無患子‘粵碩菩提’葉斑病病原菌鑒定及其生物學特性

摘要 ‘粵碩菩提’是高產優質的無患子無性系新品種，而無患子葉斑病的普遍發生會威脅無患子的良種化推廣。本研究采用組織分離法分離病原菌，對分離菌株進行致病性測定和形態學觀察，并應用ITS、LSU、β-tub、rbp2基因序列對其進行分子生物學鑒定，同時對病原菌的生物學特性進行測定。結果表明，分離得到的3個代表菌株YS2-8、YS2-9、YS2-13均為Didymella segeticola，是無患子葉斑病的新記錄病原菌。病原菌生長最適宜的培養基為PCA，最適宜生長溫度為20～25，pH為7、連續光照條件利于其生長，病原菌菌絲致死溫度為55℃。本研究結果為深入研究無患子‘粵碩菩提’葉斑病發生流行規律及后續科學防控奠定基礎。

關鍵詞 無患子科；亞隔孢殼屬；分子鑒定；新病害；生物學特性

中圖分類號：S 436.85 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2024116

無患子Sapindus sa ponaria是熱帶和亞熱帶地區廣泛分布的生物質能源樹種，被廣泛應用于生物醫學、生物能源和生物日化等領域。無患子全株（根、莖、葉、果）可入藥，其種仁含油率高達35%以上，可用于生物柴油的制備，是重要的木本油料樹種。無患子功能效益多元，綜合利用價值高，其在中國南方大部分地區廣泛種植，但隨著無患子產業的發展及規模化純林種植模式的普及，病害問題日益顯現。葉斑病在福建順昌縣、建寧縣等無患子種植基地普遍發生，病菌可借風雨擴散，導致附近植株乃至整個種植區內所有苗木和林分感病，尤以實生苗發病最重。無患子葉斑病的發生呈現逐年加重的趨勢，影響無患子林分的健康生長。

目前國內外對無患子病害的研究多集中于煤污病、潰瘍病、冠癭病、葉斑病等病害的病原菌鑒定、危害等方面。近年來，葉斑病因其發病率高、流行廣泛而備受關注，相關研究主要集中于病原菌的鑒定方面。而無患子葉斑病在不同地區可能由不同病原菌引起。福建順昌縣無患子葉斑病的病原菌是矮喬木炭角菌Xylaria arbuscula。南京地區和福建建寧縣內無患子葉斑病的病原菌主要為Diaporthe biconispora、D.eres和D.unshiuensis等間座殼屬真菌。準確的病原菌種類鑒定是準確診斷病害和制定有效控制策略的基礎。以形態學為主的傳統菌物分類體系的分類依據往往不夠客觀、穩定，難以對菌物進行準確歸類，而基于基因序列的分子系統學能在高階元層面上彌補傳統分類方法的缺陷。隨著系統發育學的不斷完善，基于菌物的形態特征、培養特性和多基因位點序列分析的穩健、可靠的綜合分類體系廣泛應用于菌物分類鑒定中。

目前對無患子葉斑病的報道多集中于無患子實生苗林分葉斑病的病原菌鑒定，沒有對無患子優良品種葉斑病病原菌鑒定及其生物學特性的研究。‘粵碩菩提’是我國選育出的第一個受保護的無患子優良無性系新品種，具有速生、豐產、果大等特點，是未來福建建寧縣無患子良種化推廣應用的擬主推品種之一。而福建省內無患子葉斑病普遍發生，可能會威脅該品種的推廣應用，為預防其葉斑病的發展蔓延，需開展相關研究。因此，本研究以福建建寧縣內種植的無患子‘粵碩菩提’為研究材料，采集田間自然發病病葉，通過病原菌組織分離、致病性測定、病原菌形態特征觀察并結合核糖體DNA內部轉錄間隔區（ITS）、核糖體大亞基（LSU）、β-微管蛋白（β-tub）和RNA聚合酶第二大亞基（rpb2）多位點系統發育分析，進行病原菌種類鑒定，并對病原菌的生物學特性進行測定，旨在為無患子‘粵碩菩提’葉斑病發生流行規律的研究及后續科學防控奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試植株材料

無患子‘粵碩菩提’種植于福建建寧縣。

1.1.2供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：取新鮮去皮馬鈴薯200g，切成1cm×1cm左右的小塊，加入1000mL蒸餾水中，煮沸30min，用紗布過濾。稱取葡萄糖20g和瓊脂粉20g，放入濾液中，加熱溶解后補足蒸餾水至1L，pH自然。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）：取新鮮去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加入1000mL蒸餾水中，煮沸30min后用紗布過濾。取濾液，放入蔗糖20g和瓊脂粉20g，加熱至瓊脂溶解，再用蒸餾水定容至1L。

馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養基（PCA）：取新鮮去皮馬鈴薯和胡蘿卜各20g，切成小片，加入蒸餾水煮沸1h，用紗布過濾。取濾液，放入瓊脂粉20g，加熱，待瓊脂溶解后補足蒸餾水至1L。

水瓊脂培養基（WA）：蒸餾水1L，加入20g瓊脂粉，加熱至瓊脂溶解。

V8培養基：800mL蒸餾水中加入V8汁200mL，加入碳酸鈣3g和瓊脂粉20g，充分攪拌混勻后加熱至溶解，調整pH至7.2。

察氏培養基（Czapek）：杭州百思生物技術有限公司成品察氏培養基（硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂和氯化鉀各0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30 g，瓊脂15g，pH6.2）。

黃豆芽汁培養基：取新鮮黃豆芽100g洗凈后加入蒸餾水煮沸30 min。用紗布過濾，濾液中加入瓊脂粉20 g，加熱溶解后加入葡萄糖20g，攪拌溶解后補足蒸餾水至1L。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌的分離與純化

從無患子‘粵碩菩提’發病植株上采集具有典型葉斑病癥狀的新發病葉片，參照方中達的方法利用組織分離法分離病原菌，挑取分離菌株尖端菌絲連續純化3～4次后備用。

1.2.2形態學鑒定

觀察菌落形態（質地、顏色等）、分生孢子器和分生孢子等的特征并測量其大小。

1.2.3致病性測定

水培嫩枝葉孢子懸浮液接種：選取水培健康、新發嫩枝進行孢子懸浮液接種。分離菌株在PDA上培養7d后，置于4℃冰箱誘導產孢，用無菌水洗脫分生孢子，無菌紗布濾去菌絲后，配制成濃度為10⁷個／mL的孢子懸浮液噴霧于水培無患子‘粵碩菩提’嫩枝葉上，接種后外套保鮮袋置于25℃培養箱中進行保濕培養，每菌株接種3個嫩枝，接種3～4d后觀察發病情況。以無菌水噴霧為對照。

離體葉片接種：選取‘粵碩菩提’嫁接苗上健康、無損傷的復葉（含5～6對小葉）進行有傷接種。復葉經流水清洗、75%乙醇表面消毒后，用無菌水沖洗后進行刺傷接種，每小葉4個接種點，對稱分布于主葉脈兩側。純化菌株培養6d后，用直徑6mm無菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，將菌絲面貼于葉片刺傷傷口處，接種后的葉片置于培養箱25℃恒溫、保濕環境下（RH=75%，L∥D=12 h∥12h）培養，以另一復葉接種無菌PDA為對照。3～4d后觀察記錄發病情況，計算發病率。對接種發病葉片進行重分離，完成科赫氏法則驗證。試驗重復3次。

發病率=接種后發病數／接種總數×100%。

1.2.4病原菌的分子生物學鑒定

使用真菌DNA提取試劑盒（Omega，DNA kit D3390）提取DNA。使用引物對ITS1／ITS4、LROR/LR7、bt2a/bt2b和RPB2-5F2／RPB2-7cR進行PCR擴增和測序，測序結果經整理后在NCBI數據庫中進行序列比對。下載相關基因片段序列進行系統發育樹構建，參考序列來源于已發表文獻。序列經MEGA 11處理后，用MrMTgui選取最佳模型，最后基于IrBayes ver.3.2.7軟件進行貝葉斯法系統發育分析。

1.2.5病原菌生物學特性測定

病原菌生物學測定采用單因素試驗設計，各試驗處理條件如下。

培養基對菌絲生長的影響：選取PDA、PSA、PCA、WA、V8、Czapek及黃豆芽汁共7種培養基為供試培養基，將直徑6mm的病原菌菌餅接入不同培養基中央，置于25℃培養箱中暗培養6d，采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復。

溫度對菌絲生長的影響：從供試菌株的菌落邊緣打取直徑6mm菌餅，把菌餅接種在PDA平板中央，置于10、15、20、25、30、35 0C和40℃培養箱中暗培養6d，采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復。

pH對菌絲生長的影響：利用1mol／L的氫氧化鈉和鹽酸溶液分別配制成pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的PDA平板備用。將病原菌接入不同pH的PDA平板，25℃暗培養6d后采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復。

