh等使用棘孢木霉和哈茨木霉處理辣椒種子后，提高了植物維管組織壁的木質化，并且還誘導了如植物防御素1.2（Ca PDF1.2）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APx）、愈創木酚過氧化物酶（GPx）、病程相關蛋白PR-2和PR-5的上調表達。Rashidul等在將近洋大戟草木霉T.parauiridescens （BDISOF67）、水稻內生木霉T.erinaceum （BDISOF91）、棘孢木霉T.as-perellum （BDISOF08、BDISOF09）4種木霉制成的粉劑噴灑在水稻葉面后，發現所有木霉都提高了與SA和JA途徑相關的核心防御相關酶的表達，如苯丙氨酸解氨酶（phenylalamine ammonia lyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和過氧化物酶（peroxi-dase，POD），并且顯著降低了水稻的病斑長度。

本研究使用哈茨木霉WF2孢子液對煙苗進行灌根，并進行轉錄組測序。結果發現，與對照組相比，WF2處理后，差異表達基因主要集中在ET信號通路和MAPK信號通路，表明WF2很可能通過影響煙苗的這些代謝通路誘導相關防御基因的表達。在ET信號通路中，處理組煙葉中的ERF基因表達量上調，而ERF已在各種植物中被證明通過調節脅迫響應基因在響應各種脅迫（如低溫、干旱、高鹽、抵御病原體）中發揮重要作用。處理組中WRKY轉錄因子家族中的WRK Y17、WRKY31、WRKY41、WRKY11、WRKY40表達量均出現上升。WRKY轉錄因子參與調控乙烯的生物合成和信號轉導，已有文獻表明，WRKY轉錄因子在植物防御反應相關基因的調節中具有重要作用。此外，TGA7轉錄因子的表達量也出現上升，TGA7是TGA轉錄因子家族的重要成員，主要與病程相關基因非表達子1（nonexpressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1）相互作用來調控病程相關蛋白（pathogenesis-related protein，PR）基因表達從而調節植物免疫。除了提高煙葉的抗生物脅迫能力外，處理組的DREB基因表達量也出現上升，而DREB轉錄因子屬于AP2／ERF轉錄因子家族的一個亞家族，可以響應極端溫度、高鹽和干旱脅迫，對于提高植物在多種逆境條件下的耐受性具有重要作用。

在MAPK信號通路中，除了WRKY轉錄因子家族的基因表達量提高外，編碼CRK 10、GsSRK、ACC合酶、MAP3K、MKS1、CML等蛋白酶類基因的表達量均顯著提高。CRK是類受體蛋白激酶（receptor-like kinase，RLK）亞家族成員之一，其可以通過調節防御激素信號轉導途徑參與植物抗病，還可以參與植物響應多種非生物逆境脅迫，包括干旱、高鹽、氧化還原應激反應等。推測CRK 10與水稻中的CRK 10作用相同，CRK 10受NH1基因表達調控，并且與TGA相互作用，從而激活下游的防御基因。GsSRK是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，該蛋白激酶之前被鑒定為大豆轉錄組譜中假定的鹽堿脅迫相關基因。CML是一種重要的Ca²⁺結合蛋白，可以激活活性氧（ROS）和NO的產生，從而誘導超敏反應和防御基因的表達。

綜上，本研究通過轉錄組測序技術分析了哈茨木霉WF2誘導煙苗植株產生防御過程中的差異表達基因，結果表明：哈茨木霉WF2誘導了ET信號通路和MAPK信號通路中相關基因的上調表達，比如誘導各類與防御激活相關的轉錄因子，如ERF、WRKY、TGA轉錄因子等。通過增強ET途徑的信號轉導，進一步誘導煙苗獲得ISR。本文為進一步研究木霉與植物互作的生防機制提供依據。