光周期對菌絲生長的影響：設置全光照（L∥D=24h∥0h）、12 h光暗交替（L∥D=12h∥12h）和全黑暗（L∥D=0h∥24h）3種光照條件，將病原菌接入PDA平板中央，每皿接入1塊菌餅，每處理3次重復，將接種好的平板分別置于不同光照條件的培養箱中培養，6d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

菌絲致死溫度測定：設置40、45、50、55、60℃共5個不同溫度，取病原菌菌餅于含1mL無菌水的2mL離心管中，置于各梯度恒溫水浴鍋中水浴10min，水浴結束后取出，待冷卻到室溫后在無菌環境下將菌餅接入PDA平板中央，25℃黑暗條件下培養，觀察菌絲是否生長，以確定菌絲致死溫度，每處理重復3次。

1.3數據分析

數據經Excel 2016和SPSS 26.0軟件處理、分析后，采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗（α=0.05），在Prism 9中作圖。

2結果與分析

2.1田間葉斑病癥狀

2022年-2023年5月初，福建建寧縣‘粵碩菩提’種植區內所有植株均發生葉斑病，但病葉率較低，較實生苗發病輕。該病害在‘粵碩菩提’葉片的各個部位及嫩梢處均能產生病變，主要侵染無患子春、夏季新發嫩梢及嫩枝葉。發病初期嫩枝葉上最先出現紅褐色的近圓形小點（圖1a～c），直徑0.2～1mm，隨后斑點不斷擴大、顏色逐步加深，多個病斑逐漸聯合形成黑褐色圓形、近圓形或不規則病斑，病斑處略微凹陷；發病中期隨著葉片的生長病部外緣產生黃色暈圈，最后成熟葉片上病斑中部脫落或穿孔，穿孔邊緣不整齊（圖1d）。

2.2病原菌分離及致病性測定

田間隨機采集具典型發病癥狀的葉片，采用組織分離法進行病原菌的分離，將分離組織塊接種于PDA平板上，每皿接種5塊，共接種100塊。共分離純化得到菌株125株，其中有85株形態、大小較為一致，初步判斷其為優勢菌株，從中選取3株代表菌株進行離體葉片致病性測定，分別編號為YS2-8、YS2-9、YS2-13。將3株菌的孢子懸浮液噴灑在健康水培嫩枝上，保濕條件下，接種后第4天，嫩葉上出現黑褐色病斑（圖2a～c），與田間自然發病癥狀一致（圖2d）。而接種無菌水的嫩葉未發病（圖2e）。對接種發病葉片進行重分離，分離菌株與接種菌株一致。

經過離體葉片有傷接種，確定3株分離菌株均具有致病性，且致病性強，回接發病率100%。保濕條件下，刺傷接種1d即可見明顯發病癥狀。接種第4天，接種處出現直徑9～12mm黑褐色近圓形病斑（圖3）。而接種無菌PDA的對照葉片未發病（圖3）。依據科赫氏法則，對接種發病葉片進行重分離，重分離得到的菌株與接種菌株相同，而對照葉片未分離出接種菌株。因此，孢子懸浮液接種和離體葉片接種試驗均表明接種菌株YS2-8、YS2-9和YS2-13為‘粵碩菩提’葉斑病病原菌。

2.3形態學鑒定

3個致病菌株在PDA培養基上的培養性狀基本一致，無明顯形態差異（圖4a～c）。供試菌株在PDA培養基上25℃黑暗培養7d，生長良好，平均菌落直徑56 mm。菌落近圓形，邊緣整齊，初為白色菌落。培養7d后，菌落正面白色或淡黃色，菌落背面自中央產生黃色色素，從中央向外逐漸變淺，邊緣菌絲仍為白色。菌落氣生菌絲較多，絨狀（圖4a～c）。低溫（4℃）下培養，3株菌株均可在PDA平板上產生分生孢子器，單生或聚集，分生孢子團為淡黃色液滴，自孔口中溢出（圖4d～f）。分生孢子器具乳突及孔口，呈棕褐色，多為圓球形或扁球形，大小為（87.1～125.7）μm×（108.9～200.1）μm（n=30）（圖4g～i）。分生孢子無隔膜，卵圓形至長橢圓形，大小為（4.3～6.0） μm×（2.3～3.9）μm（n=30）（圖4j～1）。形態特征與汪漢成等、Chen等記錄的亞隔孢殼屬Didymella真菌一致。

2.4分子生物學鑒定

對測序得到的菌株YS2-8、YS2-9和YS2-13的ITS序列進行BLAST比對，據比對結果確定菌株的屬級分類地位為亞隔孢殼屬Didymella。基于ITS、LSU、β-tub和rbp2進行多基因聯合分析并利用貝葉斯法（BI）構建系統發育樹（迭代次數為1800000代，ASDSFlt;0.01，PSRF接近1，ESS大于200）。菌株YS2-8、YS2-9和YS2-13均與標準菌株Didymella segetzcola CGICC 3.17489和Didymella segetzco-la

CGMCC 3.17498聚為一個進化支（圖5），親緣關系最近，且支持率為97%。結合菌株的形態學、分子生物學及菌株致病性測定結果，確定無患子葉斑病病原菌為Didymella segeticola。

2.5致病菌株生物學特性研究

2.5.1培養基對菌落生長的影響

菌株YS2-8、YS2-9和YS2-13在7種供試培養基上均生長良好，不同培養基間菌落直徑差異顯著（Plt;0.05）。除V8培養基外，3株病原菌在相同培養基上的生長情況較為相近。在PCA培養基上生長最快，培養6d后菌落平均直徑最大，分別為（74.67±2.02） （74.00±0.87） （73.50±3.04） mm，WA培養基不利于菌落生長，菌株YS2-8和YS2-13在WA培養基上菌落生長最慢，菌株YS2-9在V8培養基上的菌落直徑最小，但與WA無顯著差異（Pgt;0.05）。菌株YS2-13在PCA、Czapek、PSA這3種培養基上均生長較快，菌落平均直徑無明顯差異（圖6）。

2.5.2培養溫度對菌落生長的影響

菌株在不同培養溫度下菌絲生長存在顯著差異（Plt;0.05）。3株菌株能在10～30℃條件下生長，但在溫度高于35℃時不能生長。20～25℃利于3個代表菌株的生長，各菌株最佳培養溫度略有不同。菌株YS2-8在20℃下生長最好，菌落平均直徑為（68.17±1.89） mm，生長速率顯著高于其他溫度；在25℃下，菌株YS2-9的菌落生長直徑顯著高于其他溫度，為（58.83±1.15） mm。而菌株YS2-13在20～25℃間生長最快。各菌株生長速率隨著溫度改變而變化，呈現出先增后減的趨勢（圖7）。菌株在低溫下（10℃）生長明顯遲緩，溫度等于或高于25℃時，菌株生長速度開始下降，高于35℃時菌株不能生長。

2.5.3pH對菌落生長的影響

菌株在pH為5～9的條件下均生長良好。當pH為7～8時，菌株YS2-8和YS2-9生長最快，2個菌株的生長速率在pH 5～9范圍內變化不明顯，表明2個菌株對pH的適應范圍較廣。菌株YS2-13的最適pH范圍為6～7，菌落平均直徑在（59.00±1.50）～（69.83±1.04） mm間，其中以pH為7時菌落生長最佳，生長速率顯著高于其他pH （Plt;0.05）。當pH為5或8時，菌株YS2-13菌絲的生長明顯受限，生長速率均顯著降低（Plt;0.05），表明菌株YS2-13喜弱酸和中性條件，在過酸或過堿性環境下生長緩慢，其最佳pH范圍為6～7（圖8）。綜合來看，在中性條件下病原菌菌絲的生長速率最快，菌絲生長最適宜的pH為7。

2.5.4光照條件對菌落生長的影響

不同光照條件對菌絲生長有顯著影響（Plt;0.05）。L∥D=24 h∥Oh，L∥D=12h∥12h下，菌株YS2-8和YS2-9生長速度均快于全黑暗環境，且二者之間差異不顯著，表明這2個菌株偏好有光環境，光照利于其生長。L∥D=0h∥24 h，L∥D=12h∥12h下，菌株YS2-13的菌絲生長速率顯著低于全光照環境下的菌絲生長速率（11.30 mm/d，Plt;0.05），說明其偏好連續光照條件（圖9）。因此，不同菌株對光照條件的偏好性略有不同，以全光照條件為3株菌株生長的最佳光照條件。

2.5.5菌絲致死溫度測定

病原菌在40、45、50、55、60℃條件下水浴10 min，當溫度高于55℃時，菌株無法生長，說明病原菌菌絲致死溫度為55℃。

3結論與討論

亞隔孢殼屬Didymella真菌具有世界性分布，能以植物內生菌、病原菌、腐生菌等多種形式存在于多種自然環境中。該屬真菌作為植物病原菌能引起多種植物病害，導致多種經濟植物的根、果實、花及葉片等的枯萎、腐爛、壞死等，影響植物產量和質量，經濟損失嚴重。例如，Tsai等在臺灣東部發現瓜類黑腐球殼菌Didymella bryoniae能侵染佛手瓜，造成莖、葉片和果實組織的壞死，影響其產量和質量。荸薺莖點霉Didymella belLidis能引起茶和獼猴桃葉斑病。Didymella macrostoma致使梨果實腐爛，影響梨的儲藏及運輸。近年來研究發現，亞隔孢殼屬真菌寄主范圍在不斷擴大，國內外研究主要集中在新種、新病害及侵染重要經濟植物方面。亞隔孢殼屬內種間形態差異較小，目前多采用形態學結合多基因位點分子系統學分類。本研究采用4個基因序列（LSU、ITS、β-tub和rpb2）進行分子生物學系統發育分析，并結合致病菌株的分生孢子器、分生孢子等形態學特征的觀察，最終將分離菌株鑒定為D.segeticola，與煙草、花椒葉斑病病原基本一致。相關研究表明，亞隔孢殼屬真菌作為植物病原菌在國內的研究多以侵染茶樹、華重樓、柴胡等經濟作物為主，而該屬真菌侵染林木的相關報道較少，在中國的地理分布及寄主范圍了解較少。本研究發現D.segeti-cola作為引起無患子葉斑病的新病原，在一定程度上補充了亞隔孢殼屬病原真菌在中國的地理分布，并對由該菌引起的木本植物病害診斷具有一定參考作用，有利于后續更進一步的研究。

寄主植物、環境條件和病原這三者共同決定了病害的發生及流行，病原和寄主植物之間的相互作用受環境因素調控。溫度、濕度是影響病害發生的重要因素，Victoria等的結果表明，葉部病害的加重與溫度上升、降雨增加時期相吻合。由D.segeti-cola引起的無患子葉斑病多發于5月-6月，恰逢福建省雨季，此時溫度升高、降雨增加，與此同時‘粵碩菩提’進入展葉期，葉片較為幼嫩，易受病原菌侵染，因此推測，無患子抽梢展葉期與多雨季節同期是福建省無患子葉斑病普遍發生的原因之一。同時，栽培制度也會影響病害的發生，大面積純林種植、粗放管理等制度也是無患子病害頻發的重要原因。此外，生產中調查發現，無患子實生苗葉斑病發生嚴重，病葉率可達95%以上，而無患子‘粵碩菩提’新發葉斑病的病情指數僅為實生苗的40%（數據未發表），呈現出病株率高但發病程度輕的特點，表明無患子優良無性系的抗病性顯著高于實生苗。因此，建議通過優化調整無患子人工林的林分結構，加強營林管理等建立科學的經營制度，同時，應加大無患子優良新品種‘粵碩菩提’的推廣應用，以推動無患子林分可持續經營。

除了外界環境條件、栽培管理等的影響外，病原菌自身的生物學特性也能影響病害的發生與流行。本研究基于病原菌生物學特性測定發現，病原菌D.segeticola生長適宜溫度范圍是20～25℃，在pH 5～9內均生長良好，同時光照條件利于其生長，菌株致死溫度為55℃，表明該病原菌耐熱能力較強，能在夏季高溫環境下持續存活，符合田間能多次侵染的特點。本研究結果與汪漢成等的研究結果較為一致，但在菌株致死溫度上略有差異，汪漢成等的研究結果表明，煙草葉斑病致病菌D.segeti-cola菌株YB2121和YB2221的致死溫度為47℃，菌株YBZ111的致死溫度為48℃，推測同一種病原菌的生物學特性可能會因菌株、寄主植物種類及其分布地區的不同而不同。

本研究將福建建寧縣的無患子‘粵碩菩提’新發葉斑病病原鑒定為D.segeticola，3個代表菌株具有相似的環境適應能力，均適宜在溫度20～25℃、pH7、連續光照條件下的PCA培養基上生長，菌絲致死溫度均為55℃。研究結果拓寬了當前對無患子葉斑病病原的認知，可為深入研究無患子‘粵碩菩提’葉斑病的流行規律及制訂防控策略奠定基礎，加速無患子‘粵碩菩提’良種培育及推廣應用進程。